新一代基因组测序技术原理及应用第二代测序技术课件.ppt

1、Personal Genome Project 个人基因组计划个人基因组计划 可高速、廉价、便宜地解读可高速、廉价、便宜地解读DNADNA的下一代测序技术将在十年内实现。的下一代测序技术将在十年内实现。它变革研究和促使真正它变革研究和促使真正个体化医药个体化医药时代到来的潜力告诉我们：我们现时代到来的潜力告诉我们：我们现在必须要做好准备了。在必须要做好准备了。乔治乔治 丘吉尔丘吉尔凝胶电泳分离凝胶电泳分离放射自显影谱放射自显影谱放射性同位素标记引物放射性同位素标记引物4种独立聚合反应种独立聚合反应lFour fluorescently labeled terminators（4种种荧光染料标记

2、链终荧光染料标记链终止核苷酸止核苷酸）lOne DNA polymerization reaction（1个聚合反个聚合反应）应）lReplication product separated by gel-electrophoresis（荧荧光标记链终止产物由电泳光标记链终止产物由电泳分离）分离）经电泳后各个荧光谱带分开，同时激光检测器同步扫描，激发出的荧光经光栅经电泳后各个荧光谱带分开，同时激光检测器同步扫描，激发出的荧光经光栅分光后打到分光后打到CCD摄像机上同步成像，将信息输送给电脑进行分析和保存摄像机上同步成像，将信息输送给电脑进行分析和保存ABI 377 有有64条泳道条泳道毛细管电

3、泳毛细管电泳激发出的荧光被采集，输激发出的荧光被采集，输送给电脑进行分析和保存送给电脑进行分析和保存荧光标记的链终止荧光标记的链终止COPY产物产物Progression of 1st-Generput第第一一代代仪仪器器测测序序通通量量演演变变+ppi+H+CycleSmall fragmentsAsymmetric AdaptorsSmall fragments（DNA片段）片段）Asymmetric Adaptors（不对称接头）（不对称接头）LigateFlow Cell载体芯片载体芯片单链引物单链引物Anchored primers and templates within a ra

4、dius will amplify.Primary ampliconYield two covalent molecules33 Templates become permanently bind to surface.One-molecule template forms one clusterOnly one set of primers are used(B-or R-primer)经过经过30轮扩增，每个单分子得到轮扩增，每个单分子得到了了1000倍扩增，成为单克隆倍扩增，成为单克隆“DNA簇群簇群”引物引物 +DNA聚合酶聚合酶 +4种种不同色荧光标记的可逆终止不同色荧光标记的可逆终

5、止核苷酸核苷酸位于碱基位于碱基33末端的保护基末端的保护基团被除去，继续下一轮反团被除去，继续下一轮反应应 标记荧光经过扫描进行识标记荧光经过扫描进行识别，读取该次反应颜色别，读取该次反应颜色 Roche/454 Life Sciences Genome Sequencer试剂液体传送系统试剂液体传送系统光学检测系统光学检测系统计算机系统计算机系统Sequencing Method Based onReal-time Pyrophosphate（焦磷酸焦磷酸）Ronaghi M,Uhlen M,Nyren PADepartment of Biochemistry and Biotechnolo

6、gy,The Royal Institute of Technology,Stockholm,Sweden Science 1998;281:363,365emplates prepared and attached to surface of magnetic bead(DNA单链片断固定在球珠表面)nDNA fragment isamplified through emPCR(乳水包PCR扩增)and enriched（筛选）nAmplified beads are deposited on flow cell with microwells,one bead per well（球珠-微反

7、应池）nEach bead,fixed in well,is sequenced by cycling throughpyrophosphate chemistry and chemiluminescent imaging（循环合成反应+化学发光成像）Roche/454 Seps(焦磷酸基团焦磷酸基团)(ATP硫酸化酶硫酸化酶)(荧光素酶荧光素酶)(双磷酸酶双磷酸酶)Break ATP down(聚合酶聚合酶)（dATP SdATP S，dTTPdTTP，dCTPdCTP，dGTP dGTP 四种四种核苷三磷酸核苷三磷酸）NIVC:In vitro compartmentalization将将

