EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析培训课件.ppt

1、EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析前言前言 近年来，以表皮生长因子受体（近年来，以表皮生长因子受体（epidermal growth epidermal growth factor receptorfactor receptor，EGFREGFR）为治疗靶标的分子靶向治疗在）为治疗靶标的分子靶向治疗在非小细胞肺癌（非小细胞肺癌（non-small cell lung cancernon-small cell lung cancer，NSCLCNSCLC）治疗中越显突出。治疗中越显突出。EGFREGFR基因的检测不仅可以为分子靶向药基因的检测不仅可以为分子靶向药物的使用提供有效指导，也

2、可以为肺癌治疗措施的制定以物的使用提供有效指导，也可以为肺癌治疗措施的制定以及肺癌预后的判定提供重要信息。目前临床病理工作中，及肺癌预后的判定提供重要信息。目前临床病理工作中，对对EGFREGFR基因扩增的检测使用较多的方法有荧光免疫原位杂基因扩增的检测使用较多的方法有荧光免疫原位杂交（交（FISHFISH）技术、免疫组化（）技术、免疫组化（IHCIHC）检测技术、）检测技术、PCRPCR扩增检扩增检测技术等。本文将对荧光原位杂交与免疫组化两种检测进测技术等。本文将对荧光原位杂交与免疫组化两种检测进行比较分析。行比较分析。2EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析材料材料 标本来源：广州医

3、科大学第一附属医院标本来源：广州医科大学第一附属医院20102010年年1 1月月20112011年年1 1月行支纤镜及手术切除的月行支纤镜及手术切除的NSCLCNSCLC病病例，其中男性例，其中男性2121例，女性例，女性1919例；年龄例；年龄30308585岁，岁，中位年龄中位年龄5858岁。所有标本均经岁。所有标本均经10%10%中性缓冲福尔马中性缓冲福尔马林液固定，常规石蜡包埋。林液固定，常规石蜡包埋。4040例标本行连续切片例标本行连续切片，同时行，同时行FISHFISH检测与免疫组化检测。检测与免疫组化检测。3EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析主要试剂与仪器主要试剂与仪

4、器 蛋白酶蛋白酶 K K，探针：，探针：GLP EGFR/CSP7GLP EGFR/CSP7探针（北探针（北京金菩嘉公司），胃蛋白酶消化液，人抗京金菩嘉公司），胃蛋白酶消化液，人抗EGFREGFR单单克隆抗体（即用型）购于福州迈新生物公司。克隆抗体（即用型）购于福州迈新生物公司。Dako Dako 杂交仪、观察用杂交仪、观察用 Olympus BX51Olympus BX51型显微镜和型显微镜和Nikon H600LNikon H600L荧光显微镜。荧光显微镜。4EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析检测方法检测方法（2 2）IHCIHC检测：检测：3m组织涂胶片，组织涂胶片，57烤片过

5、夜，烤片过夜，浸于二甲苯中脱蜡至水浸于二甲苯中脱蜡至水 在组织上滴加胃蛋白酶消化液，在在组织上滴加胃蛋白酶消化液，在37预热的孵育盒中消化预热的孵育盒中消化30min 采用采用EnVision二步法，二步法，严格按照说明书操作严格按照说明书操作 6EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析结果判断结果判断 （1 1）FISHFISH结果判定：红色信号代表检测的靶基因，绿色结果判定：红色信号代表检测的靶基因，绿色信号代表靶基因所在的染色体着丝粒。检测信号代表靶基因所在的染色体着丝粒。检测EGFREGFR基因计数基因计数100100个细胞，统计个细胞，统计RatioRatio值（值（100100

