分子核医学-核医学与核药学教学、学习课件.ppt

1、 第八章第八章 分子核医学分子核医学 分子核医学：分子核医学：以分子识别作为理以分子识别作为理论基础，利用放射性核素标记的示踪论基础，利用放射性核素标记的示踪剂，从分子水平去认识生命现象和疾剂，从分子水平去认识生命现象和疾病发生、发展的规律，从而诊断与治病发生、发展的规律，从而诊断与治疗疾病的一门综合性的边缘性学科。疗疾病的一门综合性的边缘性学科。第一节第一节 分子核医学的理论基础分子核医学的理论基础 一、分子核医学的特点一、分子核医学的特点 1 1、分子核医学不再从器官角度而是从生理、分子核医学不再从器官角度而是从生理、生化的角度，并深入至分子水平去认识疾、生化的角度，并深入至分子水平去认识

2、疾病，它要回答的是有关细胞信息传导、基因病，它要回答的是有关细胞信息传导、基因表达、生化代谢等方面的问题。因此，在临表达、生化代谢等方面的问题。因此，在临床上出现明显的解剖和功能改变之前的几周床上出现明显的解剖和功能改变之前的几周或几个月，分子核医学就能提供疾病变化的或几个月，分子核医学就能提供疾病变化的分子信息。分子信息。2 2通过利用特定的放射性示踪剂，分子核通过利用特定的放射性示踪剂，分子核医学可为我们提供一个观察细胞间和细胞医学可为我们提供一个观察细胞间和细胞内的生化过程变化的窗口。通过这个窗口内的生化过程变化的窗口。通过这个窗口，可以将以生化功能或代谢异常为表型的，可以将以生化功能或

3、代谢异常为表型的疾病与其相应的基因型联系起来，从而使疾病与其相应的基因型联系起来，从而使我们对疾病的认识、诊断和治疗提高到一我们对疾病的认识、诊断和治疗提高到一个新的水平，可使相关疾病治疗更具针对个新的水平，可使相关疾病治疗更具针对性。性。二、分子生物学与分子核医学的相互关系二、分子生物学与分子核医学的相互关系 分子生物学的研究成果是分子核医分子生物学的研究成果是分子核医学理论的源泉，分子核医学的出现是分学理论的源泉，分子核医学的出现是分子生物学向核医学渗透的必然结果。同子生物学向核医学渗透的必然结果。同时，分子核医学的发展也将会不断地为时，分子核医学的发展也将会不断地为分子生物学的发展提供新

4、方法和新思路分子生物学的发展提供新方法和新思路。高等生物细胞间和细胞内的信息传递是协高等生物细胞间和细胞内的信息传递是协调各种细胞功能、维持机体内、外环境的稳态调各种细胞功能、维持机体内、外环境的稳态和生命活动的基础。在细胞间传递的信息分子和生命活动的基础。在细胞间传递的信息分子主要有神经递质、激素和细胞因子等。这些信主要有神经递质、激素和细胞因子等。这些信息分子通过神经或体液途径从某种细胞传递至息分子通过神经或体液途径从某种细胞传递至另一种细胞，并通过与细胞受体的识别与结合另一种细胞，并通过与细胞受体的识别与结合而将信息进一步传递至细胞内，引起细胞产生而将信息进一步传递至细胞内，引起细胞产生

5、多种生理效应乃至基因的表达。多种生理效应乃至基因的表达。三、分子识别是分子核医学理论的基石三、分子识别是分子核医学理论的基石四、当前分子核医学几个重要研究领域四、当前分子核医学几个重要研究领域 1 1、放射免疫显像和放射免疫治疗、放射免疫显像和放射免疫治疗 2 2、放射受体显像和受体介导的靶向治疗、放射受体显像和受体介导的靶向治疗 3 3、放射基因显像和基因的放射治疗、放射基因显像和基因的放射治疗 4 4、代谢显像、代谢显像 放射免疫显像放射免疫显像(Rll):(Rll):将放射性核素标将放射性核素标记的抗肿瘤抗原作为显像剂引入机体，定记的抗肿瘤抗原作为显像剂引入机体，定向的与肿瘤细胞相关抗原

6、结合，使肿瘤组向的与肿瘤细胞相关抗原结合，使肿瘤组织局部聚集一定量的显像剂，用织局部聚集一定量的显像剂，用相机或相机或SPECTSPECT进行平面或断层显像，即可显示肿瘤进行平面或断层显像，即可显示肿瘤及其转移灶的部位、大小、范围。及其转移灶的部位、大小、范围。1、放射免疫显像和放射免疫治疗、放射免疫显像和放射免疫治疗 放射免疫治疗（放射免疫治疗（RITRIT）:RIT:RIT的临床研究的临床研究和应用情况远不如和应用情况远不如RllRll，主要原因是：肿瘤，主要原因是：肿瘤对标记单抗的摄取率不高，且标记抗体是结对标记单抗的摄取率不高，且标记抗体是结合在细胞膜上，位于核内的合在细胞膜上，位于核

