生物化学蛋白质(实用)课件.ppt

1、蛋白质功能蛋白质功能1.催化功能：催化功能：蛋白酶蛋白酶2.结构成分：结构成分：胶原蛋白、胶原蛋白、-角蛋白角蛋白l调节功能：调节功能：激素、细胞因子激素、细胞因子l运输与储存功能：运输与储存功能：血红蛋白血红蛋白l运动功能：运动功能：肌球蛋白肌球蛋白l免疫功能：免疫功能：抗体抗体l信号传递功能：信号传递功能：受体蛋白受体蛋白蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质 1.蛋白质的两性解离和等电点蛋白质的两性解离和等电点(pI)2.蛋白质电泳现象蛋白质电泳现象3.紫外吸收（紫外吸收（280 nm）4.蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质5.蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用 6.蛋白质的变性蛋白质的变性 可逆

2、沉淀（非变性沉淀）可逆沉淀（非变性沉淀）不可逆沉淀（变性沉淀）不可逆沉淀（变性沉淀）例：柿石症例：柿石症等电点沉淀等电点沉淀盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法加热、紫外加热、紫外强酸或强碱强酸或强碱重金属盐重金属盐生物碱生物碱蛋白质变性：蛋白质受到某些理化因素的影响，其空间结蛋白质变性：蛋白质受到某些理化因素的影响，其空间结构发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或构发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变。丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变。蛋白质变性（蛋白质变性（denaturation）变性的现象：变性的现象：l生物活性的丧失生物活

3、性的丧失l物理化学性质的改变（溶解度、粘度、扩散系数、旋光度）物理化学性质的改变（溶解度、粘度、扩散系数、旋光度）l生物化学性质的改变（易于被蛋白酶水解）生物化学性质的改变（易于被蛋白酶水解）l结构的变化（侧链的暴露）结构的变化（侧链的暴露）Q:Q:蛋白质变性后为什么容易凝聚沉降？蛋白质变性后为什么容易凝聚沉降？蛋白质变性沉淀与在蛋白质变性沉淀与在pIpI处沉淀有何不同？处沉淀有何不同？蛋白质的变性与复性蛋白质的变性与复性（renaturation）变性剂：变性剂：尿素、尿素、盐酸胍、盐酸胍、去污剂（十二烷基硫酸钠）去污剂（十二烷基硫酸钠）核糖核酸酶核糖核酸酶A A的变性和复性的变性和复性变性

4、剂：尿素或盐酸胍变性剂：尿素或盐酸胍巯基乙醇巯基乙醇RNaseA:124AA,4个个S-SThe Nobel Prize in Chemistry 1972for his work on ribonuclease,especially concerning the connection between the amino acid sequence and the biologically active conformation Christian B.Anfinsen克里斯蒂安克里斯蒂安伯默尔伯默尔安芬森安芬森1/2 of the prize National Institutes of H

5、ealth Bethesda,MD,USA 1916-1995 核糖核酸酶核糖核酸酶A A的变性和复性的变性和复性l（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）l由两组序列推出整条肽链lEdman氨基酸顺序分析法lC A D Bl丝心蛋白（fibroin）l蛋白质的二级结构 -折叠lCambridge,United Kingdoml蛋白质折叠和结构预测l任何一个亚基结合氧分子后，会增加其它亚基与氧结合的能力l血红蛋白与肌红蛋白的氧合曲线l对血液的pH起缓冲作用。l研究蛋白质折叠与错误折叠-阐明致病机制l6 蛋白质的分离和纯化lPro、Gly

6、常在-转角序列中存在lFe()2.4 蛋白质的结构蛋白质的结构（Structure of Protein）l一级结构一级结构l二级结构（二级结构（-螺旋、螺旋、-折叠、折叠、-转角）转角）l超二级结构和结构域超二级结构和结构域l三级结构三级结构l四级结构四级结构Assembled subunitsAmino acids-HelixPolypeptide chain蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构 例：血红蛋白例：血红蛋白 蛋白质构象：蛋白质具有特定的空间结构。蛋白质构象：蛋白质具有特定的空间结构。蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 （Primary Structure）多肽链中氨基酸残基排列序列

7、多肽链中氨基酸残基排列序列 lk i t c h e n 厨房，炊具厨房，炊具l t h i c k e n 变厚、变粗变厚、变粗镰刀形细胞贫血病（血红蛋白分子病）镰刀形细胞贫血病（血红蛋白分子病）(Sickle-cell Hemoglobin,HbS)HbAHbS1945年年Pauling实验：电泳时都向正极移动，实验：电泳时都向正极移动，HbS比比HbA稍慢稍慢 1904年发现年发现血红蛋白血红蛋白:C3032H4816O812N780S8Fe4分子量分子量:67000镰刀形细胞贫血症的红细胞镰刀形细胞贫血症的红细胞 20092009年最佳医学摄影作品电子扫描显微照片年最佳医学摄影作品电子

