1、ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg免疫标记技术免疫标记技术1.定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。2.分类：放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP2ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg3ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg免疫酶测定法免疫酶测定法4ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,简称ELISA，它是实验室最常用的检测
2、方法，用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原。ELISA具有准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等领域。5ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg3、ELISA基本的实验过程 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化；抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定；酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色。7ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg ELISA的试剂ELISA中有中
3、有3 3个是必要的试剂：免疫吸附剂、标记物和显色剂。个是必要的试剂：免疫吸附剂、标记物和显色剂。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（聚苯乙烯板：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性）（2）酶标记的抗原或抗体（标记物）；（3）酶作用的底物（显色剂）；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）样品及标准本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液8ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法，主要类型有 双抗体夹心法、间接法
4、、竞争法、捕获法等。4、ELISA类别9ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg双抗体夹心法10ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg间接法11ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg以双抗体夹心法ELISA为例）：用抗体包被固相载体加入抗原Sample(二价以上)，温育加入酶标抗体，温育加入底物，显色清洗清洗清洗终止反应，底物显色深浅与待检抗原量成正比。利用已知浓度的抗原制成标准品，稀释为梯度浓度，对其最终OD值与浓度作标准曲线，那么样品的浓度可以根据最终的OD值在标准曲线上查出。12ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg实验内容：实验内容：双抗体夹心法测定乙肝表面抗原（HBsAg）定性定量检测
5、13ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg 1、掌握ELISA（双抗体夹心法）的原理 2、熟悉ELISA实验操作方法，并了解其应用实验目的实验目的14ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg实验材料实验材料HBsAgHBsAg酶联免疫分析试剂盒酶联免疫分析试剂盒HBsAgHBsAg阳性品，阴性对照品阳性品，阴性对照品移液枪，枪头移液枪，枪头湿盒湿盒酶标板，酶标仪酶标板，酶标仪一次性手套一次性手套记号笔记号笔计时器计时器15ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg实验步骤实验步骤16ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg结果判定结果判定定性测定定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性
6、”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者为阳性，N为阴性对照孔。定量测定：酶标仪测定450nm波长下的OD值，根据标准曲线计算样品抗原的浓度。17ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg 阳性：显色为黄色 阴性：无色1 2 3 4阴性阴性阴性阴性 阳性阳性阳性阳性18ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAgELISAELISA注意事项注意事项 加样应加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，避免产生气泡并迅速完成；一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。洗涤必须彻底，防止产生假阳性；温育常采用的温度有43、37、室温和4等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。ELISA板放在湿盒内，可在盒底垫湿的纱布，将ELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。温浴的时间要严格控制。19ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg课后问题 1、2、20ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg
