分子生物学基础理论概要和常用实验技术简介课件.ppt

1、 20210426 分子生物学根底分子生物学根底理论概要和常用实验技术简介理论概要和常用实验技术简介报告主要内容 分子生物学概要 几个分子生物学理论知识点 常用分子生物学实验技术 生物信息学简介一、什么是分子生物学？一、什么是分子生物学？二、分子生物学内容和原理二、分子生物学内容和原理三、主要的理论成就三、主要的理论成就四、主要的应用成就四、主要的应用成就五、技术进步五、技术进步分子生物学概要分子生物学概要一、什么是分子生物学？一、什么是分子生物学？从分子水平上研究生命现象物质从分子水平上研究生命现象物质根底的学科。研究细胞成分的物理、化根底的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些

2、性质和变化与学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，生命现象的关系，如遗传信息的传递，基因的构造、复制、转录、翻译、表达基因的构造、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。信号的转导等。分子生物学概要分子生物学概要核酸的分子生物学核酸的分子生物学研究内容包括核酸研究内容包括核酸/基因组的构造、遗传信息的复制、转基因组的构造、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的开展和应用等。和基因工程技术的开展和应用等。蛋白质的

3、分子生物学蛋白质的分子生物学蛋白质的分子生物学研究执行各生命功能的主要分子蛋白质的分子生物学研究执行各生命功能的主要分子蛋白质的构造与功能。蛋白质的构造与功能。信号转导的分子生物学信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子根底。在一些外源研究细胞内、细胞间信息传递的分子根底。在一些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变一系列的生物信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、磷酸化以及蛋白与化学变化，例如蛋白质构象的转变、磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适

4、应内外环境的需要。信号转导研究的态等发生改变以适应内外环境的需要。信号转导研究的目标是说明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导目标是说明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。式以及认识各种途径间的网络控制系统。二、分子生物学内容和根本原理二、分子生物学内容和根本原理根本原理：根本原理：构成生物体各类有机大分子的单体在不同生构成生物体各类有机大分子的单体在不同生物中都是一样的。物中都是一样的。大分子建成规那么一样。大分子建成规那么一样。某一特定生物体所拥有的核酸及

5、蛋白质分子某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定决定 了它的属性。了它的属性。三、主要的理论成就1、DNA双螺旋模板学说双螺旋模板学说2、遗传中心法那么、遗传中心法那么3、基因表达调控理论、基因表达调控理论 操纵子模型操纵子模型4、基因学说的丰富和开展、基因学说的丰富和开展 基因现代概念确实立基因现代概念确实立5、基因突变理论、基因突变理论6、基因作图理论、基因作图理论7、分子进化学说、分子进化学说8、信号转导学说、信号转导学说9、细胞周期调控理论、细胞周期调控理论10、癌变的分子机制、癌变的分子机制11、通用遗传密码字典与、通用遗传密码字典与 非通用遗传密码字典非通用遗传密码字典12、生

6、物信息学、生物信息学13、基因组学与比较基因、基因组学与比较基因 组学组学14、“RNA世界假说世界假说15、细胞衰老和程序化死、细胞衰老和程序化死 亡机理亡机理 1已用基因工程的技术研制出了一批珍贵的基因工程药物：已用基因工程的技术研制出了一批珍贵的基因工程药物：人生长抑素人生长抑素 生产胰岛素生产胰岛素 生产生长激素生产生长激素 生产组织型血纤维蛋白溶酶原激活因子生产组织型血纤维蛋白溶酶原激活因子 抗血友病因子抗血友病因子 制备乙型肝炎疫苗制备乙型肝炎疫苗 生产多种细胞因子生产多种细胞因子 制备基因工程抗体制备基因工程抗体三、主要的理论成就2基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗 疾病诊断：

7、遗传病、肿瘤、病毒感染的疾病诊断：遗传病、肿瘤、病毒感染的诊断，具有特异诊断，具有特异 性高，适应性强的特点，常用方法有核性高，适应性强的特点，常用方法有核酸杂交、酸杂交、RFLP、PCR、DNA指纹图谱指纹图谱 法医诊断、亲子鉴定法医诊断、亲子鉴定 基因治疗：方法有将目的基因与逆转录基因治疗：方法有将目的基因与逆转录病毒重组、转染病毒重组、转染 受体细胞，使之表达以弥补缺陷；将目受体细胞，使之表达以弥补缺陷；将目的基因对染色体的基因对染色体 进展定位整合，即基因打靶；裸进展定位整合，即基因打靶；裸DNA直直接注射。接注射。2基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗 疾病诊断：遗传病、肿瘤、病毒感

