1、DNA复制的酶学和拓扑学Enzymology and topology of DNA replication第二节 参与DNA复制的物质:底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP 聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol 模板(template):解开成单链的DNA母链 引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子(dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合 全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase
2、)简称：DNA-pol 活性：1.53的聚合活性 2.核酸外切酶活性核酸外切酶活性:5 A G C T T C A G G A T A 3|3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5?35外切酶活性:能辨认错配的碱基对，并将其水解 53外切酶活性:能切除突变的 DNA片段（一）原核生物有3种DNA聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 分子量（kD）109120250组成单肽链？多亚基不对称二聚体分子数/细胞400？2053核酸外切酶活性有无无基因突变后的致死性可能不可能可能原核生物的DNA聚合酶个核心
3、酶1个-复合物（、6种亚基）1对-亚基（可滑动的DNA夹子）全酶结构包括：DNA聚合酶全酶结构:亚基（130 000）主要功能是合成DNA 亚基具有35 外切酶活性（复制保真性所必需）亚基可增强其活性 亚基可能起组装作用核心酶由、和 亚基组成：两侧的亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动的作用2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用 -复合物由6种亚基组成：、对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补功能：DNA-pol （109kD）
4、:323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶分子生物学研究中常用的工具酶 DNA-pol（120kD）:DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复（一）常见的真核细胞DNA聚合
5、酶有5种 DNA-pol 起始引发，有引物酶活性 DNA-pol 参与低保真度的复制 DNA-pol 在线粒体DNA复制中起催化作用 DNA-pol 合成后随链 DNA-pol 合成前导链E.Coli真核细胞 功能填补复制中的DNA空隙，DNA修复和重组复制中的校对，DNA修复 DNA修复 线粒体DNA合成 前导链合成DnaG 引物酶 后随链合成真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较 DNA-pol 分子量（kD）16.54.014.012.525.553聚合活性中？高高高35核酸外切酶活性-+功能起始引发，引物酶活性低保真度的复制线粒体DNA复制合成后随链合成前导链真核生物的DNA聚合酶二、D
6、NA聚合酶的碱基选择和校对功能DNA复制的保真性至少要依赖三种机制:遵守严格的碱基配对规律聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能复制出错时有即时校对功能（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择 利用“错配”实验发现，DNA pol 对核苷酸的参入（incorporation）具有选择功能 DNA pol 对不同构型糖苷键表现不同亲和力，因此实现其选择功能 （二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正 核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的 A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性DNA pol 的校读功能