8、扫描显微照片 红血球粘在粘性网上，形红血球粘在粘性网上，形成血液凝块。位于中间的是成血液凝块。位于中间的是白血球。白血球。普尔基涅神经元普尔基涅神经元 令人惊奇的人体细胞令人惊奇的人体细胞 耳毛细胞耳毛细胞 从视神经中伸出的血管从视神经中伸出的血管 舌头上的味蕾舌头上的味蕾 牙釉质牙釉质 肺气泡肺气泡 肺癌细胞肺癌细胞 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 (Secondary Structure)肽链的主链在空间的排列肽链的主链在空间的排列只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成氢键只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成氢键 丙丙蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 1.-螺旋（螺旋（-helix）2.-

9、折叠折叠（-sheet）3.-转角（转角（-turn）无规则卷曲无规则卷曲蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 -螺旋螺旋 lRight-handl每圈螺旋每圈螺旋3.6个氨基酸残基；个氨基酸残基；l螺距：螺距：0.54 nm；l肽键上的肽键上的C=O（第（第n个残基）氧与肽键上个残基）氧与肽键上后面第四个后面第四个N-H（n+4残基）氢形成链内残基）氢形成链内氢键，氢键，l氢键取向与中心轴平行，氢键取向与中心轴平行，l羰基都指向羰基都指向C-端。端。（C-端后端后3个个C=O和和N-端前端前3个个N-H不能形成不能形成-螺旋的氢键。）螺旋的氢键。）1951年年 Linus Pauling Rob

10、ert CoreyN-端端C-端端侧链对侧链对-螺旋的影响螺旋的影响 l不稳定因素：不稳定因素：-相邻侧链为正电荷或负电荷的排斥作用；相邻侧链为正电荷或负电荷的排斥作用；-相邻侧链空间位阻大，对螺旋起阻碍作用；相邻侧链空间位阻大，对螺旋起阻碍作用；-Pro：N-C键是无法旋转的，螺旋将中断而形成扭键是无法旋转的，螺旋将中断而形成扭 结；还有结；还有N上无上无H，无法形成氢键。，无法形成氢键。-Gly：侧链过于小而导致构象太：侧链过于小而导致构象太“柔顺柔顺”。l稳定因素：稳定因素：-相隔相隔3个残基的个残基的2个侧链（个侧链（n,n+5侧链）上有正电荷和侧链）上有正电荷和负电荷将形成离子键结合

11、。负电荷将形成离子键结合。-相隔相隔3个残基的个残基的2个侧链（个侧链（n,n+5侧链侧链)都是疏水侧链将都是疏水侧链将疏水连接（疏水作用）疏水连接（疏水作用）蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 -螺旋螺旋 N-端端C-端端莱纳斯莱纳斯卡尔卡尔鲍林鲍林Linus Carl Pauling(1901-1994)The Nobel Prize in Chemistry 1954化学键研究化学键研究The Nobel Peace Prize 1962反对核弹在地面测试反对核弹在地面测试美国著名物理化学、量子化学的先驱之一美国著名物理化学、量子化学的先驱之一2020世纪对化学科学影响最大的人之一世纪对化

12、学科学影响最大的人之一分子生物学的奠基人之一分子生物学的奠基人之一化学键的本质化学键的本质电负性电负性、共振论共振论、价键理论价键理论、杂化轨道杂化轨道、蛋白质蛋白质折叠折叠等概念和理论等概念和理论1945年年8月月6日原子弹（男孩）爆炸后，浓烟笼罩广岛上空。日原子弹（男孩）爆炸后，浓烟笼罩广岛上空。长崎原子弹长崎原子弹-胖子胖子1945年年7月月16日第一颗原子弹在美国新墨西哥州阿拉默多尔空日第一颗原子弹在美国新墨西哥州阿拉默多尔空军基地的沙漠地区爆炸成功。军基地的沙漠地区爆炸成功。长崎长崎和平公园和平公园广岛广岛原爆栋墓原爆栋墓8月月9日长崎原子弹爆炸，日长崎原子弹爆炸，死亡死亡8万人万人

13、原子弹原子弹-瘦子瘦子蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 -螺旋举例螺旋举例 -角蛋白（角蛋白（-keratin）哺乳动物皮肤以及皮肤的衍生物哺乳动物皮肤以及皮肤的衍生物如：毛发、鳞、羽、甲、角、爪如：毛发、鳞、羽、甲、角、爪等中的主要成分。等中的主要成分。角质层角质层巨原纤维巨原纤维微原纤维微原纤维毛发单元毛发单元-角蛋白是纤维状蛋白，具有不溶性角蛋白是纤维状蛋白，具有不溶性毛发的毛发的-角蛋白结构角蛋白结构l微纤维（微纤维（microfibril）9个原纤维围绕其它个原纤维围绕其它2个原纤维排列形成微纤维个原纤维排列形成微纤维l巨原纤维（巨原纤维（macrofibril）成百根微纤维组装成巨

