EGFR荧光原位杂交与免疫组化检测比较分析课件.ppt

1、前言前言 近年来，以表皮生长因子受体（近年来，以表皮生长因子受体（，）为治疗靶标，）为治疗靶标的分子靶向治疗在非小细胞肺癌（的分子靶向治疗在非小细胞肺癌（，）治疗中越显突，）治疗中越显突出。基因的检测不仅可以为分子靶向药物的使用提供有效出。基因的检测不仅可以为分子靶向药物的使用提供有效指导，也可以为肺癌治疗措施的制定以及肺癌预后的判定指导，也可以为肺癌治疗措施的制定以及肺癌预后的判定提供重要信息。目前临床病理工作中，对基因扩增的检测提供重要信息。目前临床病理工作中，对基因扩增的检测使用较多的方法有荧光免疫原位杂交（）技术、免疫组化使用较多的方法有荧光免疫原位杂交（）技术、免疫组化（）检测技术、

2、扩增检测技术等。本文将对荧光原位杂交（）检测技术、扩增检测技术等。本文将对荧光原位杂交与免疫组化两种检测进行比较分析。与免疫组化两种检测进行比较分析。材料材料 标本来源：广州医科大学第一附属医院2010年1月2011年1月行支纤镜及手术切除的病例，其中男性21例，女性19例；年龄3085岁，中位年龄58岁。所有标本均经10%中性缓冲福尔马林液固定，常规石蜡包埋。40例标本行连续切片，同时行检测与免疫组化检测。主要试剂与仪器主要试剂与仪器 蛋白酶 K，探针：7探针（北京金菩嘉公司），胃蛋白酶消化液，人抗单克隆抗体（即用型）购于福州迈新生物公司。杂交仪、观察用 51型显微镜和 H600L荧光显微镜

3、。检测方法检测方法 （1 1）检测：）检测：3m组织切片脱蜡至水煮沸去离子水处理15室温下2中漂洗2次，每次5 在组织上滴加蛋白酶K工作液，在37预热的孵育盒中消化35 室温下用2溶液中洗涤2次，每次5，乙醇梯度脱水，自然干燥 避光环境中，探针混合液滴于玻片杂交区域 在温度80的自动杂交仪中变性5，42杂交16小时 第二天46水浴箱中210，0.140溶液洗涤5，室温70%乙醇3 暗处自然干燥玻片后加复染液，放于暗盒中复染5 51型荧光显微镜在三色滤光镜激发下观察间期细胞荧光杂交信号 检测方法检测方法（2 2）检测：）检测：3m组织涂胶片，组织涂胶片，57烤片过夜，烤片过夜，浸于二甲苯中脱蜡至

4、水浸于二甲苯中脱蜡至水 在组织上滴加胃蛋白酶消化液，在在组织上滴加胃蛋白酶消化液，在37预热的孵育盒中消化预热的孵育盒中消化30 采用二步法，严格按照说采用二步法，严格按照说明书操作明书操作 结果判断结果判断 （1 1）结果判定：红色信号代表检测的靶基因，绿色信号）结果判定：红色信号代表检测的靶基因，绿色信号代表靶基因所在的染色体着丝粒。检测基因计数代表靶基因所在的染色体着丝粒。检测基因计数100100个细个细胞，统计值（胞，统计值（100100个细胞核中红色信号数个细胞核中红色信号数/100/100个细胞核中个细胞核中绿色信号数）。绿色信号数）。阳性分为：基因扩增：阳性分为：基因扩增：2为阳

5、性结果；为阳性结果；15个红色信号的细胞数占细胞总数的个红色信号的细胞数占细胞总数的10%以上；以上；出现成团红色信号的细胞；高多体性：出现成团红色信号的细胞；高多体性：2，但，但4个红个红色信号的细胞数占细胞总数的色信号的细胞数占细胞总数的40%以上。以上。阴性：阴性：2为无扩增。为无扩增。结果判断结果判断（2 2）结果判定：染色结果根据细胞膜着色的阳性细胞百分）结果判定：染色结果根据细胞膜着色的阳性细胞百分率和阳性染色程度评价。率和阳性染色程度评价。着色细胞占计数细胞百分率着色细胞占计数细胞百分率5%5%为为0 0分；分；6 625%25%阳性细胞为阳性细胞为1 1分；分；262650%5