8、染的疾病诊断：遗传病、肿瘤、病毒感染的诊断，具有特异诊断，具有特异 性高，适应性强的特点，常用方法有核性高，适应性强的特点，常用方法有核酸杂交、酸杂交、RFLP、PCR、DNA指纹图谱指纹图谱 法医诊断、亲子鉴定法医诊断、亲子鉴定 基因治疗：方法有将目的基因与逆转录基因治疗：方法有将目的基因与逆转录病毒重组、转染病毒重组、转染 受体细胞，使之表达以弥补缺陷；将目受体细胞，使之表达以弥补缺陷；将目的基因对染色体的基因对染色体 进展定位整合，即基因打靶；裸进展定位整合，即基因打靶；裸DNA直直接注射。接注射。(Southern/Northern/Western/FISH)6.基因克隆、基因文库基因

9、克隆、基因文库五、技术进步五、技术进步五、技术进步五、技术进步(Southern/Northern/Western/FISH)6.基因克隆、基因文库基因克隆、基因文库相关根底分子生物学理论相关根底分子生物学理论一、基因及基因突变一、基因及基因突变二、生物信息的传递中心法那么二、生物信息的传递中心法那么三、真核基因的表达与调控三、真核基因的表达与调控1、关于基因的概念关于基因的概念 基因的概念随着遗传学、分子生物学、生物化学等领域的开展而不断完善。从遗传学的角度看，基因是生物的遗传物质，是遗传的根本单位突变单位、重组单位和功能单位；从分子生物学的角度看，基因是负载特定遗传信息的DNA分子片段，在

10、一定条件下能够表达这种遗传信息，变成特定的生理功能。有的生物基因为RNA。2、从分子水平来说，基因有三个根本特性：、从分子水平来说，基因有三个根本特性：基因可自体复制；基因可自体复制；基因决定性状，即基因通过转录和翻译决定基因决定性状，即基因通过转录和翻译决定多肽链的氨基酸顺序，从而决定某种酶或蛋白多肽链的氨基酸顺序，从而决定某种酶或蛋白质的性质，而最终表达为某一性状质的性质，而最终表达为某一性状基因的突变，即基因虽很稳定，但也会发生基因的突变，即基因虽很稳定，但也会发生突变。一般来说，新的突变的等位基因一旦形突变。一般来说，新的突变的等位基因一旦形成，就可通过自体复制，在随后的细胞分裂中成，

11、就可通过自体复制，在随后的细胞分裂中保存下来。保存下来。3、基因的功能类型构造基因structural gene是可编码RNA或蛋白质的一段序列。构造基因的突变可导致特定蛋白质或酶一级构造的改变或影响蛋白质或酶量的改变。.调控基因regulator and control gene是指其产物参与调控其他构造基因表达的基因。调控基因的突变可以影响一个或多个构造基因的功能，或导致一个或多个蛋白质或酶时的改变。.重叠基因overlapping gene)指同一段DNA的编码顺序，由于阅读框架的不同或终止早晚的不同，同时编码两个或两个以上多肽链的基因。基因在染色体上可能有重叠，甚至一个基因完全存在于另

12、一个基因内部。断裂基因或隔裂基因split gene),指一个构造基因内部为一个或者更多的不翻译的编码顺序。外显子：参加蛋白质编码的DNA片段；内含子：不参加蛋白质编码的DNA片段。有的真核生物基因可能是不同外显子的组合断裂基因。真核生物基因的典型构造真核生物基因的典型构造跳跃基因(jumping gene)又称为转座(transposon)、转座因子、转位因子(transposable element)，指可作为插入因子和转座因子移动的DNA序列。假基因pseudogene，同的基因相似，但位于不同位点，因缺失或突变而不能转绿或翻译，是没有功能的基因。基因突变基因突变(gene mutati

13、on)：染色体上某一基因位点内：染色体上某一基因位点内部发生了化学性质部发生了化学性质(构造构造)的变化，与原来基因形成对性的变化，与原来基因形成对性关系。关系。例如：植物高秆基因例如：植物高秆基因D突变为矮秆基因突变为矮秆基因d。经典遗传学认为：基因是一个经典遗传学认为：基因是一个“点，在染色体上具有点，在染色体上具有一定的位置和相互排列关系。而基因突变就是一个点的一定的位置和相互排列关系。而基因突变就是一个点的改变，是以一个整体进展突变。因此从经典遗传学水平改变，是以一个整体进展突变。因此从经典遗传学水平看，基因突变又称为看，基因突变又称为“点突变点突变(point mutation)。l