7、内的DNADNA，被射线随，被射线随机击中的机率低，肿瘤细胞难以获得致死性机击中的机率低，肿瘤细胞难以获得致死性照射剂量；其次，照射剂量；其次，RITRIT所需注射的抗体用量所需注射的抗体用量远较远较RllRll为大，且又需反复注射。随着越来为大，且又需反复注射。随着越来越多的高性能多肽类放射性药物的出现，越多的高性能多肽类放射性药物的出现，RITRIT疗效可望得到改善。疗效可望得到改善。2、放射受体显像和受体介导的靶向治疗、放射受体显像和受体介导的靶向治疗 近年来，越来越多的受体分子结构被阐近年来，越来越多的受体分子结构被阐明，在已知配体结合位点结构的基础上研制明，在已知配体结合位点结构的基

8、础上研制开发的亲和力高、特异性强、体内稳定的多开发的亲和力高、特异性强、体内稳定的多肽类放射性药物为受体显像和受体介导的放肽类放射性药物为受体显像和受体介导的放射配体治疗提供了非常便利的条件。受体显射配体治疗提供了非常便利的条件。受体显像和受体介导的放射配体治疗已成为近年来像和受体介导的放射配体治疗已成为近年来的研究热点，并将成为的研究热点，并将成为2121世纪分子核医学发世纪分子核医学发展的主要方向之一。展的主要方向之一。放射受体显像：放射受体显像：由于基因扩增或基因突由于基因扩增或基因突变等原因，肿瘤细胞膜上常有一些受体的超量变等原因，肿瘤细胞膜上常有一些受体的超量表达，利用放射性配体与肿

9、瘤细胞上的特异性表达，利用放射性配体与肿瘤细胞上的特异性受体结合而使肿瘤显像既是一种敏感性和特异受体结合而使肿瘤显像既是一种敏感性和特异性较高的检测方法，同时对于指导治疗和进行性较高的检测方法，同时对于指导治疗和进行疗效评价也具有重要价值。目前研究较多的是疗效评价也具有重要价值。目前研究较多的是对一些调节性肽类受体，如促生长抑制素（对一些调节性肽类受体，如促生长抑制素（SMSSMS）受体、血管活性肠肽（）受体、血管活性肠肽（VIPVIP）受体、）受体、P P物物质（质（SPSP）受体等进行显像。）受体等进行显像。受体介导的靶向治疗：受体介导的靶向治疗：配体与相应的膜配体与相应的膜受体结合，除了

10、能传递信息外，还可通过内受体结合，除了能传递信息外，还可通过内在化过程与受体一起不断地进入细胞内。进在化过程与受体一起不断地进入细胞内。进入胞浆内的配体和受体可在溶酶体酶的作用入胞浆内的配体和受体可在溶酶体酶的作用下被降解，而受体也可再循环返回至胞膜。下被降解，而受体也可再循环返回至胞膜。若用合适的放射性核素标记能抵抗生物降解若用合适的放射性核素标记能抵抗生物降解的特异性配体，则伴随着此过程，放射性配的特异性配体，则伴随着此过程，放射性配体可在细胞浆内集聚。这样，结合在膜上和体可在细胞浆内集聚。这样，结合在膜上和集聚在细胞内的放射性核素发出的射线，便集聚在细胞内的放射性核素发出的射线，便可有效

11、地杀伤肿瘤细胞。可有效地杀伤肿瘤细胞。3、放射基因显像和基因的放射治疗、放射基因显像和基因的放射治疗 利用反义技术对特定基因进行显像或进行基利用反义技术对特定基因进行显像或进行基因的放射治疗是目前分子核医学领域研究的一个因的放射治疗是目前分子核医学领域研究的一个热点，反义技术是近年来在癌基因研究基础上发热点，反义技术是近年来在癌基因研究基础上发展起来基因治疗新技术，它利用人工合成或生物展起来基因治疗新技术，它利用人工合成或生物合成的反义寡核苷酸通过碱基互补的原理特异地合成的反义寡核苷酸通过碱基互补的原理特异地结合到靶基因上，抑制相应基因的转录和翻译而结合到靶基因上，抑制相应基因的转录和翻译而达

12、到治疗肿瘤目的。同时，若在反义基因上引入达到治疗肿瘤目的。同时，若在反义基因上引入放射性核素，则可利用显像技术对异常表达基因放射性核素，则可利用显像技术对异常表达基因进行定位和定量。而利用射线对基因的破坏左右进行定位和定量。而利用射线对基因的破坏左右，也可达到基因的放射治疗的目的。，也可达到基因的放射治疗的目的。4、代谢显像、代谢显像 代谢的示踪研究一直是核医学中的主旋代谢的示踪研究一直是核医学中的主旋律。律。PETPET的问世，使我们可以利用人体组织的的问世，使我们可以利用人体组织的同位素同位素1313N N、1515O O和和1818F F等正电子核素标记物进行等正电子核素标记物进行分子水