14、原纤维成百根微纤维组装成巨原纤维l原纤维（原纤维（protofibril）3个右手个右手-螺旋组成一个左手超螺旋螺旋组成一个左手超螺旋l原纤维和巨原纤维都是通过二硫键的形成而使相邻的肽链相连原纤维和巨原纤维都是通过二硫键的形成而使相邻的肽链相连 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 -螺旋举例螺旋举例 l-角蛋白富含角蛋白富含Cys残基，残基，-螺旋间以螺旋间以S-S连接增加稳定性。连接增加稳定性。l硬角蛋白：富含二硫键如毛发、指甲、角等。硬角蛋白：富含二硫键如毛发、指甲、角等。l软角蛋白：含有少量二硫键如皮肤、愈伤组织等。软角蛋白：含有少量二硫键如皮肤、愈伤组织等。蛋白质的二级结构蛋白质的二级结

15、构 -螺旋举例螺旋举例 烫发烫发一项生化工程一项生化工程3条左手螺旋条左手螺旋-肽链肽链 一圈螺旋含一圈螺旋含3个氨基酸残基个氨基酸残基形成右手超螺旋分子，形成右手超螺旋分子，蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 -螺旋举例螺旋举例 胶原蛋白（胶原蛋白（collagen）动物体内如骨、齿、腱、软骨以及皮肤和血管纤维等结缔组织的蛋白成分。动物体内如骨、齿、腱、软骨以及皮肤和血管纤维等结缔组织的蛋白成分。重复序列：重复序列：-Gly-X-Pro(HyPro)-右手超螺旋 中心轴内促使形成 肽链含有含有33%Gly、13%Pro、10%羟脯氨酸和羟脯氨酸和5-羟赖氨酸羟赖氨酸 蛋白质的二级结构蛋白质的二

16、级结构 -螺旋举例螺旋举例 胶原蛋白（胶原蛋白（collagen）Pro Lys 羟化酶羟化酶 HyPro HyLys 胶原蛋白含有胶原蛋白含有10%羟脯氨酸和羟脯氨酸和5-羟赖氨酸羟赖氨酸,增加链间氢键的增加链间氢键的形成形成,稳定胶原蛋白三螺旋。稳定胶原蛋白三螺旋。维生素维生素C 坏血病坏血病 两条或多条完全伸展的两条或多条完全伸展的 肽链平行排列肽链平行排列主链呈锯齿状折叠主链呈锯齿状折叠一条肽链或相邻肽链间形成氢键一条肽链或相邻肽链间形成氢键 肽键参与了链间氢键肽键参与了链间氢键 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 -折叠折叠 -折叠的折叠的两种类型：两种类型：平行式平行式 反平行式反平

17、行式 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 -折叠折叠 蛋白质中蛋白质中-折叠的折叠的混合结构混合结构 反平行式反平行式 平行式平行式 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 -折叠折叠 丝心蛋白（丝心蛋白（fibroin）蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 -折叠举例折叠举例 l丝心蛋白：如蚕丝、蜘蛛丝丝心蛋白：如蚕丝、蜘蛛丝 是一种是一种 -角蛋白角蛋白l典型的反平行式典型的反平行式-折叠片折叠片重复序列：重复序列：-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-l具有很大的抗张强度具有很大的抗张强度 l具有柔软性具有柔软性 2012年年2月月2日日 Nature 杂志封面故事杂志封面故事:蜘蛛丝的

18、非线性应力反应蜘蛛丝的非线性应力反应 Nature482,7276 蜘蛛丝是自然界的蜘蛛丝是自然界的“超级材料超级材料”之一：之一：1.机械性能包括高延展性机械性能包括高延展性2.可以与钢相比的高强度。可以与钢相比的高强度。3.研究发现，蜘蛛丝的非线性应力反应（在低应力时研究发现，蜘蛛丝的非线性应力反应（在低应力时是线性的，在应力增加时会突然变软，然后在断裂是线性的，在应力增加时会突然变软，然后在断裂前又变硬）也是关键的。前又变硬）也是关键的。4.这种行为使得蜘蛛网在受到较小的、分散的这种行为使得蜘蛛网在受到较小的、分散的负荷（如风所施加的负荷）时能够保持其形状。但负荷（如风所施加的负荷）时能

19、够保持其形状。但在强局部变形过程中（如下落的碎片所造成的变在强局部变形过程中（如下落的碎片所造成的变形），蜘蛛丝的几何重排和非线性应力反应会综合形），蜘蛛丝的几何重排和非线性应力反应会综合发挥作用，来限制撞击点附近区域所受到的损坏，发挥作用，来限制撞击点附近区域所受到的损坏，从而使蜘蛛网仍能发挥功能。从而使蜘蛛网仍能发挥功能。l 羊毛衫等羊毛制品在热水中变长羊毛衫等羊毛制品在热水中变长,洗后在干燥器洗后在干燥器内干燥，则收缩，但丝制品进行同样处理，却不内干燥，则收缩，但丝制品进行同样处理，却不收缩，请解释这两种现象。收缩，请解释这两种现象。l 问问 题？题？Pro、Gly常在-转角序列中存在