6、个细胞核中红色信号数个细胞核中红色信号数/100/100个细胞核中绿色信号数）。个细胞核中绿色信号数）。FISH阳性分为：阳性分为：EGFR基因扩增：基因扩增：Ratio2为阳性结果；为阳性结果；15个红色信号的细胞数占细胞总数的个红色信号的细胞数占细胞总数的10%以上；以上；出现成团红色信号的细胞；高多体性：出现成团红色信号的细胞；高多体性：Ratio2，但，但4个红色信号的细胞数占细胞总数的个红色信号的细胞数占细胞总数的40%以上。以上。FISH阴性：阴性：Ratio2为无扩增。为无扩增。7EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析结果判断结果判断（2 2）IHCIHC结果判定：染色结果

7、根据细胞膜着色的阳性细胞结果判定：染色结果根据细胞膜着色的阳性细胞百分率和阳性染色程度评价。百分率和阳性染色程度评价。着色细胞占计数细胞百分率着色细胞占计数细胞百分率5%5%为为0 0分；分；6 625%25%阳性细胞为阳性细胞为1 1分；分；262650%50%阳性细胞为阳性细胞为2 2分；分；50%50%阳性细胞为阳性细胞为3 3分。分。再结合染色强度，无色为再结合染色强度，无色为0 0分，浅黄色分，浅黄色1 1分，棕黄色分，棕黄色2 2分，棕分，棕褐色褐色3 3分。将每张切片着色细胞百分率得分与着色程度得分分。将每张切片着色细胞百分率得分与着色程度得分相乘，为其最后得分。相乘，为其最后得

8、分。同一视野如有染色强度不一，取其平均值作最后得分。同一视野如有染色强度不一，取其平均值作最后得分。01分为阴性（），分为阴性（），23分为弱阳性（分为弱阳性（1+），），46分为中等阳性（分为中等阳性（2+），），6分以上为强阳性（分以上为强阳性（3+）。）。8EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析统计学处理统计学处理 采用采用SPSS 17.0SPSS 17.0统计软件进行描述性分析。统计软件进行描述性分析。FISHFISH技术与技术与IHCIHC法检测结果的比较使用法检测结果的比较使用x x2 2检验。检验。9EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析结果结果 FISH图图1.E

9、GFR FISH1.EGFR FISH（+）（高多体）（高多体）图图2.EGFR FISH2.EGFR FISH（+）（点簇状点簇状）图图3.EGFR FISH3.EGFR FISH（-）10EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析结果结果 IHC+-11EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析结果结果 FISHFISH技术与技术与IHCIHC法检测法检测EGFREGFR的结果比较见表的结果比较见表1 1。FISH IHC 合计（-）（1+）（2+）（3+）（+）652215（-）1951025合计 20103240表表1 FISH技术与技术与IHC法检测法检测EGFR的结果比较的结果

10、比较40例例NSCLC标本中，标本中，FISH显示为阳性的显示为阳性的15例，其中例，其中IHC检测检测EGFR表达为（表达为（）的）的6例例（40%），阳性的），阳性的9例（例（60%）；）；FISH显示为阴性的显示为阴性的25例，其中例，其中IHC检测检测EGFR表达为表达为（）的）的19例（例（76%），阳性的），阳性的6例（例（24%）。）。IHC检测阳性例数高于检测阳性例数高于FISH检测阳性例数，差异无统计学意义（检测阳性例数，差异无统计学意义（x2=5.184，P0.05）。）。12EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析讨论讨论 表皮生长因子受体表皮生长因子受体(EGFR)

11、(EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体，位是一种蛋白酪氨酸激酶受体，位于第于第7 7号染色体号染色体p13p132222区区,全长全长200kb,200kb,由由2828个外显子组成，个外显子组成，编码编码11861186个氨基酸个氨基酸11,广泛分布于除成熟骨骼肌细胞、体壁内广泛分布于除成熟骨骼肌细胞、体壁内胚层和造血组织以外的所有组织细胞。胚层和造血组织以外的所有组织细胞。EGFR EGFR 的异常高表达可的异常高表达可见于多种恶性肿瘤，其活化可激活多种转录因子见于多种恶性肿瘤，其活化可激活多种转录因子,引起细胞的引起细胞的增殖、分化、迁移、黏附、抗凋亡和细胞转化等效应，在肿瘤增殖、分化、迁

