14-1血清学实验技术.ppt

1、14-1血清学实验技术第一节第一节 血清学反应概论血清学反应概论概念：在体外进行的抗原抗体反应，一般采用血清进行，称概念：在体外进行的抗原抗体反应，一般采用血清进行，称为血清学反应为血清学反应Ag血清血清(Ab)Ag-Ab复合物复合物pH 7.0 370C一、血清学反应的一般规律一、血清学反应的一般规律二、血清抗体的制备原则二、血清抗体的制备原则三、影响血清学反应的因素三、影响血清学反应的因素四、血清学反应的应用四、血清学反应的应用一、血清学反应的一般规律一、血清学反应的一般规律（一）（一）抗原与抗体结合的胶体形状变化抗原与抗体结合的胶体形状变化 抗体在溶液中以胶体状态存在抗体在溶液中以胶体状

2、态存在+-+n范德华力 抗原抗体互补空间关系有助于该力发挥作用。n静电引力 氨基与羧基n氢键结合力 大于范德华力n疏水作用 抗原抗体分子上非极性氨基酸，提供的作用力最大 (二二)抗原抗体作用的结合力抗原抗体作用的结合力n比例适合才出现最强的反应。沉淀反应比例适合才出现最强的反应。沉淀反应n抗原抗体反应的等价带抗原抗体反应的等价带:最适比时，抗原抗体结合充分，沉淀物形最适比时，抗原抗体结合充分，沉淀物形成快而多，上清中存在少量游离。成快而多，上清中存在少量游离。n带现象：如抗原或抗体过剩，其结合价不带现象：如抗原或抗体过剩，其结合价不能相互饱和，则抗原与抗体仅能形成小分能相互饱和，则抗原与抗体仅

3、能形成小分子的复合物，不出现肉眼可见的反应。子的复合物，不出现肉眼可见的反应。（三）抗原抗体的结合比例（三）抗原抗体的结合比例前带后带n非共价键结合，一定条件下可解非共价键结合，一定条件下可解离离n结合强度取决于特异性抗体结合强度取决于特异性抗体FabFab片段与抗原决定簇立体构型的吻片段与抗原决定簇立体构型的吻合程度合程度n稀释和冻融可使复合物解离稀释和冻融可使复合物解离n解离与否：解离与否：1 1、亲和力；、亲和力；2 2、环境、环境因素因素 （pHpH、离子强度）、离子强度）（四）抗原与抗体结合的可逆性（四）抗原与抗体结合的可逆性 利用抗原抗体特异性结合反应利用抗原抗体特异性结合反应的可

4、逆性规律，建立亲和层析技的可逆性规律，建立亲和层析技术，纯化免疫纯的抗原或抗体。术，纯化免疫纯的抗原或抗体。n第一阶段：特异性结合；时间短，数第一阶段：特异性结合；时间短，数秒到数分钟秒到数分钟n第二阶段：可见反应阶段，表现为凝第二阶段：可见反应阶段，表现为凝集、沉淀等可见反应；时间长，数分集、沉淀等可见反应；时间长，数分钟到数日钟到数日（五）抗原抗体反应的阶段性（五）抗原抗体反应的阶段性二、血清抗体的制备原则二、血清抗体的制备原则1.免疫动物的选择免疫动物的选择 选择动物时应考虑以下因素：选择动物时应考虑以下因素：抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物抗原来源与动物种属的关系。抗原的

5、来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。山羊、马、驴等大动物。2.抗原及佐剂抗原及佐剂(1)免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的免疫原的剂量：免疫原的接种剂量

6、按免疫原性的强弱、动物的个体状态、免疫时间、所要求的抗体强弱、动物的个体状态、免疫时间、所要求的抗体特性来确定。特性来确定。首次免疫时，剂量不宜过大或过小，以免产生首次免疫时，剂量不宜过大或过小，以免产生免疫耐受或不能形成足够刺激。免疫耐受或不能形成足够刺激。高特异性低剂量短程免疫；高效价大剂量高特异性低剂量短程免疫；高效价大剂量长程免疫长程免疫(2)免疫佐剂免疫佐剂:某些物质与抗原一起或先于抗原注入某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答增强机体对该抗原的特异性免疫应答或或改改变免疫应答类型变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂，此类物质称为免疫佐剂(i

