HIV感染的血清学检测课件.ppt

1、1 HIV感染的血清学检测感染的血清学检测2内容 HIV抗体检测：抗体检测：HIV抗体筛查检测 HIV确认实验 HIV P24抗原检测：抗原检测：3HIVHIV抗体检测抗体检测全国艾滋病检测技术规范National Guideline for Detection of HIV/AIDS（2004年版）4HIVHIV抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查：抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查：以监测为目的的检测是为了解不同人群以监测为目的的检测是为了解不同人群HIVHIV感染率及其变感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。

2、般人群。以诊断为目的的检测是为了确定个体以诊断为目的的检测是为了确定个体HIVHIV感染状况而进行感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。特殊需要进行的体检等。以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIVHIV而进行而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。HIVHIV抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复检）和确认试抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复检）和确认试验验5HIV抗体试剂盒进展代次代次 抗原抗原 方法方法特异性

3、检测特异性检测 检测时间检测时间1 全病毒全病毒 间接间接 IgG 抗体抗体HIV-1 2个月个月2 重组或多肽重组或多肽 间接间接 IgG 抗体抗体HIV-1/-2 3-4 周周3 重组重组+多肽多肽 夹心夹心 IgM/IgG 抗体抗体 4-7 天天 HIV-1/-2/-O4 抗原抗原+抗体抗体 夹心夹心IgM/IgG 抗体抗体 抗原抗原 5pg HIV-1/-2/-O p24 抗原抗原6 HIV抗体检测筛查试验7HIV抗体筛查检测程序筛查、复检、确认原理酶联免疫、凝集、层析标本血液、唾液、尿液、组织液产品ELISA、快速、简单8筛查试剂要求HIV 混合型国家SDA生物诊断试剂注册批准批检合

4、格临床评估质量优良9筛查方法：筛查方法：常用的筛查方法是酶联免疫试验（ELISA）快速检测（RT）及其它检测 (1)明胶颗粒凝集试验(PA)(2)斑点EIA或称斑点ELISA(dot-EIA)(3)斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验 (4)艾滋病唾液检测卡尿液HIV抗体检测10一、一、酶联免疫试验：酶联免疫试验：ELISAELISA 11包被抗原血中抗体与抗原反应显色反应酶联免疫法酶联免疫法病毒溶解抗原、重组的衍生抗原、合成肽抗原酶联HRP、AP或化学发光12（一）斑点EIA或称斑点ELISA（dot-EIA）以硝酸纤维膜为载体，将HIV抗原滴在膜上成点状，即为固相抗原。加血清样品作用，以后步

5、骤同ELISA。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10 min以内，使用抗原量少。二、快速诊断试剂二、快速诊断试剂13（二）免疫胶体金（或胶体硒）快速试验 与斑点EIA相似，也是以硝酸纤维膜为载体。区别在于不用酶标记抗体，而代之以红色的胶体金（或胶体硒）A蛋白，用渗滤法作为洗涤方法。14 稳定，可室温长期保存。试验不需任何设备稳定，可室温长期保存。试验不需任何设备，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于中度敏感的于中度敏感的ELISAELISA，适用于应急检测、门，适用于应急检测、门诊急诊个体检测。诊急诊个体检测。已有被已有被SFDASFDA

6、批准注册的进口试剂和国内产品批准注册的进口试剂和国内产品。一般可在。一般可在1010 30min30min内判读结果。内判读结果。免疫胶体硒快速试验特点免疫胶体硒快速试验特点15v样品垫:加入血浆,血清或全血样品.红细胞在此迁移过程中被去除v质控条:固定的含捕捉硒标物的特异性试剂,不管样品中有无被检测物都应出现红色线条.控制测试结果的有效性病人条:固定的含特异性分析试剂,任何与硒标特异性试剂结合的分析复合物在此被结合固定,形成三文治结合物,肉眼可见的红色线条说明有阳性反应连接物垫:含分析特异性试剂结合的硒标,为一种肉眼可见的红色信号,被分析物和硒标特异性试剂在此反应结合16 撕下所需的测试纸条

7、数,撕下表面保护膜17血清/血浆样品加50ul样品于样品垫中15分钟内读取结果18全血样品 加50ul样品于样品垫中手指血方法静脉血方法加一滴缓冲液15分钟内读取结果19病人条质控条20 注意事项 非EDTA抗凝的血浆样品可能会 得到不正确的结果 反应条颜色深浅的程度与样品中 抗体的滴度没有必然的联系 结果的判断 21 （三）艾滋病唾液检测卡 在硝酸纤维膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同时检测含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗体，原理为酶免疫间接法。主要检测唾液中的HIV IgA与IgG抗体，敏感性特异性与ELISA相近，可避免静脉穿刺。但样品预处理时间长且售价较高。以