20、存在于球状蛋白分子中存在于球状蛋白分子中 转角部分：转角部分：由四个氨基酸残基组成由四个氨基酸残基组成;第一个残基的第一个残基的-C=O 和和第四个残基的第四个残基的-N-H之间形成氢键之间形成氢键-bend：-弯曲弯曲-hairpin：发夹结构：发夹结构 Four-residue 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 -转角转角 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 -转角转角 -转角的两种类型转角的两种类型 类型类型 类型类型 多为多为Gly 1234常见常见Pro 1234 又称自由回转，是指没有一定规律的松散肽链结构。酶的功能部位又称自由回转，是指没有一定规律的松散肽链结构。酶的功能部位常常处

21、于这种构象区域，常常处于这种构象区域，是形成蛋白质三级结构所必需的。是形成蛋白质三级结构所必需的。无规卷曲常出现在：无规卷曲常出现在：-螺旋与螺旋与-螺旋、螺旋、-螺旋与螺旋与-折叠、折叠、-折叠与折叠与-折叠之间。折叠之间。蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 -无规则卷曲无规则卷曲 （non-regular coil）-螺旋螺旋 -折叠折叠 -转角转角 无规卷曲无规卷曲 RNase的分子结构的分子结构 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 稳定二级构造的力稳定二级构造的力氢键氢键 -螺旋螺旋 -折叠折叠 -转角转角 蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构 （Tertiary Structure）在二级结

22、构基础上，肽链在空间进一步盘绕、折叠形成的在二级结构基础上，肽链在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象的特征三维结构，是有特定构形的活包括主链和侧链构象的特征三维结构，是有特定构形的活性分子。性分子。三级结构的组成力量三级结构的组成力量l二硫键二硫键 Disulfide bond 共价键共价键l氢键氢键 Hydrogen bondl疏水键疏水键 Hydrophobic interactionl范德华力范德华力 Van der Waals interactionl离子键离子键 Ionic interaction 非共价键非共价键（次级键）（次级键）例例:肌红蛋白（肌红蛋白（Myoglob

23、in，Mb）NAHC一条肽链：一条肽链：153个氨基酸残基个氨基酸残基一个血红素辅基一个血红素辅基MW：16 700珠蛋白（珠蛋白（globin）：脱辅基的肌红蛋白）：脱辅基的肌红蛋白 与血红蛋白的亚基（与血红蛋白的亚基（-珠蛋白链和珠蛋白链和-珠蛋珠蛋白链）在氨基酸序列上具有明显的同源白链）在氨基酸序列上具有明显的同源性，构象及功能也十分相似。性，构象及功能也十分相似。蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构1959年第一个用年第一个用X-射线晶体分析法测定了抹香鲸肌红蛋白的晶体结构。射线晶体分析法测定了抹香鲸肌红蛋白的晶体结构。抹香鲸肌红蛋白的三级结构抹香鲸肌红蛋白的三级结构 蛋白质的三级结构蛋白

24、质的三级结构 -举例举例1.Val、Leu、Ile、Phe、Met：几乎被埋在分子内部；：几乎被埋在分子内部；2.亲水侧链的氨基酸残基：分布在分子外表面上，使肌红蛋白成亲水侧链的氨基酸残基：分布在分子外表面上，使肌红蛋白成为可溶性蛋白质；为可溶性蛋白质；3.Ser、Thr、Tyr、Pro、Gly、Cys、Ala：一些介于亲水和疏：一些介于亲水和疏水之间的残基，在分子的内部和外表面都可以见到。水之间的残基，在分子的内部和外表面都可以见到。8个螺旋片段（个螺旋片段（AH），分为两层，），分为两层，分子内部只有一个能容纳分子内部只有一个能容纳4个水分子的空间个水分子的空间NAHC四级结构：两条或两条

25、以上具有三级结构的多肽链聚合而成、四级结构：两条或两条以上具有三级结构的多肽链聚合而成、有特定三维结构的蛋白质构象。每条多肽链又称为亚基。有特定三维结构的蛋白质构象。每条多肽链又称为亚基。蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构 （Quaternary Structure）例：血红蛋白由四条多肽链形成的一种寡聚例：血红蛋白由四条多肽链形成的一种寡聚蛋白质。这四条链主要通过非共价键相互蛋白质。这四条链主要通过非共价键相互作用缔合在一起。血红蛋白分子上有四个作用缔合在一起。血红蛋白分子上有四个氧的结合部位，因为每条链上含有一个血氧的结合部位，因为每条链上含有一个血红素辅基。红素辅基。蛋白质的四级结构蛋白质

26、的四级结构 一级结构（氨基酸序列）一级结构（氨基酸序列）二级结构（二级结构（-helix,-sheet）三级结构三级结构（monomer）四级结构四级结构（dimer）（trimer）（tetramer）调节调节 顺序顺序 构形构形 活性活性 The Nobel Prize in Chemistry 1962MRC Laboratory of Molecular BiologyCambridge,United Kingdom b.1914 b.1917d.2002 d.1997 for their studies of the structures of globular proteinsMa