7、mmunoadjuvant)，简称佐剂。，简称佐剂。佐剂的种类佐剂的种类 佐剂一般包括以下几类：佐剂一般包括以下几类：无机佐剂：无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等如氢氧化铝、明钒等生物性佐剂：生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；酰二肽和细胞因子等；人工合成佐剂：人工合成佐剂：如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；）；油剂

8、：油剂：如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等；如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等；纳米佐剂纳米佐剂 弗氏佐剂（弗氏佐剂（Freunds adjuvant）,分分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种：为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种：n前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊毛脂或吐温剂（羊毛脂或吐温-80）按）按1：11：5比例比例混合而成；混合而成；n后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成匀，制成“油包水油包水”乳化液。乳化液。佐剂与抗原混合乳化的方法：佐剂与抗原

9、混合乳化的方法：n研磨法研磨法n搅拌混合法搅拌混合法佐剂的免疫生物学作用佐剂的免疫生物学作用增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原；变成持久或强的免疫原；增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应答和增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度；再次应答所产生的抗体滴度；改变抗体类型，使产生抗体由改变抗体类型，使产生抗体由IgM型转变为型转变为IgG型；型；引起或增强迟发性超敏反应。引起或增强迟发性超敏反应。佐剂的作用机制佐剂的作用机制 佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种：佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种

10、：可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性。而增强抗原的免疫原性。佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释放。留时间，有利于抗原的缓慢释放。增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细吞噬细胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增强和扩大免疫应答的效应。胞增生，从而增强

11、和扩大免疫应答的效应。3.免疫途径与免疫间隔时间免疫途径与免疫间隔时间n免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免疫方案而异。腹腔、淋巴结等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。疫法。n免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其中首次与第二次免疫的间隔时间尤为重其中首次与第二次免疫的间隔时间尤为重要，一般以要，一般以1020天为佳，二次后间隔时天为佳，二次后间隔时间一般为间一般为710天，若间隔时间太长，则刺天，若间隔时间太长，则刺激减

12、弱，抗体效价不高。激减弱，抗体效价不高。4.免疫血清的保存免疫血清的保存 1、4保存（保存（6个月）个月）2、低温保存（、低温保存（-70 -20 ，5年）年）3、真空干燥保存（、真空干燥保存（5 10年）年）注意点：保存前需经除菌注意点：保存前需经除菌 保存液含防腐剂保存液含防腐剂 避免反复冻融（分装）避免反复冻融（分装）三、影响血清学反应的因素三、影响血清学反应的因素抗体的来源：不同动物的免疫血清反应性存在差异。抗体的来源：不同动物的免疫血清反应性存在差异。家兔，等家兔，等价带宽，抗原过量才出现可溶性免疫复合物价带宽，抗原过量才出现可溶性免疫复合物抗体的浓度：相对抗原而言抗体的浓度：相对抗

13、原而言抗体的特异性和亲和力：抗体的特异性和亲和力：早期抗体特异性较好，亲和力低早期抗体特异性较好，亲和力低晚期亲和力高类型复杂，反应性复杂晚期亲和力高类型复杂，反应性复杂单抗的特异性好但亲和力低，不适用于低灵敏度的沉淀反单抗的特异性好但亲和力低，不适用于低灵敏度的沉淀反应或凝集反应。应或凝集反应。（1）抗体因素）抗体因素三、影响血清学反应的因素三、影响血清学反应的因素理化性状：可溶性（沉淀反应）、颗粒性（凝集反应）理化性状：可溶性（沉淀反应）、颗粒性（凝集反应）抗原决定簇数目：单价与多价：单价抗原与抗体结合不抗原决定簇数目：单价与多价：单价抗原与抗体结合不出现可见反应出现可见反应（2）抗原因素

14、）抗原因素（3 3）电解质）电解质亲水变疏水，降低抗原抗体的电势，利于亲水变疏水，降低抗原抗体的电势，利于二者结合二者结合（4 4）pHpH值值pH6.0pH6.09.09.0均可以，常用均可以，常用 pH7.0 pH7.07.27.2。抗原抗体蛋白的等电点在抗原抗体蛋白的等电点在 pH6 pH6以下，若抗原或抗体溶液以下，若抗原或抗体溶液pHpH接近等电点，自身就会凝聚，出现非特异性的凝集或沉淀接近等电点，自身就会凝聚，出现非特异性的凝集或沉淀反应。设立阳性、阴性和空白对照。反应。设立阳性、阴性和空白对照。（5 5）温度：）温度：151540400 0C C均可，温度低反应慢，温度高反应快。

