病毒感染的实验室课件.ppt

1、第23章 病毒感染的实验室 诊断技术 第一节第一节 标本的采集、处理与运送标本的采集、处理与运送第二节第二节 病毒形态学检查病毒形态学检查第三节第三节 病毒的分离与鉴定病毒的分离与鉴定第四节第四节 病毒的血清学检测病毒的血清学检测第五节第五节 病毒的分子生物学检测病毒的分子生物学检测第六节第六节 病毒感染的快速诊断病毒感染的快速诊断主主 要要 内内 容容 THE END 一、标本的采集、处理一、标本的采集、处理第一节第一节 标本的采集、处理与运送标本的采集、处理与运送 （一）（一）采集样本的时间采集样本的时间 在发病初期（急性期）采取较易检出病毒，越迟阳性率越低。（二）（二）标本种类的选择标本

2、种类的选择 1.呼吸道感染 2.肠道感染 3.中枢神经系统感染 4.其他感染 1血液血液 2粪便标本粪便标本 3尿道拭子及尿液标本尿道拭子及尿液标本 4鼻拭子和咽拭子鼻拭子和咽拭子 5喉拭子喉拭子 6含漱液标本含漱液标本（三）常见标本的采集方法和用途（三）常见标本的采集方法和用途 7脑脊液标本脑脊液标本 8眼拭子标本眼拭子标本 9宫颈或阴道拭子宫颈或阴道拭子 10疱疹液标本疱疹液标本 11各种活检和尸检标本各种活检和尸检标本1 1血液标本血液标本 2 2粪便标本粪便标本 3 3鼻、咽拭子标本鼻、咽拭子标本 4 4尿标本尿标本 5 5疱疹液疱疹液 6 6脑脊液脑脊液 7 7组织标本组织标本 （四

3、）标本的处理（四）标本的处理 病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活，标本采集后应立即送到病毒实验室，如实验室距离较远或一时无法立即传送时，应将标本放入装有冰块的冰壶内尽快送检。大多数病毒对甘油有抵抗力，送检的组织、粪便标本等可置于含抗生素的50%甘油缓冲盐水中，低温下保存送检。最好在标本采取后12h内送到实验室，立即进行检查或分离培养。暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）以防止反复冻溶使病毒灭活，存放在-70低温冰箱内保存。二、标本的运送和保存二、标本的运送和保存 一、形态学检查一、形态学检查 （一）光学显微镜（一）光学显微镜 （二）电子显微镜检查法

4、（二）电子显微镜检查法 1、电镜直接检查法 2、免疫电镜检查法 （三）（三）X X线晶体衍射法线晶体衍射法 第二节第二节 病毒形态学检查病毒形态学检查 （一）电子显微镜直接测量（一）电子显微镜直接测量（二）超过滤法（二）超过滤法（三）超速离心法（三）超速离心法 二、病毒大小的测定二、病毒大小的测定 一、病毒分离和鉴定的一般程序一、病毒分离和鉴定的一般程序 第三节第三节 病毒的分离与鉴定病毒的分离与鉴定 临床标本的收集临床标本的收集标本处理后接种标本处理后接种新生小鼠新生小鼠组织组织鸡胚鸡胚收获尿囊液、收获尿囊液、羊膜腔液羊膜腔液红细胞凝集试验红细胞凝集试验CPE红细胞吸附红细胞吸附空斑试验空斑

5、试验包涵体包涵体EM观察发病观察发病（一）病毒分离培养（一）病毒分离培养 1 1动物接种动物接种二、病毒的分离与鉴定二、病毒的分离与鉴定 2鸡胚培养鸡胚培养3组织培养组织培养 （1）原代和次代细胞培养 （2）二倍体细胞培养 （3）传代细胞培养 （4）病毒在培养细胞中增殖的指标 1）细胞病变 2）红细胞吸附（hemadsorption）3）干扰现象 4）细胞代谢的改变 （二）病毒的数量与感染性测定（二）病毒的数量与感染性测定 1蚀斑（蚀斑（plaque）测定）测定 蚀斑形成单位（plaque forming unit,PFU）2 250%50%感染量或感染量或50%50%组织感染量（组织感染量（

6、ID50ID50或或TCID50TCID50）测定）测定 （三）新分离病毒的鉴定（三）新分离病毒的鉴定 1病毒核酸类型的测定 2理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等 3血清学鉴定 一、中和试验一、中和试验 （一）原理（一）原理 （二）用途（二）用途 第四节第四节 病毒的血清学检测病毒的血清学检测 二、补体结合试验二、补体结合试验 （一）原理（一）原理 （二）用途（二）用途 三、血凝及血凝抑制试验三、血凝及血凝抑制试验 （一）原理（一）原理 （二）用途（二）用途 四、凝胶免疫扩散试验四、凝胶免疫扩散试验 （一）原理（一）原理 （二）用途（二）用途 一、分子杂交技术一、分子杂交技术

7、 （一）基本原理（一）基本原理 （二）主要步骤（二）主要步骤 样品处理、探针的制备、预杂交、杂交、漂洗、检测（三）常用的杂交方法（三）常用的杂交方法 1斑点杂交(spot b1ot hybridization)2固相杂交技术 3原位分子杂交（in site hybridization）4Southern印迹和 Northern印迹法 5分支DNA（branched DNA,bDNA）技术 第五节第五节 病毒的分子生物学检测病毒的分子生物学检测 二、聚合酶链反应二、聚合酶链反应 （polymerase chain reaction,PCR）（一）基本原理（一）基本原理 （二）主要步骤（二）主要步

8、骤 1.1.模板的制备模板的制备 2.2.反应体系的组成反应体系的组成：缓冲液、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶、模板 3 3扩增扩增：变性复性 延伸 4 4产物分析产物分析（三）常用技术（三）常用技术 巢式（nested）和半巢式（hemi-nested）PCR、原位PCR（site PCR）、逆转录PCR（revere transcriptive PCR,RT-PCR）、多重PCR（multiple PCR）、RNA捕获PCR(RNA captured PCR)、免疫PCR（immune PCR）、定量PCR（ration PCR）三、凝胶电泳技术三、凝胶电泳技术 （一）基本原理（一）基本原理 （二）（二）常用方法常用方法 1琼脂糖凝胶电泳 2聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、形态学检查一、形态学检查 二、病毒抗原的检测二、病毒抗原的检测 （一）免疫荧光技术（一）免疫荧光技术 （二）固相放射免疫测定（二）固相放射免疫测定 （三）酶免疫技术（三）酶免疫技术 （四）其他技术（四）其他技术 三、早期抗体检测三、早期抗体检测四、病毒核酸检测四、病毒核酸检测 第第6 6节节 病毒感染的快速诊断病毒感染的快速诊断