12、移、黏附、抗凋亡和细胞转化等效应，在肿瘤进展、血管生成、转移扩散、凋亡受抑等方面起重要作用进展、血管生成、转移扩散、凋亡受抑等方面起重要作用22。EGFREGFR酪氨酸激酶抑制剂可抑制激活酪氨酸激酶抑制剂可抑制激活EGFREGFR的酪氨酸激酶活性，从的酪氨酸激酶活性，从而阻断而阻断EGFREGFR的功能，阻碍肿瘤的发生发展的功能，阻碍肿瘤的发生发展33。多数文献提示，。多数文献提示，分子靶向治疗晚期分子靶向治疗晚期NSCLCNSCLC疗效明显，而且治疗明显的患者中，疗效明显，而且治疗明显的患者中，EGFREGFR基因突变的发生率明显高于治疗无效的患者，基因突变的发生率明显高于治疗无效的患者，E

13、GFREGFR基因检基因检测可以作为患者应用分子靶向治疗的一个预测指标，在测可以作为患者应用分子靶向治疗的一个预测指标，在NSCLCNSCLC个性化治疗过程中提供重要信息。个性化治疗过程中提供重要信息。13EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析讨论讨论 FISH FISH技术检测的敏感性和特异性较高，操作过程中标技术检测的敏感性和特异性较高，操作过程中标本受影响较少，可以定量判读结果。本受影响较少，可以定量判读结果。IHC IHC法是临床常用的法是临床常用的EGFREGFR蛋白表达的方法。该方法操蛋白表达的方法。该方法操作简便，可重复性高，对仪器、材料的要求不高，是国内作简便，可重复性高

14、，对仪器、材料的要求不高，是国内检测检测EGFREGFR蛋白表达的主要方法。但蛋白表达的主要方法。但IHCIHC法在标本固定和处法在标本固定和处理中可能会使蛋白质变性破坏而影响检测结果，易造成假理中可能会使蛋白质变性破坏而影响检测结果，易造成假阴性或假阳性，且结果判断人为主观性较强。由于免疫组阴性或假阳性，且结果判断人为主观性较强。由于免疫组化方法因抗体类型与来源不同，以及所使用的评分系统的化方法因抗体类型与来源不同，以及所使用的评分系统的差异而导致结果差异，不同抗体可使结果范围从差异而导致结果差异，不同抗体可使结果范围从1212变至变至141444。14EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比

15、较分析讨论讨论 以以FISHFISH为标准，为标准，IHCIHC与之比较：与之比较：2 2例例IHCIHC法强阳性（法强阳性（3+3+）标本中，）标本中，FISHFISH检测检测EGFREGFR基因扩增均为阳基因扩增均为阳性，阳性预测值为性，阳性预测值为100%100%；3 3例例IHCIHC中等阳性（中等阳性（2+2+）标本中，）标本中，FISHFISH检测检测EGFREGFR基因扩增阳性为基因扩增阳性为2 2例，阳性预测值为例，阳性预测值为66.67%66.67%；1010例例IHCIHC弱阳性标本（弱阳性标本（1+1+），），FISHFISH检测检测EGFREGFR基因扩增阳性为基因扩增

16、阳性为5 5例例，阴性预测值为，阴性预测值为50%50%；2525例例IHCIHC阴性（阴性（-）标本中，）标本中，FISHFISH检测检测EGFREGFR基因扩增阴性为基因扩增阴性为1919例例，阴性预测值为，阴性预测值为76%76%。总体而言，两种方法的符合率较低。但其中总体而言，两种方法的符合率较低。但其中IHCIHC法法EGFREGFR表达（表达（3+3+）及（）及（2+2+）的标本，尤以强阳性（）的标本，尤以强阳性（3+3+）标本与）标本与FISHFISH检测检测EGFREGFR基因阳性的一致性较高，与有关文献报到有所不同基因阳性的一致性较高，与有关文献报到有所不同55，但该类，但该