27、x Perutz（左）（左）with his model ofMyoglobin（肌红蛋白（肌红蛋白 Mb）John Kendrew（右）（右）with his model of Haemoglobin（血红蛋白（血红蛋白 Hb）Left to right:Maurice Wilkins,John Steinbeck,John Kendrew,Max Perutz,Francis Crick and Jim Watson After the Nobel Ceremony in Stockholm in December 1962 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 1.测定蛋白质分子中多

28、肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目2.拆分蛋白质分子的多肽链拆分蛋白质分子的多肽链3.分析每条肽链氨基酸的组成分析每条肽链氨基酸的组成4.选择性降解多肽链并测定多肽链的氨基酸序列选择性降解多肽链并测定多肽链的氨基酸序列5.确定确定N、C末端氨基酸残基末端氨基酸残基6.重建完整肽链序列重建完整肽链序列7.确定二硫键位置确定二硫键位置 蛋白质相对分子质量已知时，根据末端氨基酸残蛋白质相对分子质量已知时，根据末端氨基酸残基的摩尔数和蛋白质的摩尔数确定肽链数目。基的摩尔数和蛋白质的摩尔数确定肽链数目。1.测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的

29、测定 2.多肽链的拆分多肽链的拆分 非共价键：可用非共价键：可用8 mol/L尿素尿素6 mol/L盐酸胍处理盐酸胍处理二硫键：过甲酸和巯基乙醇二硫键：过甲酸和巯基乙醇3.分析多肽链的氨基酸组成分析多肽链的氨基酸组成l酸水解酸水解l碱水解碱水解l氨基酸分析仪氨基酸分析仪蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 p化学法：化学法：溴化氰水解法（溴化氰水解法（CNBr法）法）p酶降解法：酶降解法：利用某些蛋白水解酶，进行选择性降解。利用某些蛋白水解酶，进行选择性降解。4.选择性降解多肽链并测定其氨基酸顺序选择性降解多肽链并测定其氨基酸顺序蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 酶降解法酶降解法蛋

30、白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 酶酶水解位置水解位置存在状况存在状况胰蛋白酶胰蛋白酶Rm=Lys,Arg，RnPro消化系统消化系统胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶Rm=Tyr,Phe,Trp,Leu,Ile,Val，RnPro消化系统消化系统胃蛋白酶胃蛋白酶Rm=Phe,Leu等等胃胃凝血酶凝血酶Rm=Arg血液血液羧肽酶羧肽酶Rm=C-端氨基酸端氨基酸消化系统消化系统H-Trp-Pro-Arg-Gly-Tyr-Gln-Lys-Met-Phe-Ser-OH蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 l 胰蛋白酶降解胰蛋白酶降解l 胰凝乳蛋白酶降解胰凝乳蛋白酶降解5.多肽链末端氨基酸测定多肽链末

31、端氨基酸测定鉴定鉴定N-端氨基酸：端氨基酸：l二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）法）法 又称又称Sanger法：法：DNP-AAl丹磺酰氯法（丹磺酰氯法（DNS）法：）法：DNS-AAl苯异硫氰酸酯（苯异硫氰酸酯（PITC）法：）法：PTH-AA Edman氨基酸顺序分析法氨基酸顺序分析法(多肽顺序自动分析仪多肽顺序自动分析仪)鉴定鉴定C-端氨基酸：端氨基酸：l肼解法肼解法l羧肽酶羧肽酶蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 PITC苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 Edman氨基酸顺序分析法氨基酸顺序分析法PITCPTH-AA1PTH-AA2蛋白质一级结构的

32、测定蛋白质一级结构的测定 Edman氨基酸顺序分析法氨基酸顺序分析法6.重建完整肽链序列重建完整肽链序列蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 使用使用2种不同蛋白水解酶种不同蛋白水解酶每片段每片段分别测序分别测序由两组序列推出整条肽链由两组序列推出整条肽链检定氨基酸种类检定氨基酸种类依序排出氨基酸序列依序排出氨基酸序列被测肽链被测肽链采用胃蛋白酶水解特点：采用胃蛋白酶水解特点：专一性低、切点多；专一性低、切点多；pH=2，二硫键稳定；，二硫键稳定；蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 7.确定二硫键位置确定二硫键位置 胃蛋白酶胃蛋白酶 SSSS1.混合肽段滤纸中央，混合肽段滤纸中央，进

33、行第一向电泳；进行第一向电泳；2.过甲酸蒸汽，断裂二硫键；过甲酸蒸汽，断裂二硫键；3.滤纸旋转滤纸旋转90度，第二向电泳。度，第二向电泳。对角线电泳对角线电泳 1.下列试剂和酶常用于蛋白质化学的研究中下列试剂和酶常用于蛋白质化学的研究中:CNBr，异硫氰酸苯酯，丹黄酰氯，尿素，异硫氰酸苯酯，丹黄酰氯，尿素，-巯基乙醇，茚三酮，过甲酸巯基乙醇，茚三酮，过甲酸，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶其中哪一个最适合完成以下各项任务其中哪一个最适合完成以下各项任务?(a)测定小肽的氨基酸序列测定小肽的氨基酸序列.(b)鉴定肽的氨基末端残基鉴定肽的氨基末端残基.(c)不含二硫键的蛋白质的可逆变