15、均可，温度低反应慢，温度高反应快。最常用最常用37370 0C 30minC 30min。（6 6）时间）时间 反应速度：亲和力、类型、介质、温度等，液相反应速度：亲和力、类型、介质、温度等，液相中抗原抗体很快达到平衡，但在琼脂中就慢。中抗原抗体很快达到平衡，但在琼脂中就慢。（7 7）杂质异物）杂质异物反应中如存在有与反应无关的蛋白质、类反应中如存在有与反应无关的蛋白质、类脂质、多糖等，往往会抑制反应进行，或引起非特异性反应。脂质、多糖等，往往会抑制反应进行，或引起非特异性反应。四、血清学反应的应用四、血清学反应的应用n抗原抗体的定性检测：抗原抗体的定性检测：检测抗体检测抗体检测抗原检测抗原

16、n抗原或抗体的定量检测：抗原或抗体的定量检测：免疫复合物产量推算样品中的抗原免疫复合物产量推算样品中的抗原/抗体量：抗体量：ELISAELISA效价滴定：把浓度低的反应成分（抗原或抗体）固效价滴定：把浓度低的反应成分（抗原或抗体）固定，另一成分做梯度稀释。定，另一成分做梯度稀释。免疫标记技术：流式、免疫标记技术：流式、n抗原的定位抗原的定位 免疫组化免疫组化第二节第二节 血清学反应类型血清学反应类型凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应免疫标记技术免疫标记技术补体结合反应补体结合反应中和试验中和试验免疫电镜免疫电镜免疫沉淀免疫沉淀免疫转印免疫转印一、凝集反应一、凝集反应 概念：细菌、红细胞等颗粒性抗

17、原与相应抗体结合，在有电解质存在下，形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集反应。凝集原凝集素（一）直接凝集试验（一）直接凝集试验1.玻片凝集反应 将含有已知抗体的诊断血清(适当稀释)与待检菌悬液各一滴在玻片上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。此法简便快速，适用于新分得细菌的鉴定或分型。如沙门氏菌的鉴定、血型的鉴定等多采用此法，为一种定性试验。也可用已知的诊断抗原悬液，检测待检血清中是否存在相应抗体，如布氏杆菌的玻板凝集反应和鸡白痢全血平板凝集试验。概念：将颗粒性抗原直接与相应的抗体反应出现肉眼可见的凝集块的现象2.2.试管凝集试验试管凝集试验 试管法为一种定量试验，用已知抗原以检

18、测待测血清中是否存在相应抗体和测定该抗体的含量，以协助临床诊断或供流行病学调查。（二）间接凝集试验（二）间接凝集试验正向间接凝集试验（检测抗体）、反向间接凝集试验（检测抗原）正向间接凝集试验（检测抗体）、反向间接凝集试验（检测抗原）间接凝集抑制试验、协同凝集试验间接凝集抑制试验、协同凝集试验抗球蛋白实验机体受某些抗原刺激后，可产生不完全抗体，由于这种抗体体积较小、长度短，只能与颗粒抗原一方相结合(又称单价抗体)，因而不能出现肉眼可见的凝集反应。抗原表位被不完全抗体封闭（封闭抗体）。不完全抗体免疫异种动物可获得抗球蛋白抗体（抗抗体），抗抗体与抗原颗粒上吸附的不完全抗体结合，产生凝集反应。（三）C

19、oombs实验 直接Coombs试验:用于检测已粘附在红细胞表面的不完全抗体。间接Coombs试验:用于检测游离在血清中的不完全抗体 二、沉淀反应二、沉淀反应概念：可溶性抗原与相应抗体结合，在有电解质存在下，形成肉眼可见的沉淀现象。细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、血清、组织浸出液等。2、种类（1）液相沉淀试验：絮状沉淀试验、环状沉淀试验、免疫浊度测定（2）凝胶沉淀试验：免疫扩散试验（单向单扩、单向双扩、双向单扩、双向双扩/琼扩）、免疫电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳对流免疫电泳对流免疫电泳Ag为阳性；为阳性；Ag为弱阳性；为弱阳性；Ag为强阳性；为强阳性；Ag为强阳性为强阳性 三、免疫