8、PCR反应物包被于反应物包被于“油包水油包水”的乳化剂中，的乳化剂中，扩增过程就可扩增过程就可以在每一滴乳化剂内独立进行以在每一滴乳化剂内独立进行 bead.微型反应器微型反应器 A templates prepared and attached to bead(DNA单链片断固定在球珠表面)nDNA fragment isamplified through emulsion PCR(乳滴PCR扩增)and enriched（筛选）nAmplified beads attached to glass slide surface（球珠被固定到玻璃载体表面）nEach bead is sequen

9、ced by cycling throughligation and fluorescence imaging（循环连接反应+荧光成像）SOLiD Seque Degenerate nucleotides 简并碱基Dinucleotides Hybridization and ligation of a specific oligo whose 1st&2nd bases match that of the template Detection of the specific fluorescence Cleavage of all bases to the 5 of base 5Primer

10、 and all ligated portions are melted from the template and discardedNew initial primer is used that is N-1 in length Generates an overlapping data set n中国科学院重大科研装备研制项目n2011年4月完成项目验收工作n焦磷酸测序法+四工位平台n达到国际主流测序设备技术指标：读长 500 bp64BIGIS-BIGIS-系列已达国外主流设备性能指标系列已达国外主流设备性能指标Semiconductg Ion Proton SequencerCycl

11、eSebastian Jnemann,et.al.2013 Volume 31 Number 4 Nature BiotechnologyCycle camera标本接物镜二色分光镜二色分光镜 显微镜载片显微镜载片 水介层水介层 隐失波隐失波界面界面 入射光入射光 反射光反射光 HeliScopeGenetic Analyzer Molecule Sequencing1.C-T-A-G-T-G-2.C-G-C-T-A-3.C-A-T-G-CCCTAAGGCTTTAGG光谱分离光谱分离激发光源激发光源 全内反射荧全内反射荧光光 Each chip contains thousands of ZM

12、Ws.Each ZMW is a cylindrical hole tens of nanometers in diameter,perforating a thin metal(e.g.)film supported by a transparent substrate激发光源激发光源 PolymeraseDNA 固定聚合酶固定聚合酶核苷酸荧光标记核苷酸荧光标记Useful info can be obtained from signal pulses物镜物镜 色彩分离色彩分离 激发出的荧光经光栅分光后打到单色激发出的荧光经光栅分光后打到单色CCD摄像机上同步成像摄像机上同步成像二色分光镜二

13、色分光镜 Microscopic Sequencing（ualizingBasesnElectron Beam Punched Nanopore on Graphene-hemolysin（溶血素蛋白溶血素蛋白）MspA（耻垢分枝杆菌孔蛋白）（耻垢分枝杆菌孔蛋白）不同的碱基的阻塞电流不同不同的碱基的阻塞电流不同聚合酶速度制控 生物分子马达Submitted to NCBI;data tabulated on March 1,2010$300 millions phg in 1994$300 millions phg in 1994$3 billions per human genome(phg

14、)in 1984$3 billions per human genome(phg)in 1984$5,000(Complete Genomics)$30 millions phg in 2004$30 millions phg in 2004$10 millions phg in 2005$10 millions phg in 2005$2 millions Watsons genome with 454 in 2007$2 millions Watsons genome with 454 in 2007NHGRIs Immediate Goal by 2009:$100,000 phgNHGRIs Immediate Goal by 2009:$100,000 phg$60,000 phg(ABI SOLiD,Mar.2008)$60,000 phg(ABI SOLiD,Mar.2008)Goal by 2014:$1000 per human genomeGoal by 2014:$1000 per human genome$6,000(ABI SOLid 4)