13、平的显像，高精度地显示活体内代谢分子水平的显像，高精度地显示活体内代谢和生化活动，获取人体各种定量的生理参数。和生化活动，获取人体各种定量的生理参数。以以PETPET为主要手段的代谢显像是当前分子核医为主要手段的代谢显像是当前分子核医学中非常活跃的一个研究领域，学中非常活跃的一个研究领域，PETPET显像在肿显像在肿瘤的诊断、鉴别诊断、预后及疗效判断等方瘤的诊断、鉴别诊断、预后及疗效判断等方面的研究中均取得了显著的进展。面的研究中均取得了显著的进展。分子生物学是当今生命科学领域中发展最快和分子生物学是当今生命科学领域中发展最快和最引人注目的学科之一。在分子生物学理论和实验最引人注目的学科之一。

14、在分子生物学理论和实验技术的发展过程中，核素示踪技术起了非常重要的技术的发展过程中，核素示踪技术起了非常重要的作用。分子生物学中的许多重要问题，如作用。分子生物学中的许多重要问题，如DNADNA是遗是遗传信息的携带者、传信息的携带者、DNADNA的半保留复制、转录、遗传的半保留复制、转录、遗传密码的破译等都是借助核素示踪技术得以阐明的；密码的破译等都是借助核素示踪技术得以阐明的；分子生物学中的常用技术，如核酸序列分析技术、分子生物学中的常用技术，如核酸序列分析技术、核酸分子杂交技术、核酸分子杂交技术、DNADNA重组技术、重组技术、PCRPCR技术等往往技术等往往也离不开核素示踪这一重要的手段

15、；而在蛋白质生也离不开核素示踪这一重要的手段；而在蛋白质生物合成研究中，核素示踪技术更是重要的研究手段。物合成研究中，核素示踪技术更是重要的研究手段。第二节第二节 示踪技术在分子核医学中的应用示踪技术在分子核医学中的应用 一、放射性核素在核酸研究中的应用一、放射性核素在核酸研究中的应用 核酸一直是分子生物学的中心议题之一，在核酸核酸一直是分子生物学的中心议题之一，在核酸研究中广泛采用核素示踪技术。核酸的放射性核素标研究中广泛采用核素示踪技术。核酸的放射性核素标记是分子生物学中不可缺少的技术之一，其在分子生记是分子生物学中不可缺少的技术之一，其在分子生物学中的基本职能是作为探针，用于检测特异的核

16、酸物学中的基本职能是作为探针，用于检测特异的核酸序列，用途非常广泛。序列，用途非常广泛。1 1、核酸分子探针的标记、核酸分子探针的标记 核酸分子探针（也称基因探针）：指能与特定核核酸分子探针（也称基因探针）：指能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核苷酸片段，可用于苷酸序列发生特异性互补的已知核苷酸片段，可用于检测待测样品中特定的基因序列。要实现对核酸探针检测待测样品中特定的基因序列。要实现对核酸探针的有效探测，探针分子必须带有一定的示踪物。的有效探测，探针分子必须带有一定的示踪物。2 2、探针的种类及其选择、探针的种类及其选择 根据核酸探针的来源及性质可分为基因组根据核酸探针的来源及性质可分

17、为基因组DNADNA探针、探针、cDNAcDNA探针、探针、cRNAcRNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。根据实验目的和要求的不同，可以选择不同类型的核酸探根据实验目的和要求的不同，可以选择不同类型的核酸探针。选择探针首先必须考虑探针是否具有高度的特异性，针。选择探针首先必须考虑探针是否具有高度的特异性，其次是探针来源是否方便，同时还必须了解各类探针自身其次是探针来源是否方便，同时还必须了解各类探针自身的一些特点。如克隆的基因片段及聚合酶链反应（的一些特点。如克隆的基因片段及聚合酶链反应（PCRPCR）产物均为获得大量高纯度的产物均为获得大量高纯度的D

18、NADNA探针提供了甚为方便的来探针提供了甚为方便的来源，选择此类基因组源，选择此类基因组DNADNA探针时，要特别注意真核生物基探针时，要特别注意真核生物基因组中存在的高度重复序列，由于探针中存在高度重复序因组中存在的高度重复序列，由于探针中存在高度重复序列可造成的非特异性杂交而出现假阳性结果，因此列可造成的非特异性杂交而出现假阳性结果，因此,要尽要尽可能选用基因的编码序列（外显子）作为探针。可能选用基因的编码序列（外显子）作为探针。cDNAcDNA中由中由于不存在内含子及其它高度重复序列，是一种较为理想的于不存在内含子及其它高度重复序列，是一种较为理想的核酸探针。核酸探针。3 3、标记物的