34、性不含二硫键的蛋白质的可逆变性.若有二硫键存在时还需加什么试剂若有二硫键存在时还需加什么试剂?(d)在芳香族氨基酸残基羧基侧水解肽键在芳香族氨基酸残基羧基侧水解肽键.(e)在蛋氨酸残基羧基侧水解肽键在蛋氨酸残基羧基侧水解肽键.(f)在赖氨酸和精氨酸残基侧水解肽键在赖氨酸和精氨酸残基侧水解肽键.(a)异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯 (b)丹黄酰氯丹黄酰氯 (c)尿素尿素;-巯基乙醇巯基乙醇 (d)胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 (e)CNBr (f)胰蛋白酶胰蛋白酶 问题？问题？2.双缩脲反应是多肽和氨基酸所特有的反应。双缩脲反应是多肽和氨基酸所特有的反应。错错3.预测肽：预测肽：Lys-Gly-Ala-G

35、lu 在在pH为为6.0时的电泳迁移方向（时的电泳迁移方向（移向阳极、移向阴极或不移动）？移向阳极、移向阴极或不移动）？肽中保留有肽中保留有N-端端Lys 的的-NH3+和和C-端端Glu的的-COO-，pH=6时，时，Lys的侧链带正电荷，的侧链带正电荷，Glu侧链带负电荷，净电侧链带负电荷，净电荷为荷为0，故该肽静止不移动。，故该肽静止不移动。4.蛋白质可逆沉淀有几种？蛋白质可逆沉淀有几种？5.请举出常用的四种测定蛋白质含量的方法。请举出常用的四种测定蛋白质含量的方法。等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法凯氏定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、考马斯亮蓝法、凯

36、氏定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、考马斯亮蓝法、Folin-酚试剂法酚试剂法6.为什么在为什么在a-螺旋片段中很少发现螺旋片段中很少发现Pro?Pro的的a-氨基为亚氨基，没有多余的酰胺氢原子来形成氢氨基为亚氨基，没有多余的酰胺氢原子来形成氢键以稳定键以稳定a-螺旋，螺旋，7.下列两个多肽最可能形成的规则、重复结构分别是什么？下列两个多肽最可能形成的规则、重复结构分别是什么？a)(Gly-Ala-Gly-Thr)b）(Glu-Ala-Leu-His)a)中侧链较小，中侧链较小，Gly是是a-螺旋的破坏者，故该肽易形螺旋的破坏者，故该肽易形成成-折叠构象折叠构象.b)侧链较大，侧链较大，-折叠结构

37、不稳定，是螺旋结构的稳折叠结构不稳定，是螺旋结构的稳定者。定者。1.用用BrCN处理含等量的处理含等量的Met,Phe,Asp,Ser,Thr的多肽，释放出肽和单一的多肽，释放出肽和单一的高丝氨酸。原的高丝氨酸。原5肽用胰凝乳蛋白酶处理的两个碎片，一个比另一肽用胰凝乳蛋白酶处理的两个碎片，一个比另一个酸性强，酸性碎片有甲硫氨酸。原来肽用羧肽酶个酸性强，酸性碎片有甲硫氨酸。原来肽用羧肽酶A处理，迅速放处理，迅速放出出Ser，随后放在，随后放在Thr。推断该。推断该5肽的氨基酸排列顺序。肽的氨基酸排列顺序。lMet-Asp-Phe-Thr-Ser2.水解肽水解肽A时，发现其含有等量的时，发现其含有

38、等量的Arg,Val,Tyr,Glu,Lys,Ala和和Gly七种氨七种氨基酸基酸1)用胰蛋白酶水解肽用胰蛋白酶水解肽A时，得到如下物质：时，得到如下物质：Arg，Ala-Lys和含有和含有Glu,Gly,Tyr,Val的肽的肽B：用胰凝乳蛋白酶水解肽：用胰凝乳蛋白酶水解肽B，产生两个二肽：，产生两个二肽：Val-Tyr和和Glu,Gly2)肽肽A用羧肽酶短时间处理，产生游离的用羧肽酶短时间处理，产生游离的Glu是第一个可鉴定的氨基酸是第一个可鉴定的氨基酸3)肽肽A用用DNFB法分析法分析N端氨基酸，产生出端氨基酸，产生出DNP-Ala，问该肽问该肽A的氨基酸排列顺序是怎样的的氨基酸排列顺序是