6、0%阳性细胞为阳性细胞为2 2分；分；50%50%阳性细胞为阳性细胞为3 3分。分。再结合染色强度，无色为再结合染色强度，无色为0 0分，浅黄色分，浅黄色1 1分，棕黄色分，棕黄色2 2分，棕分，棕褐色褐色3 3分。将每张切片着色细胞百分率得分与着色程度得分分。将每张切片着色细胞百分率得分与着色程度得分相乘，为其最后得分。相乘，为其最后得分。同一视野如有染色强度不一，取其平均值作最后得分。同一视野如有染色强度不一，取其平均值作最后得分。01分为阴性（），分为阴性（），23分为弱阳性（分为弱阳性（1+），），46分为中等阳性（分为中等阳性（2+），），6分以上为强阳性（分以上为强阳性（3+）。）

7、。统计学处理统计学处理 采用采用 17.0 17.0统计软件进行描述性分析。统计软件进行描述性分析。技术与法检测结果的比较使用技术与法检测结果的比较使用x2x2检验。检验。结果结果 图图1 1（+）（高多体）（高多体）图图2 2（+）（点簇状）（点簇状 ）图图3 3（-）结果结果 +-结果结果 技术与法检测的结果比较见表技术与法检测的结果比较见表1 1。合计（-）（1+）（2+）（3+）（+）652215（-）1951025合计 20103240表表1 技术与法检测的结果比较技术与法检测的结果比较40例标本中，显示为阳性的例标本中，显示为阳性的15例，其中检测表达为（例，其中检测表达为（）的）

8、的6例（例（40%），阳性的），阳性的9例例（60%）；显示为阴性的）；显示为阴性的25例，其中检测表达为（例，其中检测表达为（）的）的19例（例（76%），阳性的），阳性的6例例（24%）。）。检测阳性例数高于检测阳性例数，差异无统计学意义（检测阳性例数高于检测阳性例数，差异无统计学意义（x2=5.184，P0.05）。）。讨论讨论 表皮生长因子受体表皮生长因子受体()()是一种蛋白酪氨酸激酶受体，位于第是一种蛋白酪氨酸激酶受体，位于第7 7号染色体号染色体p13p132222区区,全长全长200,200,由由2828个外显子组成，编码个外显子组成，编码11861186个氨基酸个氨基酸1,1

9、,广泛分布于除成熟骨骼肌细胞、体壁内胚广泛分布于除成熟骨骼肌细胞、体壁内胚层和造血组织以外的所有组织细胞。层和造血组织以外的所有组织细胞。的异常高表达可见于多的异常高表达可见于多种恶性肿瘤，其活化可激活多种转录因子种恶性肿瘤，其活化可激活多种转录因子,引起细胞的增殖、引起细胞的增殖、分化、迁移、黏附、抗凋亡和细胞转化等效应，在肿瘤进展、分化、迁移、黏附、抗凋亡和细胞转化等效应，在肿瘤进展、血管生成、转移扩散、凋亡受抑等方面起重要作用血管生成、转移扩散、凋亡受抑等方面起重要作用22。酪氨。酪氨酸激酶抑制剂可抑制激活的酪氨酸激酶活性，从而阻断的功能酸激酶抑制剂可抑制激活的酪氨酸激酶活性，从而阻断的

10、功能，阻碍肿瘤的发生发展，阻碍肿瘤的发生发展33。多数文献提示，分子靶向治疗晚。多数文献提示，分子靶向治疗晚期疗效明显，而且治疗明显的患者中，基因突变的发生率明显期疗效明显，而且治疗明显的患者中，基因突变的发生率明显高于治疗无效的患者，基因检测可以作为患者应用分子靶向治高于治疗无效的患者，基因检测可以作为患者应用分子靶向治疗的一个预测指标，在个性化治疗过程中提供重要信息。疗的一个预测指标，在个性化治疗过程中提供重要信息。讨论讨论 技术检测的敏感性和特异性较高，操作过程中标本受技术检测的敏感性和特异性较高，操作过程中标本受影响较少，可以定量判读结果。影响较少，可以定量判读结果。法是临床常用的蛋白