8、唾液为样品测定HIV抗体的ELISA、免疫印迹法（WB）试剂已经美国FDA批准。22（四）明胶颗粒凝集试验（PA）PA是HIV血清抗体检测的一种简便方法，是将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA试剂有两种，HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA试剂（AFD HIV-1/2 PA），已经我国食品药品监督管理局（SFDA）注册批准；HIV-1、HIV-2抗原分别致敏的PA试剂（SERODIA-HIV-1/2）可初步区分HIV-1型和HIV-2型

9、，目前我国尚未引进。23 尿液测定 采样优点，尤其对吸毒者标本 机理：IgA为主，IgG少量 HIV-1型抗体 阳性结果务必用血清学检测24快速试剂的应用偏远地区急诊临床（高危）职业暴露临产25结果报告：结果报告：对呈对呈阴性反应阴性反应的样品，可由实施检测的实验室出具的样品，可由实施检测的实验室出具HIVHIV抗抗体阴性报告。体阴性报告。对呈对呈阳性反应阳性反应的样品，须进行复检，的样品，须进行复检，不能出阳性报告不能出阳性报告。复检试验：复检试验：对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。理或不同厂家的筛

10、查试剂重复检测。如果两种试剂复测均呈阴性反应，则如果两种试剂复测均呈阴性反应，则报告报告HIVHIV抗体阴性抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行送艾滋病确认实验室进行确认确认。对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具“HIVHIV抗体待复查抗体待复查”报告。报告。26初筛试验呈阳性反应样品的转送：初筛试验呈阳性反应样品的转送：填写填写“HIVHIV抗体待复测送检单抗体待复测送检单”，经，经1 1名检验人员名检验人员和和1 1名具有中级以上技术职称的人员审核签字。送当名具有中级以上技术职称的人

11、员审核签字。送当地艾滋病筛查中心实验室，再转送艾滋病确认实验地艾滋病筛查中心实验室，再转送艾滋病确认实验室，或在本实验室复检后直接送确认实验室。室，或在本实验室复检后直接送确认实验室。对筛查阴性和阳性者，均需做好检测后咨询。对筛查阴性和阳性者，均需做好检测后咨询。2728 初筛试验结果的报告 对HIV抗体筛查试验：“”“HIV抗体阴性”报告（可用附表“+”不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查”报告29对HIV抗体筛查试验，呈阴性反应者可出具“HIV抗体阴性”报告30对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查”报告3132 HIV抗体检测确认试验 33HIV抗体确认试验抗

12、体确认试验确认试验的试剂：确认试验的试剂：必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。确认试验方法：确认试验方法：包括免疫印迹试验(WB)、条带免疫试验(LIATEK HIV)、放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA)。国内常用的确认试验方法是WB。34蛋白印迹实验（蛋白印迹实验（WBWB）广泛使用的确认实验广泛使用的确认实验基本原理HIVHIV全病毒抗原经过聚丙烯酰胺凝胶电泳全病毒抗原经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,将将分子量大小不等的分子量大小不等的HIVHIV抗原蛋白带分离开来抗原蛋白带分离开来,然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转

13、移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状,每一每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIVHIV病毒抗原。病毒抗原。35 将待检血清样品加到硝酸纤维素膜上将待检血清样品加到硝酸纤维素膜上,恒温震荡恒温震荡,使其充分接触反应使其充分接触反应,血清中血清中若含有抗若含有抗HIVHIV抗体抗体,就会与膜条上的抗就会与膜条上的抗原带相结合。原带相结合。加入酶偶联的抗人加入酶偶联的抗人IgGIgG抗体和底物，即抗体和底物，即可使有反应的抗原可使有反应的抗原-抗体结合带呈现紫抗体结合带呈现紫褐色褐色,根据出现条带情况判定结果。根据出现条带

14、情况判定结果。36蛋白质抗原分子经电泳分开血液中的抗体与抗原反应，形成不同的条带Western Blot37方法加血浆加血浆洗洗加酶结合物加酶结合物(Ab-HRP)洗洗加底物加底物38其可检测标本中针对其可检测标本中针对HIV不同抗原不同抗原的抗体，的抗体，故被用做确认试剂。故被用做确认试剂。不同的研究机构有不同的判定标准不同的研究机构有不同的判定标准39无无HIV-1HIV-1特异性条带特异性条带ENV ENV 或或ENV+p24ENV+p24CHINA无条带无条带1 ENV+p24/p31FDA（USA）无条带或只有无条带或只有P17P172 ENV+GAG+POLWHO阴阴 性性阳阳 性

15、性组组 织织“不确定不确定”()：出现出现HIV-1HIV-1特异性条带，但带型不足以特异性条带，但带型不足以 确认阳性，每三个月随访一次，共两次，确认阳性，每三个月随访一次，共两次，仍属可疑，判为阴性仍属可疑，判为阴性40a 强阳性对照（强阳性对照（HIV-1和和HIV-2）b弱阳性对照（弱阳性对照（HIV-1）c阴性对照阴性对照d典型的典型的HIV-2血清阳性反应血清阳性反应41不确定标本的处理 原因特异性和非特异性 因素标本种类，操作技术，感染时 间，指征把握等 处理随访（注意一根条带）保存42试验中应注意的问题严格按照说明书操作和阅读 判断结果典型 带型和颜色；强调env带 非典型 全