39、怎样的?lAla-Lys-Arg-Val-Tyr-Gly-Glu蛋白质折叠和结构预测蛋白质折叠和结构预测 结构决定功能，仅仅知道基因组序列并结构决定功能，仅仅知道基因组序列并不能使我们充分了解蛋白质的功能。不能使我们充分了解蛋白质的功能。蛋白质可凭借相互作用在细胞环境蛋白质可凭借相互作用在细胞环境(特定的酸碱特定的酸碱度、温度等度、温度等)下自己组装自己，这种自我组装的过程下自己组装自己，这种自我组装的过程被称为蛋白质折叠。被称为蛋白质折叠。l分子伴侣分子伴侣l折叠酶折叠酶错误的蛋白质折叠引起的疾病错误的蛋白质折叠引起的疾病l疯牛病疯牛病(BSE)，l克克雅氏病雅氏病(CJD)l肌萎缩性脊髓侧

40、索硬化症肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)l阿兹海默症阿兹海默症(Alzheimers，AD),又称老人痴呆症又称老人痴呆症l帕金森氏症帕金森氏症(Parkinsons),又称又称震颤麻痹震颤麻痹细胞内的重要蛋白发生突变，细胞内的重要蛋白发生突变，导致蛋白质聚沉或错误折叠。导致蛋白质聚沉或错误折叠。研究蛋白质折叠与错误折叠研究蛋白质折叠与错误折叠-阐明致病机制阐明致病机制蛋白质折叠和结构预测蛋白质折叠和结构预测 牛脑海绵状病牛脑海绵状病（Bovine spongiform encephalopathy(BSE)）俗称俗称“疯牛病疯牛病”(cow mad disease)病脑细胞切片病脑细胞切片蛋

41、白质折叠和结构预测蛋白质折叠和结构预测 由朊病毒蛋白（由朊病毒蛋白（PrP）引起）引起,又称蛋白质侵染因子朊病毒。是一类又称蛋白质侵染因子朊病毒。是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子无免疫性疏水蛋白质。能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子无免疫性疏水蛋白质。The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1997Stanley B.Prusiner University of California School of Medicine b.1942“for his discovery of Prions-a new biological princip

42、le of infection”斯坦利斯坦利普鲁辛纳普鲁辛纳朊病毒蛋白（朊病毒蛋白（PrP）是一种具有感染性和自是一种具有感染性和自我复制能力的蛋白因子我复制能力的蛋白因子库鲁病（库鲁病（Kuru）克克雅氏病（雅氏病（CJD）吉斯特曼综合症（吉斯特曼综合症（GSS）致死性家庭性失眠症（致死性家庭性失眠症（FFI）小脑小脑大脑皮层大脑皮层丘脑丘脑脑干脑干1.肌红蛋白肌红蛋白2.血红蛋白血红蛋白3.抗体抗体4.蛋白质的序列同源性与进化关系蛋白质的序列同源性与进化关系2.5 蛋白质功能蛋白质功能 肌红蛋白（肌红蛋白（myoglobin，Mb)2.5 蛋白质功能蛋白质功能 肌红蛋白只能贮存氧肌红蛋白只

43、能贮存氧,使氧在肌肉内扩散使氧在肌肉内扩散.肌红蛋白（肌红蛋白（myoglobin，Mb)2.5 蛋白质功能蛋白质功能 一条多肽链（珠蛋白，一条多肽链（珠蛋白，153 AA）一个血红素辅基一个血红素辅基 MW：16700l8个右手个右手-螺旋片段（螺旋片段（AH），），l最长最长-螺旋螺旋23个个AA，最短的，最短的7个个AA，l螺旋以外是不规则卷曲（螺旋以外是不规则卷曲（ABFG，GH）lPro导致导致4处转折，处转折，Ser,Thr,Asn,Ile侧链障碍侧链障碍也导致转折也导致转折l分子紧密，内部只有容纳分子紧密，内部只有容纳4个水分子的空间个水分子的空间 血红素辅基血红素辅基近侧组氨酸

44、近侧组氨酸第第93位（或位（或F8）远侧组氨酸远侧组氨酸第第64位（或位（或E7）卟啉环与卟啉环与Fe2+肌红蛋白中的辅基血红素肌红蛋白中的辅基血红素 2.5 蛋白质功能蛋白质功能His64His93肌红蛋白中的辅基血红素肌红蛋白中的辅基血红素 2.5 蛋白质功能蛋白质功能 肌红蛋白（肌红蛋白（myoglobin，Mb)2.5 蛋白质功能蛋白质功能 l O2 和和 Mb 的结合是一个可逆的过程，称为氧合作用。的结合是一个可逆的过程，称为氧合作用。l 无氧的肌红蛋白称为脱氧肌红蛋白，载氧的称为氧合肌红蛋白无氧的肌红蛋白称为脱氧肌红蛋白，载氧的称为氧合肌红蛋白MbMbO2O2+Y=K+(pO2)p