19、选择、标记物的选择 标记物大致可分为放射性核素类和非放射性核标记物大致可分为放射性核素类和非放射性核素类。由于放射性核素的灵敏度高，可检测样品中素类。由于放射性核素的灵敏度高，可检测样品中少于少于10001000个分子的核酸含量，因而是目前应用最多个分子的核酸含量，因而是目前应用最多的一类核酸分子探针标记物。非放射性核素类的标的一类核酸分子探针标记物。非放射性核素类的标记物有生物素、地高辛等。应用这类标记物标记的记物有生物素、地高辛等。应用这类标记物标记的核酸分子探针虽可以存放较长的时间，使用时也没核酸分子探针虽可以存放较长的时间，使用时也没有辐射危害，但这些标记物对核酸分子都有一定的有辐射危

20、害，但这些标记物对核酸分子都有一定的修饰作用，方法学的灵敏度不如放射性核素。常用修饰作用，方法学的灵敏度不如放射性核素。常用放射性核素有放射性核素有3232P P、3535P P、3 3H H、125125I I、1414C C等，具体应选等，具体应选用何种放射性核素应根据实验对敏感性和分辨力的用何种放射性核素应根据实验对敏感性和分辨力的要求、标记方法以及核素的特点等因素来决定。要求、标记方法以及核素的特点等因素来决定。、DNADNA的缺口平移法：的缺口平移法：缺口平移法是一种快速、简便缺口平移法是一种快速、简便的以双链的以双链DNADNA为底物的为底物的 DNA DNA探针标记法，已有药盒供

21、应，探针标记法，已有药盒供应，最为常用。最为常用。首先，在大肠杆菌脱氧核糖核酸酶首先，在大肠杆菌脱氧核糖核酸酶I I（DNase IDNase I）作用下，在双链作用下，在双链 DNA DNA上随机切出若干个单链具有上随机切出若干个单链具有33羟羟基本端和基本端和55磷酸基末端的缺口，然后利用大肠杆菌磷酸基末端的缺口，然后利用大肠杆菌DNADNA聚合酶的聚合酶的5353外切酶活性在缺口的外切酶活性在缺口的55末端从末端从53 53 方向将旧链方向将旧链55末端逐步切除，同时在该酶末端逐步切除，同时在该酶5353聚合聚合酶活性的催化下，顺序将酶活性的催化下，顺序将dNTPdNTP连接到切口的连接

22、到切口的33末端末端-OH-OH上，以互补的上，以互补的DNADNA单链为模板合成新的单链为模板合成新的DNADNA单链。在此单链。在此过程中，反应体系中的过程中，反应体系中的3232P-dNTPP-dNTP便均匀地参入到新合成便均匀地参入到新合成的的DNADNA链中，从而形成高比活性的链中，从而形成高比活性的DNADNA探针。探针。4 4、核酸探针标记方法、核酸探针标记方法、随机引物法：、随机引物法：首先制备各种组合的寡核苷酸片段首先制备各种组合的寡核苷酸片段混合物，将它们与经过变性处理并作为模板的混合物，将它们与经过变性处理并作为模板的DNADNA混合，混合，其中必有可与模板其中必有可与模

23、板DNADNA杂交的寡核苷酸片段，可以起引杂交的寡核苷酸片段，可以起引物作用，称为随机引物。在大肠杆菌物作用，称为随机引物。在大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I大片大片段（段（KlenowKlenow片段）催化下，反应液中含有的片段）催化下，反应液中含有的3232P-dNTPP-dNTP便可参人到新合成的便可参人到新合成的DNADNA中，形成放射性核素标记的中，形成放射性核素标记的DNADNA探针。探针。该法较之缺口平移法有以下特点：除能进行双该法较之缺口平移法有以下特点：除能进行双链链DNADNA标记外，也可用于单链标记外，也可用于单链DNADNA和和RNARNA探针的标记。探针的标记。

24、当以当以mRNAmRNA为模板时，必须使用反转录酶，产物为单链为模板时，必须使用反转录酶，产物为单链cDNAcDNA。标记方法更为简便，可获更高比活度的标记。标记方法更为简便，可获更高比活度的标记产物。因而，近年来有取代缺口平移法的趋势。产物。因而，近年来有取代缺口平移法的趋势。单链单链DNADNA探针的标记：探针的标记：一般多在以一般多在以M M1313噬菌体为噬菌体为载体的重组载体的重组DNADNA上进行，成熟的上进行，成熟的M M1313噬菌体噬菌体DNADNA以以单链环状存在，此为合成第二条互补单链环状存在，此为合成第二条互补DNADNA链提供链提供了条件。了条件。M M1313载体载

25、体DNADNA中有一称为多克隆位点中有一称为多克隆位点（polylinkerpolylinker）的片段，在该片段中有一系列）的片段，在该片段中有一系列限制性内切酶切点，外源性限制性内切酶切点，外源性DNADNA可插人此区域内。可插人此区域内。临近多克隆位点的临近多克隆位点的33端有端有LacZLacZ基因序列，目前基因序列，目前有市售的互补于该序列的通用引物。借助该引有市售的互补于该序列的通用引物。借助该引物，在有物，在有3232P-dNTPP-dNTP存在的条件下，利用大肠杆菌存在的条件下，利用大肠杆菌聚合酶聚合酶I KlenowI Klenow片段催化延伸反应，可获得与片段催化延伸反应，