14、ocus与与site现代基因概念认为：基因是现代基因概念认为：基因是DNA分子带有遗传信息的碱分子带有遗传信息的碱基序列；基因是由众多碱基对构成，此时将一个碱基对基序列；基因是由众多碱基对构成，此时将一个碱基对称为基因的一个座位称为基因的一个座位(site)；基因在染色体上的位置那么；基因在染色体上的位置那么称为位点称为位点(locus)。4、基因突变、基因突变人的自然突变频率为：人的自然突变频率为：110-4110-6。5、基因突变的类型根据基因构造的改变方式：碱基替换突变；碱基倒位；移码(插入与缺失)突变根据突变所引起的表型改变分为：根据突变所引起的表型改变分为：形态突变型；形态突变型；生

15、化突变型；生化突变型；致死突变型；致死突变型；条件致死突变型条件致死突变型从DNA碱基序列改变的多少：单点突变(替换)；与经典遗传学的点突变point mutation比较.多点突变(移码)。从突变所引起的遗传信息意义的改变：错义突变missense mutation:是指DNA分子中碱基改变后引起密码子变化。导致所编码的氨基酸发生替代，从而影响蛋白质功能，以至影响到突变体的表型。无义突变nonsense mutation:是指由于DNA的碱基改变导致编码氨基酸的密码子突变成终止密码子。引起mRNA 翻译提前终止，产生一条短的不完整的多肽链。无义突变通常对所编码的蛋白活性有严重影响。同义突变同

16、义突变(沉默突变沉默突变 silent mutation silent mutation:是指是指DNADNA分分子中的碱基改变后，突变的密码子仍然编码原来的氨子中的碱基改变后，突变的密码子仍然编码原来的氨基酸，并没有引起多肽链中氨基酸的变化。基酸，并没有引起多肽链中氨基酸的变化。不会引起表型突变，它们以多态的形式在生物体不会引起表型突变，它们以多态的形式在生物体DNADNA中中积累，引起同种生物不同个体间积累，引起同种生物不同个体间DNADNA序列的变化。序列的变化。延长肽链突变：延长肽链突变：终止密码子突变成氨基酸的密码子。终止密码子突变成氨基酸的密码子。1、中心法那么及其开展 中心法那么

17、(central dogma)阐述生物世代、个体以及从遗传物质到性状的遗传信息流向，即遗传信息在遗传物质复制、性状表现过程中的信息流向。最初由Crick提出，并经过了屡次修正。反转录(逆转录)：反转录酶；cDNA。RNA的自我复制。DNA指导蛋白质合成。2、遗传密码及其特性 三联性；非重叠性；连续性；简并性；有序性；通用性。遗传密码的根本特性：起始密码子与终止密码子：起始密码子：AUG(甲硫氨酸/甲酰甲硫氨酸)；终止密码子(无义密码子)：UAA(赭石)、UAG(琥珀)、UGA(蛋白石)。通用性的另外情况：2、遗传密码及其特性三、真核基因的表达调控三、真核基因的表达调控 诱发基因转录的信号、基因

18、调控在哪一步(模板DNA的转录、mRNA的成熟或蛋白质合成)实现不同水平基因调控的分子机制是研究基因调控的三个主要内容。a DNA水平的基因表达调控 b 转录水平的基因表达调控 c 转录产物的加工转运调控 d 翻译水平的基因表达调控三个主要内容：三个主要内容：1.1.真核生物基因组构造特点真核生物基因组构造特点1基因组大，基因多，存在大量重复序列，大局部与基因组大，基因多，存在大量重复序列，大局部与组蛋白和非组蛋白结合在一起；组蛋白和非组蛋白结合在一起；2基因主要以单顺反子形式存在；基因主要以单顺反子形式存在；3多数基因是断裂的；多数基因是断裂的；4存在基因家族；存在基因家族；5基因表达的调控