45、O2Y：氧结合部位结合氧的分数（氧饱和度）：氧结合部位结合氧的分数（氧饱和度）pO2：O2的分压，也叫氧压力浓度的分压，也叫氧压力浓度 K：反应的解离常数：反应的解离常数肌红蛋白（肌红蛋白（myoglobin，Mb)2.5 蛋白质功能蛋白质功能 肌红蛋白的氧合曲线肌红蛋白的氧合曲线 P50=KP50=2.8 Torr 肌红蛋白达到半饱合肌红蛋白达到半饱合状态时的氧分压状态时的氧分压 动脉血：动脉血：100 Torr静脉血：静脉血：30 Torr 肌红蛋白有效地将氧气从毛细血管转移到肌肉细胞中。肌红蛋白有效地将氧气从毛细血管转移到肌肉细胞中。血红蛋白血红蛋白（Hemoglobin Hb）2.5

46、蛋白质功能蛋白质功能 l血红蛋白的一级结构血红蛋白的一级结构 2条条 -链、链、2条条 -链链 四聚体：四聚体：2 2l血红素血红素 Fe()l血红蛋白的功能血红蛋白的功能 运输运输O2和和CO2;对血液的对血液的pH起缓冲作用。起缓冲作用。脊椎动物红细胞内的呼吸蛋白脊椎动物红细胞内的呼吸蛋白,转运氧转运氧 血红蛋白血红蛋白（Hemoglobin Hb）2.5 蛋白质功能蛋白质功能 肌红蛋白与血红蛋白的亚基（肌红蛋白与血红蛋白的亚基（-珠蛋白链和珠蛋白链和-珠蛋白链）珠蛋白链）在氨基酸序列上具有明显的同源性，构象及功能也十分相似。在氨基酸序列上具有明显的同源性，构象及功能也十分相似。l2条条

47、-链（链（141AA）缺）缺失失D螺旋，缩短螺旋，缩短H螺旋螺旋l2条条 -链（链（146 AA）缩）缩短短H螺旋螺旋血红蛋白血红蛋白与肌红蛋白的氧合曲线与肌红蛋白的氧合曲线 2.5 蛋白质功能蛋白质功能 蛋白蛋白氧合曲线氧合曲线p50（Torr）Mb双曲线双曲线2.8-HbS形曲线形曲线26结合正结合正 协同性协同性 在肺部（在肺部（pO2大约大约100 torr）时，）时，Mb和和Hb对氧的亲和性都很高，被饱和对氧的亲和性都很高，被饱和;在肌肉等组织的毛细管内在肌肉等组织的毛细管内(pO2 20 40 torr），），Hb氧的亲和性低，释放氧出来，氧的亲和性低，释放氧出来，释放出来的氧都可

48、被释放出来的氧都可被Mb结合。结合。血红蛋白与血红蛋白与肌红蛋白氧的转运系统肌红蛋白氧的转运系统 2.5 蛋白质功能蛋白质功能 氧分子氧分子 任何一个亚基结合氧分子后，会增加其它亚基与氧结合的能力任何一个亚基结合氧分子后，会增加其它亚基与氧结合的能力 肺肺肌肉肌肉动脉动脉 静脉静脉 T态态 R态态 血红蛋白血红蛋白 肌红蛋白肌红蛋白 释放出氧后释放出氧后,Hb 变回变回T态态 pO2低时低时,Hb 释放出氧分子释放出氧分子 pO2高时高时,Hb 结合氧分子结合氧分子 l请举出常用的四种测定蛋白质含量的方法。l类型 类型l问该肽A的氨基酸排列顺序是怎样的?l2012年2月2日 Nature 杂志

49、封面故事:蜘蛛丝的非线性应力反应l吉斯特曼综合症（GSS）l美国著名物理化学、量子化学的先驱之一l丝心蛋白（fibroin）lSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法l肽中保留有N-端Lys 的-NH3+和C-端Glu的-COO-，pH=6时，Lys的侧链带正电荷，Glu侧链带负电荷，净电荷为0，故该肽静止不移动。lCO2浓度高，pH低，Hb利于释放O2，利于结合H+，促使生成HCO3-，有利于CO2转运，缓冲血液pHl分子紧密，内部只有容纳4个水分子的空间l6 蛋白质的分离和纯化l例：血红蛋白由四条多肽链形成的一种寡聚蛋白质。l吉斯特曼综合症（GSS）l(c)尿素;-巯基乙醇lH+、CO2、BPG影响Hb

50、结合O2l拆分蛋白质分子的多肽链lK：反应的解离常数血红蛋白血红蛋白的别构作用的别构作用 2.5 蛋白质功能蛋白质功能 别构作用（别构作用（allosteric effect）某种不直接涉及蛋白）某种不直接涉及蛋白 质活性的物质，结合于蛋白质活性部位以外的其他质活性的物质，结合于蛋白质活性部位以外的其他 部位（别构部位），引起蛋白质分子的构象变化，部位（别构部位），引起蛋白质分子的构象变化，而导致蛋白质活性改变的现象。而导致蛋白质活性改变的现象。H+、CO2、BPG影响影响Hb结合结合O2 H+、CO2对血红蛋白对血红蛋白的别构作用的别构作用 2.5 蛋白质功能蛋白质功能 CO2+H2O H2