26、可获得与任何插入的外源性任何插入的外源性DNADNA互补的互补的DNADNA探针。探针。cDNAcDNA探针的标记：探针的标记：来源于鸟类髓母细胞病来源于鸟类髓母细胞病毒（毒（AMVAMV）的逆转录酶是一种依赖于）的逆转录酶是一种依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶，具有聚合酶，具有5353聚合酶活性及聚合酶活性及RNARNADNADNA杂交体特异的杂交体特异的Rnase HRnase H活性。当有活性。当有RNARNA模板、引物（根据情况可选用模板、引物（根据情况可选用Olig-dTOlig-dT或随或随机引物）、四种脱氧核糖核苷三磷酸（机引物）、四种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPdNTP

27、）（其中一种为放射性标记物）存在时，该酶（其中一种为放射性标记物）存在时，该酶可催化合成与可催化合成与RNARNA互补的标记互补的标记 cDNA cDNA探针。探针。二、核酸分子杂交技术二、核酸分子杂交技术 核酸分子杂交：核酸分子杂交：指具有一定同源性的核酸单链指具有一定同源性的核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）按碱在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）按碱基互补原则形成异源双链的过程。由于它具有高度基互补原则形成异源双链的过程。由于它具有高度的特异性和灵敏性，能用来检测不同核酸间碱基顺的特异性和灵敏性，能用来检测不同核酸间碱基顺序的同一性和差异性，可广泛应用于基因克隆的筛序的

28、同一性和差异性，可广泛应用于基因克隆的筛选、基因突变的分析以及疾病诊断等诸多方面。选、基因突变的分析以及疾病诊断等诸多方面。(一）基本原理一）基本原理 DNA DNA双螺旋结构中的两条互补链通过配对的碱基双螺旋结构中的两条互补链通过配对的碱基之间的氢键和疏水键联结在一起。当加热或加碱使之间的氢键和疏水键联结在一起。当加热或加碱使双链双链DNADNA间的氢键破坏而形成单链的过程称为变性间的氢键破坏而形成单链的过程称为变性（denaturationdenaturation）。）。DNA DNA双链开始解开后，其溶液吸收紫外线的能力增强，双链开始解开后，其溶液吸收紫外线的能力增强，并随温度的升高而增

29、大，通常把增值等于最大值一半时并随温度的升高而增大，通常把增值等于最大值一半时的温度称为的温度称为DNADNA的的熔点温度熔点温度（melting-temperaturemelting-temperature，TmTm）。若温度缓慢冷却至室温，被解离的）。若温度缓慢冷却至室温，被解离的DNADNA互补链间又互补链间又可再形成双链状态，这一过程称为可再形成双链状态，这一过程称为复性复性，又称退火。如，又称退火。如果两条单链核酸分子来源不同，只要它们的碱基序列是果两条单链核酸分子来源不同，只要它们的碱基序列是同源的或部分地同源，则在一定条件下可以全部或部分同源的或部分地同源，则在一定条件下可以全部

30、或部分地复性，这就是地复性，这就是分子杂交分子杂交。分子杂交可发生在。分子杂交可发生在DNADNA与与DNADNA，或或DNADNA与与RNARNA，或，或RNARNA与与RNARNA之间。在核酸分子杂交技术中，之间。在核酸分子杂交技术中，杂交的双方是待测的核酸序列及探针。待测的核酸可以杂交的双方是待测的核酸序列及探针。待测的核酸可以是克隆化的基因片段，也可以是未克隆的基因组是克隆化的基因片段，也可以是未克隆的基因组DNADNA和细和细胞总胞总RNARNA；而用于检测的已知核酸片段称为探针。为了便；而用于检测的已知核酸片段称为探针。为了便于示踪和检测，探针常带有一定的标记，以放射性核素于示踪和

31、检测，探针常带有一定的标记，以放射性核素标记的探针最为常用。标记的探针最为常用。（二）杂交类型（二）杂交类型 分子杂交可分为固相杂交和液相杂交二种类型，两分子杂交可分为固相杂交和液相杂交二种类型，两种类型虽有各自的特点，但一般均包括以下几个主要过种类型虽有各自的特点，但一般均包括以下几个主要过程：制备核酸分子探针程：制备核酸分子探针处理待测核酸样品处理待测核酸样品杂交反应杂交反应及杂交后漂洗及杂交后漂洗放射自显影检查或放射性测量放射自显影检查或放射性测量结果分结果分析。以下将主要介绍固相杂交技术。析。以下将主要介绍固相杂交技术。固相杂交是待测的核酸样品结合在一定的固相支持固相杂交是待测的核酸样