19、位点多，位置多样化；基因表达的调控位点多，位置多样化；6局部基因组序列存在重排、扩增、丧失等规律性变局部基因组序列存在重排、扩增、丧失等规律性变化。化。2 转录水平的基因表达调控转录水平的基因表达调控 2.1 顺式作用元件顺式作用元件2.2 反式作用因子反式作用因子 2.3 真核基因转录调控的主要模式真核基因转录调控的主要模式2.1 顺式作用元件顺式作用元件2.1.1 根本概念根本概念顺式作用元件顺式作用元件(cis-acting elements)基因周围能与特异转录因子结合而影响基因基因周围能与特异转录因子结合而影响基因转录的转录的DNA序列。序列。顺式作用顺式作用(cis-acting)

20、顺式作用元件对基因表达起调控作用的过程。顺式作用元件对基因表达起调控作用的过程。2.1.2 顺式作用元件的分类顺式作用元件的分类1启动子启动子2增强子增强子3绝缘子绝缘子4转座子转座子5其他应答元件其他应答元件 1启动子启动子(Promoter)定义定义 作用特点作用特点 作用机制作用机制 分类分类 定义定义 位于转录起始点附近且为转录起始所必需的位于转录起始点附近且为转录起始所必需的DNA序列。序列。作用特点作用特点 一个基因可同时拥有一个及以上启动子；一个基因可同时拥有一个及以上启动子；位置不定，一般在转录起始点上游；位置不定，一般在转录起始点上游；可与增强子共同控制转录起始和强度；可与增

21、强子共同控制转录起始和强度；发挥功能时除需发挥功能时除需RNARNA聚合酶外，还需转录调控因子与聚合酶外，还需转录调控因子与启动子启动子区各种调控元件相互作用。区各种调控元件相互作用。作用机制作用机制 通过直接与通过直接与RNA聚合酶相互作用，或结合于聚合酶相互作用，或结合于启动子关键元件上的蛋白质因子与启动子关键元件上的蛋白质因子与RNA聚合酶的聚合酶的直接或间接作用，使得直接或间接作用，使得RNA聚酶处于适于转录起聚酶处于适于转录起始的位置，从而利于转录起始。始的位置，从而利于转录起始。分类分类 细胞特异启动子细胞特异启动子 诱导型启动子诱导型启动子 通用启动子通用启动子2增强子增强子(e

22、nhancer)定义定义 作用特点作用特点 作用机制作用机制 分类分类 定义定义 指位于离转录起始点较远位置上，具有参与激活和指位于离转录起始点较远位置上，具有参与激活和增强起始功能的序列元件。增强起始功能的序列元件。作用特点作用特点 增强效应显著；增强效应显著；增强效应与其位置和取向无关；增强效应与其位置和取向无关；要有启动子才能发挥作用；要有启动子才能发挥作用；须与特定蛋白质因子结合才能发挥作用；须与特定蛋白质因子结合才能发挥作用；一般具有组织或细胞特异性；一般具有组织或细胞特异性；无基因专一性。无基因专一性。增强子的作用机制增强子的作用机制 通过提高启动子附近激活剂浓度而起作用。通过提高

23、启动子附近激活剂浓度而起作用。当它被约束在启动子附近时，可在任何位置起当它被约束在启动子附近时，可在任何位置起作用。作用。三种可能的作用方式：三种可能的作用方式：可影响模板附近的可影响模板附近的DNA双螺旋构造；双螺旋构造；将模板固定在细胞核内特定位置；将模板固定在细胞核内特定位置；增强子区可以作为反式作用因子或增强子区可以作为反式作用因子或RNA聚聚合酶合酶进入染色质特定构造的入口。进入染色质特定构造的入口。增强子的种类增强子的种类 细胞特异性增强子细胞特异性增强子 诱导性增强子诱导性增强子 通用增强子通用增强子 一种负调控元件，参与基因表达的负调控。其作用可不受序列方向影响，能远距离发挥作

24、用。3绝缘子绝缘子(Insulator)4转座子转座子transposon 能将自己插入基因组中新的位置的能将自己插入基因组中新的位置的DNA序列。序列。反式作用因子反式作用因子(trans-acting factor)一种基因的一种基因的RNA或蛋白质产物，能影响位或蛋白质产物，能影响位于基因组另一条染色体上的或基因组别处于基因组另一条染色体上的或基因组别处的另一个基因的活性。的另一个基因的活性。反式作用反式作用(trans-acting)反式作用因子对基因表达起调控作用的过反式作用因子对基因表达起调控作用的过程。程。2.2.1 根本概念根本概念2.2.2 转录因子的类型转录因子的类型1根本