20、标记技术三、免疫标记技术抗原与抗体结合了，但复合物小，不能通过凝集或沉淀抗原与抗体结合了，但复合物小，不能通过凝集或沉淀用肉眼观察到。用肉眼观察到。定义：定义：将抗原将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或放射性同位素、酶或荧光素荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。知的抗原或抗体。检测标记物的存在，间接反映抗原抗体发生了结合。检测标记物的存在，间接反映抗原抗体发生了结合。抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性 标记分子的敏感性标记分子的敏感性分类：分类：放射免疫测定法：

21、放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：免疫荧光技术：FITC，PE免疫酶测定法：免疫酶测定法：HRP，AP免疫酶测定法免疫酶测定法酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。中未知抗体或抗原的方法。n将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗n检测液相中未知抗体检测液相中未知抗体n将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗n检测液相中的可溶性抗原检测液相中的可溶性抗原n将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或将已知抗体或抗原吸附

22、于固相载体，酶标记抗原或抗体抗体n检测液相中的可溶性抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（以间接性（以间接性ELISAELISA为例）为例）：四、补体结合反应四、补体结合反应 补体结合反应：补体结合反应：是指在是指在补体补体的参与下，以绵羊红细胞的参与下，以绵羊红细胞（SRBCSRBC）和溶血素（抗）和溶血素（抗SRBCSRBC的抗体）作为的抗体）作为指指示系统示系统的的抗原抗体反应抗原抗体反应。补反中包括补反中包括两个系统两个系统五种成分：五种成分：待检系统：已知待检系统：已知AgAg或或AbAb、待检、待检AbAb或或AgAg补体补体:仅供一组仅供一组Ag

23、-AbAg-Ab系统反应的定量补系统反应的定量补体。体。指示系统：绵羊红细胞和溶血素。指示系统：绵羊红细胞和溶血素。原理：原理：1 21 12 21 12 21：No Ab；2：AbAg待测血清待测血清 AbAb阳性阳性No AbNo Ab阴性阴性AgAgAg五、中和试验五、中和试验 病毒或毒素与相应的抗体结合，抗体中和了病毒或毒素，失去了对易感动物的致病力，这种试验称为中和试验。Western Blot（参考）Diagram通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测。蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏

24、感等多种特点，可检测到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白 原理原理二抗孵育二抗孵育蛋白提取与定量蛋白提取与定量一抗孵育一抗孵育封闭封闭转膜转膜SDS-聚丙烯酰胺电泳聚丙烯酰胺电泳蛋白变性蛋白变性显影显影SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳缓冲液：电泳缓冲液：PH8.3Tris-PH8.3Tris-甘氨酸甘氨酸-SDS-SDS系统系统。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳灌制分离胶灌制分离胶 隔绝空气隔绝空气灌好后一般室温放置灌好后一般室温放置3040分钟分钟SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳灌制积层胶灌制积层胶 插入梳子插入梳子上样及电泳n提前将样品沸水浴5分钟，13000rpm离心10分钟。n根

25、据自己的设计上样。n80V恒压跑浓缩胶。n看溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为100V。n当溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.40.6mm时停止电泳。转膜 蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。膜的封闭 为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理,一般用一般用5的脱脂奶粉或者的脱脂奶粉或者3的的BSA室温或室温或37度封闭度封闭2小时。小时。转好蛋白的膜ProteinProte

26、in封闭ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking Agent一抗孵育ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary Antibody二抗孵育ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary AntibodySecondary Antibody显影ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary AntibodySecondaryAntibodyEnzyme(E)sssssPPPP Substrate+/+-/-NT 5 20 60 180 360 NT 5 20 60 180 360 minTNP-BSA TNP-BSA2501501007550372520Anti-pTyr(4G10)p-P38P38p-JNKJNKp-AktAktNT 5 20 60 180 360 NT 5 20 60 180 360 minTNP-BSA TNP-BSA+/+-/-