32、品结合在一定的固相支持物（常用的有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜等）上，然后与物（常用的有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜等）上，然后与存在于液相中的标记探针进行杂交反应的方法，常见的存在于液相中的标记探针进行杂交反应的方法，常见的有有SouthernSouthern印迹杂交、印迹杂交、NothernNothern印迹杂交、斑点杂交和原印迹杂交、斑点杂交和原位杂交等。位杂交等。1、Southern印迹分析法：印迹分析法：是由英国爱丁堡大学的是由英国爱丁堡大学的Edwin SouthernEdwin Southern于于19771977年年提出的一种检查基因组中提出的一种检查基因组中DNADNA特异序列的方法，可

33、用于特异序列的方法，可用于分析基因的结构、基因的同源性、基因的拷贝数等；分析基因的结构、基因的同源性、基因的拷贝数等；在此法的基础上联合使用限制性内切酶而建立的限制在此法的基础上联合使用限制性内切酶而建立的限制性内切酶谱分析法和性内切酶谱分析法和DNADNA限制性片段长度多态性分析法限制性片段长度多态性分析法可用于点突变及遗传性疾病的诊断等。具体包括下列可用于点突变及遗传性疾病的诊断等。具体包括下列5 5个步骤：个步骤：l l）酶解）酶解 将提取的将提取的DNADNA用限制性内切酶酶解成一定用限制性内切酶酶解成一定 大小的片断。大小的片断。2 2）电泳）电泳 将酶解的将酶解的DNADNA片断在

34、琼脂糖凝胶上进行电片断在琼脂糖凝胶上进行电 泳，依片断的大小而分离之。泳，依片断的大小而分离之。3 3）转移）转移 电泳后用碱处理使凝胶中的电泳后用碱处理使凝胶中的DNADNA变成单链变成单链的的DNADNA，然后利用毛细管作用或负压装置使单链的，然后利用毛细管作用或负压装置使单链的DNADNA转移至硝酸纤维滤膜或尼龙膜上，并真空烘干以转移至硝酸纤维滤膜或尼龙膜上，并真空烘干以固定固定DNADNA，也可经紫外线照射使核酸与尼龙交联。，也可经紫外线照射使核酸与尼龙交联。4 4）杂交）杂交 将已知序列的放射性核素标记探针溶液滴将已知序列的放射性核素标记探针溶液滴加在固定有加在固定有DNADNA的膜

35、片上，使探针与同源的的膜片上，使探针与同源的DNADNA序列序列碱基配对结合形成杂交分子，然后将非特异性及未碱基配对结合形成杂交分子，然后将非特异性及未杂交的放射性核素洗涤干净。杂交的放射性核素洗涤干净。5 5）放射性自显影）放射性自显影 薄膜晾干后，用保鲜纸包好，再薄膜晾干后，用保鲜纸包好，再与与X X线胶片叠放在一起，压紧于暗盒中置一线胶片叠放在一起，压紧于暗盒中置一7070超低超低温冰箱曝光，最后将温冰箱曝光，最后将X X线胶片显影、定影，即可得杂线胶片显影、定影，即可得杂交交DNADNA条带的放射自显影像。条带的放射自显影像。2、Nothern印迹杂交法：印迹杂交法：NothernNo

36、thern印迹系用印迹系用DNADNA探针来检测特异性序列探针来检测特异性序列RNARNA的一种印迹方法，主要用于检测特异的一种印迹方法，主要用于检测特异mRNAmRNA，以分析该，以分析该基因的表达基因的表达mRNAmRNA分子的大小及对其进行粗略定量等。分子的大小及对其进行粗略定量等。与与SouthernSouthern相对应，该法被有趣地称为相对应，该法被有趣地称为NothernNothern印迹印迹法。其方法也大致包括以下法。其方法也大致包括以下5 5个步骤：即个步骤：即RNARNA提取、提取、RNARNA变性琼脂糖凝胶电泳、转移、杂交和放射自显影。变性琼脂糖凝胶电泳、转移、杂交和放射

37、自显影。后三步与后三步与SouthernSouthern印迹基本相同。细胞的总印迹基本相同。细胞的总RNARNA和和mRNAmRNA均可作均可作NouthernNouthern印迹，在提取中应严格防止印迹，在提取中应严格防止RNARNA的降解。的降解。RNARNA虽然是单链分子，但具有分子内局部双虽然是单链分子，但具有分子内局部双螺旋结构，所以在电泳时需要将局部双螺旋破坏，使螺旋结构，所以在电泳时需要将局部双螺旋破坏，使其成线性单链，否则会影响分子杂交。常用的变性剂其成线性单链，否则会影响分子杂交。常用的变性剂有甲醛、乙二醛等。有甲醛、乙二醛等。三、三、DNADNA序列分析技术序列分析技术 D