25、转录因子根本转录因子(Basal factor)和和RNA聚合酶一起结合于转录起始点和聚合酶一起结合于转录起始点和TATA盒；盒；2激活剂激活剂(activator)特异性识别短共有序列元件的转录因子。结合于启动特异性识别短共有序列元件的转录因子。结合于启动子或增强子位点上。通过增加根本转录复合体子或增强子位点上。通过增加根本转录复合体(basal apparatus)结合于启动子的效率而起作用；结合于启动子的效率而起作用；3辅激活剂辅激活剂(coactivator)连接了激活剂和根本转录复合体；连接了激活剂和根本转录复合体；4一些调节因子一些调节因子(Some regulators)可使染色

26、质构造改变。可使染色质构造改变。2.3 真核基因转录调控的模式真核基因转录调控的模式 2.3.1 RNA聚合酶聚合酶的启动子和转录因子的启动子和转录因子2.3.2 RNA聚合酶聚合酶的启动子和转录因子的启动子和转录因子2.3.3 RNA聚合酶聚合酶 的启动子和转录因子的启动子和转录因子酶酶主要转录产物主要转录产物RNARNA聚合酶聚合酶 rRNA rRNA，大多数，大多数snRNAsnRNARNARNA聚合酶聚合酶 mRNA mRNA前体，部分前体，部分snRNAsnRNARNARNA聚合酶聚合酶tRNAtRNA、部分、部分snRNAsnRNA RNA聚合酶聚合酶的启动子由一个核心启动的启动子

27、由一个核心启动子子(core promoter)和一个上游控制元件和一个上游控制元件(upstream control element,UCE)组成。组成。2.3.1 RNA聚合酶聚合酶的启动子和转录因子的启动子和转录因子2.3.2 RNA聚合酶聚合酶的启动子和的启动子和转录因子转录因子 RNA聚合酶聚合酶识别的启动子分为两类：识别的启动子分为两类：5S RNA和和tRNA基因的启动子位于基因内部基因的启动子位于基因内部(起始点下游起始点下游)，称内部启动子，称内部启动子(internal promoter)；核小核小RNAsnRNA基因的启动子那么位于基因的启动子那么位于起始点上游，与其他常

28、规启动子的作用方式一样。起始点上游，与其他常规启动子的作用方式一样。2.3.3 RNA聚合酶聚合酶 的启动子和转录因子的启动子和转录因子 RNA聚合酶聚合酶的启动子构造复杂，且序列变化的启动子构造复杂，且序列变化很大，与转录启动有关的位点包括很大，与转录启动有关的位点包括4个部位：个部位：帽子位点转录起始点，其碱基大多为帽子位点转录起始点，其碱基大多为A；-25附近的附近的TATA框；框；-75附近的附近的CAAT框；框；-100以上的远上游序列，即增强子。以上的远上游序列，即增强子。转录要起始，需很多的转录因子参与。转录要起始，需很多的转录因子参与。3 转录产物的加工转运调控转录产物的加工转

29、运调控3.1 RNA3.1 RNA的不同剪接和编辑使同一基因转录产生的不同剪接和编辑使同一基因转录产生出不同的蛋白质出不同的蛋白质3.2 RNA3.2 RNA的切割和加的切割和加polyApolyA改变基因编码的蛋白改变基因编码的蛋白质质3.3 RNA3.3 RNA从核中转运到细胞质的过程受控制从核中转运到细胞质的过程受控制 基因操作基因操作也称也称重组重组DNADNA技术技术，主要包括，主要包括DNADNA分子的切分子的切割与连接、细胞转化、凝胶电泳、核酸分子杂交、割与连接、细胞转化、凝胶电泳、核酸分子杂交、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PC

30、RPCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入各种载体分子基因工程是指在体外将核酸分子插入各种载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之进入新的寄主中，构成遗传物质的新组合，并使之进入新的寄主细胞内，进展持续稳定的繁殖和表达。细胞内，进展持续稳定的繁殖和表达。常用分子生物学实验技术常用分子生物学实验技术两个概念两个概念主要内容主要内容一、一、重组重组DNA技术技术二、二、DNA的根本操作的根本操作三、三、RNA的提取和反转录的提取和反转录一、什么是重组一、什么是重组DNA技术？技术？1、重组、重组DNA技术技术Recombinan