16、而淡、一根主要条带、高危人群、不确定，等等 特异性高，但也有漏检 核对、多种、操作技术43免疫印迹法（免疫印迹法（WB，HIV-1/2混合型）混合型）HIV-1阳性反应阳性反应不确定反应不确定反应 出现出现HIV-2指示条带指示条带报告报告HIV-1阳性阳性不确定反应不确定反应阳性反应阳性反应阴性反应阴性反应报告阴性报告阴性每每3个月随访个月随访1次，共次，共2次，仍属可疑，则报告阴性；如随访期次，仍属可疑，则报告阴性；如随访期间间HIVHIV抗体抗体出现阳出现阳性反性反应则报告阳性。应则报告阳性。随访期间可根据需要，检测病毒核酸和或随访期间可根据需要，检测病毒核酸和或P24抗原，作为辅助诊断

17、。抗原，作为辅助诊断。阴性反应阴性反应报告阴性报告阴性筛查试验阳性反应样品筛查试验阳性反应样品报告报告HIV-2血清学阳性血清学阳性免疫印迹法（免疫印迹法（WB，HIV-2）图图2 HIV2 HIV抗体确认检测流程抗体确认检测流程44P24抗原检测抗原检测45窗口期4th gen3rd gen=1st-2nd genHIV antigenIgM abIgG abDetection limit=window第一第一/二代试剂检测二代试剂检测IgG抗体，第三代试剂检测抗体，第三代试剂检测IgG、IgM抗体抗体,第四代试剂同时检测第四代试剂同时检测IgG、IgM抗体和抗体和P24抗原使窗口期缩短。抗

18、原使窗口期缩短。46窗口期 窗口期的决定因素 初筛试剂质量和测试技术 机体免疫反应 病毒特性 窗口期无法避免47 P24抗原测定抗原测定适用范围适用范围48检测原理检测原理 P24抗原的检测通常是采用ELISA夹心法，已知抗体包被固相反应板孔底，加入待测血清，若血清中含有P24抗原则与包被抗体形成抗原-抗体复合物，再加入酶（HRP）标记的HIV-1抗体与抗原结合，加底物显色，在酶标仪上读结果。49 为了提高检测血清中P24抗原的敏感性，需先将血清中免疫复合物解离后再进行测定 目前已发展了ICD P24抗原（immun-complex disassociate，免疫复合物解离，ICD）测定试剂，

19、用于HIV-1 P24抗原测定。即使将复合物解离，敏感性提高，也只能在大约50%无症状感染者中检出P24抗原。50结果报告和解释结果报告和解释定性分析：定性分析：1 1、HIV-1 P24HIV-1 P24抗原的阳性结果必须经过中和试验确认。抗原的阳性结果必须经过中和试验确认。2 2、HIV-1 P24HIV-1 P24抗原阳性仅作为抗原阳性仅作为HIVHIV感染的感染的辅助诊断依据辅助诊断依据，不能依此确诊。，不能依此确诊。3 3、HIV-1 P24HIV-1 P24抗原阴性结果只表示在本试验中无反应，抗原阴性结果只表示在本试验中无反应，不能排除不能排除HIVHIV感染感染。4 4、婴幼儿经

20、过胎盘或哺乳从母亲获得的、婴幼儿经过胎盘或哺乳从母亲获得的HIVHIV抗体不能用于诊断是否经母婴传抗体不能用于诊断是否经母婴传播感染播感染HIVHIV。婴幼儿体内从母亲得到的。婴幼儿体内从母亲得到的HIVHIV抗体持续存在时间最长不超过抗体持续存在时间最长不超过1818个月。在个月。在1818月龄以前可以用多种不同的非抗体依赖性的检验方法对新月龄以前可以用多种不同的非抗体依赖性的检验方法对新生儿生儿HIVHIV感染进行辅助诊断，包括：感染进行辅助诊断，包括：HIV P24HIV P24抗原检测、病毒分离培养、抗原检测、病毒分离培养、RNARNA或或DNADNA测定。测定。51结果报告和解释结果报告和解释定量分析：定量分析：1 1、试剂盒给定的标准品进行梯度稀释、试剂盒给定的标准品进行梯度稀释（平行孔）（平行孔）2 2、根据标准品的浓度和检测结果、根据标准品的浓度和检测结果(吸光度值吸光度值)绘出定量曲绘出定量曲线，然后按照各标本的检测结果线，然后按照各标本的检测结果(吸光度值吸光度值)计算计算p24p24浓度。浓度。3 3、定量检测值通常用来作为表示病毒水平的指标。、定量检测值通常用来作为表示病毒水平的指标。52谢谢！谢谢！