11、表达的方法。该方法操作简便，法是临床常用的蛋白表达的方法。该方法操作简便，可重复性高，对仪器、材料的要求不高，是国内检测蛋白可重复性高，对仪器、材料的要求不高，是国内检测蛋白表达的主要方法。但法在标本固定和处理中可能会使蛋白表达的主要方法。但法在标本固定和处理中可能会使蛋白质变性破坏而影响检测结果，易造成假阴性或假阳性，且质变性破坏而影响检测结果，易造成假阴性或假阳性，且结果判断人为主观性较强。由于免疫组化方法因抗体类型结果判断人为主观性较强。由于免疫组化方法因抗体类型与来源不同，以及所使用的评分系统的差异而导致结果差与来源不同，以及所使用的评分系统的差异而导致结果差异，不同抗体可使结果范围从

12、异，不同抗体可使结果范围从1212变至变至141444。讨论讨论 以为标准，与之比较：以为标准，与之比较：2 2例法强阳性（例法强阳性（3+3+）标本中，检测基因扩增均为阳性，阳性预）标本中，检测基因扩增均为阳性，阳性预测值为测值为100%100%；3 3例中等阳性（例中等阳性（2+2+）标本中，检测基因扩增阳性为）标本中，检测基因扩增阳性为2 2例，阳性预例，阳性预测值为测值为66.67%66.67%；1010例弱阳性标本（例弱阳性标本（1+1+），检测基因扩增阳性为），检测基因扩增阳性为5 5例，阴性预测例，阴性预测值为值为50%50%；2525例阴性（例阴性（-）标本中，检测基因扩增阴性

13、为）标本中，检测基因扩增阴性为1919例，阴性预测例，阴性预测值为值为76%76%。总体而言，两种方法的符合率较低。但其中法表达（总体而言，两种方法的符合率较低。但其中法表达（3+3+）及（）及（2+2+）的标本，尤以强阳性（）的标本，尤以强阳性（3+3+）标本与检测基因阳性的一致性）标本与检测基因阳性的一致性较高，与有关文献报到有所不同较高，与有关文献报到有所不同55，但该类标本例数较少，但该类标本例数较少，仅占总例数的仅占总例数的12.5%12.5%，其一致性是否可靠需要进一步验证。，其一致性是否可靠需要进一步验证。讨论讨论表表2.2963 2.2963 例乳腺癌例乳腺癌2 2 的和检测结

14、果比较的和检测结果比较以 作为标准 与之比较，其阳性预测值在阳性(以上)标本中为 91.6%，阴性预测值在 阴性(0或+)标本中为97.2%，在弱阳性和阳性(0或+)标本中其敏感性为92.6%，在阳性标本中其敏感性为98.8%6。讨论讨论 综上所述，免疫组化法对于评价患者是否使综上所述，免疫组化法对于评价患者是否使用酪氨酸激酶抑制剂治疗并非最佳的手段，但可用酪氨酸激酶抑制剂治疗并非最佳的手段，但可作为筛选检查。作为筛选检查。参考文献参考文献 1 J L,T D W,G D,.J.,2001,71(1):1.1 J L,T D W,G D,.J.,2001,71(1):1.22 ：J ,2003

15、 J ,2003，284284（1 1）:31.:31.3 D,Y,S S,.J.N J ,2004,351(14):337-345.3 D,Y,S S,.J.N J ,2004,351(14):337-345.4 4。s s )J )J ，20072007，15(3)15(3)：30530930530955周晓秋，王东关，孙希印，高摇虹，王琳琳，李新功周晓秋，王东关，孙希印，高摇虹，王琳琳，李新功.非小细胞肺癌耘郧云砸基因非小细胞肺癌耘郧云砸基因和蛋白检测的比较分析和蛋白检测的比较分析J.J.临床与实验病理学杂志，临床与实验病理学杂志，2012,282012,28（1010）：）：1124-1132.1124-1132.66刘艳辉刘艳辉.乳腺癌组织乳腺癌组织2 2的荧光原位杂交和免疫组化联合检测的评价的荧光原位杂交和免疫组化联合检测的评价J.J.循证医学，循证医学，20062006，6(2)6(2)：81-83.81-83.