31、t DNA Technique 又称为基因克隆又称为基因克隆Gene Cloning或分子克隆或分子克隆Molecular Cloning技术。是按照人们意愿，在技术。是按照人们意愿，在体外对体外对DNA分子进展重组，再将重组分子导入受体分子进展重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的的大量拷贝。大量拷贝。重组重组DNA技术包括了一系列的基因操作步骤。技术包括了一系列的基因操作步骤。2、重组、重组DNA技术的根本步骤技术的根本步骤 目的目的DNA的获得与载体的的获得与载体的制备；制备；目的目的DNA与载体的连接；与载体的连接

32、；重组重组DNA导入受体细胞；导入受体细胞；重组重组DNA的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；目的目的DNA的表达及表达产的表达及表达产物的检测与别离纯化。物的检测与别离纯化。3、载体应当具备的条件、载体应当具备的条件1能自主复制。容易获得大量的重组的能自主复制。容易获得大量的重组的DNA分子；分子；2具有适宜的外源具有适宜的外源DNA插入的位点克隆位点或限插入的位点克隆位点或限制性内切酶的切点。便于接纳不同的制性内切酶的切点。便于接纳不同的DNA片段。片段。3具备可供选择的遗传标记。便于进展重组体筛选具备可供选择的遗传标记。便于进展重组体筛选和鉴定。和鉴定。4载体本身应尽量小。不含或尽量少含多余的载

33、体本身应尽量小。不含或尽量少含多余的DNA局部，这样可以容纳较大的外源局部，这样可以容纳较大的外源DNA。5在宿主细胞内的稳定性高。在宿主细胞内的稳定性高。MCS4、工具酶、工具酶 我们的根本目的是：把外源基因与载体我们的根本目的是：把外源基因与载体连接在一起形成重组连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以分子，最少需要以下两类工具酶：下两类工具酶：、准确切割、准确切割DNADNA分子的工具分子的工具“分子手术刀分子手术刀 -限制性内切酶限制性内切酶、DNADNA片段的连接工具片段的连接工具“分子缝合针分子缝合针 -DNA-DNA连接酶连接酶、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶-“-“分子手术

34、分子手术刀刀限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶Restriction Endonuclease,RE：是一类能识别和切割双链是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。顺序的核酸水解酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBamH分类分类:I、II、III重组重组DNA技术中常用技术中常用II型型识别序列特点识别序列特点 回文构造回文构造(palindrome)即反向重复构造，以即反向重复构造，以DNA分子中某一处为轴，分子中某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。每种限制性内切酶都有一个它所识别、结合并切割每种

35、限制性内切酶都有一个它所识别、结合并切割的特异序列，称为限制性位点或切点的特异序列，称为限制性位点或切点48bp。识别序列：识别序列：BamHBam HCCCGGGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGSam ICCCGGGGGGCCCGGGCCC平末端平末端Blunt end：对称轴切割对称轴切割粘性末端粘性末端Sticky end：交织切割交织切割切口：切口：平端切口、粘端切口平端切口、粘端切口几个常用限制性内切酶及其切几个常用限制性内切酶及其切点点、DNADNA连接酶连接酶-“-“分子缝分子缝合针合针DNA连接酶连接酶DNA Ligase：催化两条催化两条DNA链的链的3-O

36、H和和5-P之间形成磷酸之间形成磷酸二酯键而把两个二酯键而把两个DNA分子连接在一起。例如分子连接在一起。例如:T4 DNA连接酶。连接酶。外源基因与载体的连接方式：外源基因与载体的连接方式：1粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：同一限制性内切酶切点的连接同一限制性内切酶切点的连接 不同限制性内切酶切点的连接不同限制性内切酶切点的连接2平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶作用产生的平端限制性内切酶作用产生的平端 粘端经特殊酶处理变为平端粘端经特殊酶处理变为平端四宿主细胞四宿主细胞u大肠杆菌大肠杆菌u酵母酵母u昆虫细胞昆虫细胞u哺乳动物细胞哺乳动物细胞1、常用种类、常用种类2、导入方式、

37、导入方式u转化转化transformationu转染转染transfectionu转导转导transductionDNA的根本操作技术的根本操作技术一、核酸的凝胶电泳一、核酸的凝胶电泳二、细菌转化与目标二、细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖一、核酸的凝胶电泳一、核酸的凝胶电泳 核酸凝胶电泳是重组核酸凝胶电泳是重组DNA技术的核心技术之一，技术的核心技术之一，它可以按分子量大小对它可以按分子量大小对DNA或或RNA进展别离。因进展别离。因此，可用于别离、鉴定和纯化此，可用于别离、鉴定和纯化DNA或或RNA片段，片段，也是许多分子生物学研究方法，如也是许多分子生物学研究方法，如DNA分型、分