17、类标本例数较少，仅占总例数的标本例数较少，仅占总例数的12.5%12.5%，其一致性是否可靠需要，其一致性是否可靠需要进一步验证。进一步验证。15EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析讨论讨论表表2.2963 2.2963 例乳腺癌例乳腺癌HER-2 HER-2 的的IHCIHC和和FISHFISH检测结果比较检测结果比较以 FISH作为标准IHC 与之比较，其阳性预测值在IHC阳性(+以上)标本中为 91.6%，阴性预测值在 IHC 阴性(0或+)标本中为97.2%，在IHC弱阳性和阳性(0或+)标本中其敏感性为92.6%，在IHC阳性标本中其敏感性为98.8%6。16EGFR荧光原位

18、杂交和免疫组化检测的比较分析讨论讨论 综上所述，综上所述，免疫组化法对于评价患者是否免疫组化法对于评价患者是否使用使用EGFREGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗并非最佳的手酪氨酸激酶抑制剂治疗并非最佳的手段，段，但可作为筛选检查。但可作为筛选检查。17EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析参考文献参考文献 1 Reiter J L,T hreadgill D W,Eley G D,et al.Comparat ivegenomic 1 Reiter J L,T hreadgill D W,Eley G D,et al.Comparat ivegenomic sequence analysis

19、and isolation ofhuman and mousealt ernative EGFR sequence analysis and isolation ofhuman and mousealt ernative EGFR transcripts encoding truncated recept or isofornlsJ.Genomics,2001,transcripts encoding truncated recept or isofornlsJ.Genomics,2001,71(1):1.71(1):1.22Jorissen RN,Walker F,Pouliont N,et

20、 al.Epidemal growth factor receptorJorissen RN,Walker F,Pouliont N,et al.Epidemal growth factor receptor：Mechanisms of activation and signalingJ.Exp Cell Res,2003Mechanisms of activation and signalingJ.Exp Cell Res,2003，284284（1 1）:31.:31.3 Cunningham D,Humblet Y,S iena S,et al.Cetuximab monotherapy

21、 and 3 Cunningham D,Humblet Y,S iena S,et al.Cetuximab monotherapy and cetuximab plus irinotecan in irinotecan-refractory metastatic colorectal cetuximab plus irinotecan in irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer J.N Engl J Med,2004,351(14):337-345.cancer J.N Engl J Med,2004,351(14):337-3

22、45.4Buckley AF4Buckley AF。Kakar sKakar scomparison of the Dako EGFR pharmI)xkit and Zymed comparison of the Dako EGFR pharmI)xkit and Zymed EGFR antibody for assessment of EGFR status incolorectal adenocarcinomaJEGFR antibody for assessment of EGFR status incolorectal adenocarcinomaJAppllmmunohistoc

23、hem Mol Mor_pholAppllmmunohistochem Mol Mor_phol，20072007，15(3)15(3)：30530930530955周晓秋，王东关，孙希印，高摇虹，王琳琳，李新功周晓秋，王东关，孙希印，高摇虹，王琳琳，李新功.非小细胞肺癌耘郧云砸基因非小细胞肺癌耘郧云砸基因和蛋白检测的比较分析和蛋白检测的比较分析J.J.临床与实验病理学杂志，临床与实验病理学杂志，2012,282012,28（1010）：）：1124-1132.1124-1132.66刘艳辉刘艳辉.乳腺癌组织乳腺癌组织HER-2HER-2的荧光原位杂交和免疫组化联合检测的评价的荧光原位杂交和免疫组化联合检测的评价J.J.循证医学循证医学，20062006，6(2)6(2)：81-83.81-83.18EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析19EGFR荧光原位杂交和免疫组化检测的比较分析