38、NADNA序列分析是研究基因结构和功能以及表达调序列分析是研究基因结构和功能以及表达调控的重要手段，目前已成为一般实验室的常规操作。控的重要手段，目前已成为一般实验室的常规操作。DNADNA序列测定需要经过二个基本步骤：序列测定需要经过二个基本步骤：DNADNA片段的制备及扩增：序列分析一次能测定的长片段的制备及扩增：序列分析一次能测定的长度是有限的，故先要将巨大的度是有限的，故先要将巨大的DNADNA分子处理成能用于分子处理成能用于测定的较小片段（一般为测定的较小片段（一般为 300 300500bp500bp）。这一过程）。这一过程需借助于限制性内切酶（需借助于限制性内切酶（restric

39、tion enzymerestriction enzyme）技术，）技术，这类酶能在某特异位点（一般以这类酶能在某特异位点（一般以4 46 6个碱基对为识别个碱基对为识别标志）将标志）将DNADNA链切断，产生一定长度的所谓限制性内链切断，产生一定长度的所谓限制性内切酶切酶DNADNA片段。若被测片段。若被测DNADNA片段来自真核基因，因其在片段来自真核基因，因其在基因组基因组DNADNA中所占的比例很小，难以达到测定要求的中所占的比例很小，难以达到测定要求的DNADNA量，为此必须对被测量，为此必须对被测 DNA DNA片段进行扩增，即增加片段进行扩增，即增加 DNADNA片段的拷贝数。片

40、段的拷贝数。DNADNA序列分析：即测定经上述步骤处理后的序列分析：即测定经上述步骤处理后的DNADNA片段。片段。目前被广泛采用的测序方法有两种：目前被广泛采用的测序方法有两种：SangerSanger双脱氧法双脱氧法测序和化学法测序。测序和化学法测序。DNADNA序列分析在医学领域中也具序列分析在医学领域中也具有很大的应用潜力，一些遗传性疾病、肿瘤等的发生有很大的应用潜力，一些遗传性疾病、肿瘤等的发生往往与往往与DNADNA一级结构的损伤和突变有关，而一级结构的损伤和突变有关，而DNADNA序列分序列分析将有助于阐明这些疾病发生的分子机制。例如，与析将有助于阐明这些疾病发生的分子机制。例如

41、，与正常细胞中的正常细胞中的c-rasc-rasH H相比，从人膀胱癌细胞系相比，从人膀胱癌细胞系EJT24EJT24和和肺癌细胞系肺癌细胞系 HS242 HS242以及恶性黑色素瘤细胞中分离出来以及恶性黑色素瘤细胞中分离出来的癌基因的癌基因c-rasc-rasH H仅有一个碱基由仅有一个碱基由G G转变成转变成T T，从而导致，从而导致第第1212位甘氨酸被即颉氨酸取代。点突变虽然只引起一位甘氨酸被即颉氨酸取代。点突变虽然只引起一个氨基酸的变化，但却可影响蛋白质构型和功能的改个氨基酸的变化，但却可影响蛋白质构型和功能的改变，从而引起细胞发生代谢紊乱而癌变。变，从而引起细胞发生代谢紊乱而癌变。

42、四、重组四、重组DNADNA和基因工程和基因工程 重组重组 DNA DNA（recombinant DNArecombinant DNA）技术是采用分子）技术是采用分子生物学的方法在试管内有目的地切割分离纯化或人工生物学的方法在试管内有目的地切割分离纯化或人工合成的合成的DNADNA分子和相应的载体，并将其拼接成重组分子和相应的载体，并将其拼接成重组DNADNA后导人合适的宿主细胞中，使之大量扩增形成克隆，后导人合适的宿主细胞中，使之大量扩增形成克隆，并表达基因产物。这项技术也常称为基因的分子克隆并表达基因产物。这项技术也常称为基因的分子克隆（molecular cloningmolecula

43、r cloning）或基因克隆（）或基因克隆（gene gene cloningcloning）；由于重组）；由于重组 DNA DNA技术是人为设计的、类似技术是人为设计的、类似一个连续复杂的工程，一般就把它称为基因工程一个连续复杂的工程，一般就把它称为基因工程（genetic engineeringgenetic engineering）。）。应用重组应用重组DNADNA技术，人们可以分别建立基因组文技术，人们可以分别建立基因组文库和库和cDNAcDNA文库，通过目的基因的克隆，获得足够的文库，通过目的基因的克隆，获得足够的目的基因片段。这些目的基因片段可有下列用途：目的基因片段。这些目的基

44、因片段可有下列用途：制备核酸分子杂交中的探针；用作基因转移和基因制备核酸分子杂交中的探针；用作基因转移和基因治疗的目的基因；用作序列分析和基因的结构与功治疗的目的基因；用作序列分析和基因的结构与功能的研究；此外，该目的基因片段还可用作基因工能的研究；此外，该目的基因片段还可用作基因工程的部件，通过基因克隆的高效表达，大量制取有程的部件，通过基因克隆的高效表达，大量制取有重要应用价值的蛋白质、多肽等产品。重要应用价值的蛋白质、多肽等产品。1 1、基因诊断、基因诊断 基因诊断是对受检者的某一特定基因和基因诊断是对受检者的某一特定基因和（或）其转录物进行分析和检测，从而对相应的疾病（或）其转录物进行