38、型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析、凝核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析、凝胶回收等等一系技术的技术根底。胶回收等等一系技术的技术根底。一、核酸的凝胶电泳一、核酸的凝胶电泳 核酸凝胶电泳是重组核酸凝胶电泳是重组DNA技术的核心技术之一，技术的核心技术之一，它可以按分子量大小对它可以按分子量大小对DNA或或RNA进展别离。因进展别离。因此，可用于别离、鉴定和纯化此，可用于别离、鉴定和纯化DNA或或RNA片段，片段，也是许多分子生物学研究方法，如也是许多分子生物学研究方法，如DNA分型、分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析、凝核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析、凝胶回收

39、等等一系技术的技术根底。胶回收等等一系技术的技术根底。常用的核酸凝胶电泳有琼脂糖常用的核酸凝胶电泳有琼脂糖(Agarose)凝胶电泳和聚丙凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳烯酰胺凝胶电泳PAGE。可以在水平或垂直的电泳。可以在水平或垂直的电泳槽中进展。槽中进展。琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为片段的范围为0.2-50 kb之间。之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1-1,000 bp之间。之间。凝胶浓度的上下影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越凝胶浓度的上下影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖及聚丙烯酰胺凝

40、胶分辨琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段片段的能力的能力二、细菌转化与目标二、细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖细菌转化细菌转化Transformation:一种细菌菌株由于捕获了外源一种细菌菌株由于捕获了外源DNA而导致性状特而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。承受转化征发生遗传改变的生命过程。承受转化DNA的细菌菌的细菌菌株那么被称为受体菌株。株那么被称为受体菌株。绝大多数细菌，正常条件下仅能获得极少量的绝大多数细菌，正常条件下仅能获得极少量的DNA。为了高效转化这些细菌，必须对受体细菌进展一些物理为了高效转化这些细菌，必须对受体细菌进展一些物理或化学的处理，以增加它们获得或化学

41、的处理，以增加它们获得DNA的能力。经历这种的能力。经历这种处理的细胞被称为感受态细胞处理的细胞被称为感受态细胞Competent Cell。常用细菌转化的方法常用细菌转化的方法1-CaCl2法法u将快速生长中的大肠杆菌置于经将快速生长中的大肠杆菌置于经(0预处理的低预处理的低渗氯化钙渗氯化钙(0.1mol/L)溶液中，使细胞膨胀形成原生溶液中，使细胞膨胀形成原生质球，外源质球，外源DNA粘附在细胞外表。粘附在细胞外表。u42下做短暂热刺激，细胞吸收外源下做短暂热刺激，细胞吸收外源DNA。在全。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，涂培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，涂布于选择性培

42、养基中别离转化子。布于选择性培养基中别离转化子。常用细菌转化的方法常用细菌转化的方法2-电转化法电转化法 利用锐利的电脉冲在细胞膜上造成小凹陷，进而利用锐利的电脉冲在细胞膜上造成小凹陷，进而形成形成纳米级疏水孔洞纳米级疏水孔洞。随着跨膜电压增加，一些较大。随着跨膜电压增加，一些较大的疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，溶液中的的疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，溶液中的DNA很很容易通过孔洞进入细胞质。容易通过孔洞进入细胞质。克隆的筛选和鉴定：克隆的筛选和鉴定：1、抗生素、抗生素 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。霉素、四环素、链霉素

43、等。2、-互补蓝白斑筛选法互补蓝白斑筛选法 实验室常用带有不同实验室常用带有不同抗生素抗生素的选择性培养基结合的选择性培养基结合-互补蓝白斑筛选法互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。鉴定转化细胞。载体上：载体上：-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因LacZ的调控序列和的调控序列和氨基氨基 端端N端端146个氨基酸编码序列，在编码区个氨基酸编码序列，在编码区中插入了一个多克隆位点中插入了一个多克隆位点MCS；-片段片段宿主细胞：宿主细胞：编码编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端端序列序列-片段片段 宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性

44、的蛋白质。这样，时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补互补。细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖的操作过程的操作过程三、三、RNARNA的提取和反转录的提取和反转录 RNA存在于从简单的病毒到哺乳动物细胞的所有的存在于从简单的病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中。应用生命形式之中。应用RNA对细胞和分子生物学的各个方对细胞和分子生物学的各个方面进展研究非常普遍。面进展研究非常普遍。由于当前

45、没有一种方法能够直接扩增由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA，为了研，为了研究究RNA所包含的功能信息，一般将其反转录成稳定的所包含的功能信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋双螺旋Complementary DNA，cDNA)，再插入，再插入到可以自我复制的载体中。由于到可以自我复制的载体中。由于cDNA来自来自RNA，几乎，几乎不含冗余序列，通过特异性探针筛选不含冗余序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以文库，可以较快的别离到相关基因。较快的别离到相关基因。1、总总RNA的提取的提取 细胞中的总细胞中的总RNA包括包括信使信使RNA(mRNA)、核糖、核糖体体RNA(rRNA)、转

46、运、转运RNA(tRNA)以及一些以及一些非编码非编码的小的小RNA。一个典型的动物细胞约含有。一个典型的动物细胞约含有10-5g RNA，其中其中rRNA占占80%85%，tRNA和非编码小和非编码小RNA占占15%20%，mRNA 占占1%5%。按照提取试剂的种类来分，可分为：异硫氰酸胍按照提取试剂的种类来分，可分为：异硫氰酸胍法、盐酸胍法、异硫氰酸胍法、盐酸胍法、异硫氰酸胍-苯酚法。苯酚法。Trizol试剂是使用最广泛的抽提试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂。专用试剂。主要由异硫氰酸胍和苯酚组成，可以迅速破坏细构造，主要由异硫氰酸胍和苯酚组成，可以迅速破坏细构造，使存在于细胞质及核内的

47、使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使蛋白质释放出来，并使蛋白质与与RNA分子别离，还能保证分子别离，还能保证RNA的完整性。的完整性。常用的常用的RNA提取方法提取方法、常用提取方法的种类、常用提取方法的种类 由于由于RNA酶酶存在于所有的生物中并且能够存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，固此建立一个抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，固此建立一个无无RNA酶的环境酶的环境对于制备优质对于制备优质RNA很重要。对很重要。对于制备于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要。来说这些预防措施尤其重要。、本卷须知、本卷须知 纯的纯的RNA样品其样品其OD260OD280应介于应介于1.8

48、-2.0之间。之间。1假设假设RNA样品样品OD260/OD280比值太小，说明比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；有蛋白质或酚的污染；2比值大于比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；时，可能被异硫氰酸胍等污染；OD260值值=1，相当于单链，相当于单链DNA或或RNA为为40g/mL，寡核苷酸为，寡核苷酸为20g/mL。RNA的纯度、浓度与完整性的纯度、浓度与完整性1、RNA的纯度的纯度2、RNA的浓度的浓度 rRNA大小完整，而且28S rRNA和 18S rRNA亮度接近2：1；mRNA分布均匀，那么认为RNA质量较好。3、RNA的完整性的完整性2、cDNA的合成的合成使用Oligo

49、dT Primer时的cDNA合成 使用Random Primer时的cDNA合成缺陷：不具有缺陷：不具有ployA尾构造的尾构造的mRNA无法使用无法使用此方法！此方法！生物信息学简介概念概念：生物信息学是用数理和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象、组织和分析呈现指数增长的生物学数据的一门学科。首先是研究遗传物质的载体DNA及其编码的大分子蛋白质，以计算机为其主要工具，开展各种软件，对逐日增长的浩如烟海的DNA和蛋白质的序列和构造进展收集、整理、分析和研究，逐步认识生命的起源、进化、遗传和发育的本质，破译隐藏在DNA序列中的遗传语言，提醒人体生理和病理过程的分子根底，为人类疾病的预测、

50、诊断、预防和治疗提供最合理和有效的途径。生物信息学已经成为生物医学、农学、遗传学、细胞生物学等学科开展的强大推动力量，也是药物设计、环境监测的重要组成局部。1 1、美国国家信息中心、美国国家信息中心(National Center of Biotechnology (National Center of Biotechnology Information,NCBI)Information,NCBI)的的Gen Bank(:/nchi.nlm.Gen Bank(:/nchi.nlm.nih.gov/web/Gen Bank/imdex.html)nih.gov/web/Gen Bank/imde