45、分析和检测，从而对相应的疾病进行诊断。目前基因诊断的方法很多，但基本过程大进行诊断。目前基因诊断的方法很多，但基本过程大体一致：首先分离、扩增待测的基因片段，然后利用体一致：首先分离、扩增待测的基因片段，然后利用适当的分析手段，区分或鉴定异常的适当的分析手段，区分或鉴定异常的DNADNA或或RNARNA。（1 1）遗传性疾病的诊断：）遗传性疾病的诊断：在遗传性疾病的基因诊断在遗传性疾病的基因诊断中，可用基因探针直接检测遗传的基因的缺陷或间接中，可用基因探针直接检测遗传的基因的缺陷或间接分析与分析与DNADNA多态性紧密连锁的遗传病。例如，地中海多态性紧密连锁的遗传病。例如，地中海贫血大多是由于

46、贫血大多是由于珠蛋白基因的缺失所致。珠蛋白基因的缺失所致。（2 2）在肿瘤研究中的应用：）在肿瘤研究中的应用：1983 1983年年WeinbergWeinberg等人首等人首先从人的膀胱癌中鉴定出致癌基因先从人的膀胱癌中鉴定出致癌基因-H-ras-H-ras癌基因，癌基因，从而开辟了癌基因研究的新纪元从而开辟了癌基因研究的新纪元 。2 2、基因治疗、基因治疗 通过合适的基因载体将正常有功能的通过合适的基因载体将正常有功能的外源基因导人生物体的靶细胞内，以弥补或纠正其基外源基因导人生物体的靶细胞内，以弥补或纠正其基因缺陷，达到治疗疾病的目的。截止因缺陷，达到治疗疾病的目的。截止19971997

47、年底，接受年底，接受基因治疗的病人已达基因治疗的病人已达1 1千余人，疾病类型涉及遗传性千余人，疾病类型涉及遗传性疾病、恶性肿瘤、心血管系统疾病及感染性疾病等。疾病、恶性肿瘤、心血管系统疾病及感染性疾病等。目前，对一些单基因缺陷（如腺苷脱氢酶缺陷）引起目前，对一些单基因缺陷（如腺苷脱氢酶缺陷）引起的遗传性疾病的基因治疗已取得了肯定的疗效。的遗传性疾病的基因治疗已取得了肯定的疗效。3 3、转基因动物、转基因动物 转基因动物是指以实验方法导入外转基因动物是指以实验方法导入外源基因使其在染色体基因组内稳定整合并能遗传给后源基因使其在染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物，用这种方法可建立转基

48、因动物模型以代的一类动物，用这种方法可建立转基因动物模型以研究外源基因在整体动物中表达调控的规律，或可用研究外源基因在整体动物中表达调控的规律，或可用转基因动物产生人类所需的生物活性物质。转基因动物产生人类所需的生物活性物质。4 4、基因工程蛋白、基因工程蛋白 目前在世界范围内已经开发或正目前在世界范围内已经开发或正在开发的医用蛋白、多肽药物和疫苗估计在在开发的医用蛋白、多肽药物和疫苗估计在100100种以种以上，其中已经投入市场的就有：胰岛素、干扰素、白上，其中已经投入市场的就有：胰岛素、干扰素、白细胞介素、生长素、乙型肝炎疫苗等几十种。更引人细胞介素、生长素、乙型肝炎疫苗等几十种。更引人注

49、目的是，目前正在研制的多价注目的是，目前正在研制的多价BCGBCG疫苗，在该疫苗，在该BCGBCG中中插入了插入了2020余种病毒、细菌和寄生虫的基因，可望达到余种病毒、细菌和寄生虫的基因，可望达到一次免疫接种极低剂量重组的多价一次免疫接种极低剂量重组的多价BCGBCG疫苗，便能同疫苗，便能同时预防多种疾病的目的；通过基因工程技术，还可以时预防多种疾病的目的；通过基因工程技术，还可以对重组的蛋白质进行定向改造，而赋予蛋白质新的性对重组的蛋白质进行定向改造，而赋予蛋白质新的性状和特性，这便是在基因工程基础上发展起来的蛋白状和特性，这便是在基因工程基础上发展起来的蛋白质工程（质工程（protein

50、 engineeringprotein engineering）。）。复复 习习 题题 一、基本概念一、基本概念 核医学、核素、同位素、同质异能素、放射性核素、核医学、核素、同位素、同质异能素、放射性核素、ECEC（电子俘获）、物理半衰期、放射性活度、放射性（电子俘获）、物理半衰期、放射性活度、放射性比活度、电离与激发、韧致辐射、湮没辐射、光电效比活度、电离与激发、韧致辐射、湮没辐射、光电效应、电子对生成、核医学仪器、随机效应、确定性效应、电子对生成、核医学仪器、随机效应、确定性效应、开放源、封闭源、外照射、内照射、随机效应、应、开放源、封闭源、外照射、内照射、随机效应、确定性效应、放射化学纯