临床生物化学实验室基本知识69课件.ppt

1、临床生物化学实验室基本知识广医一附院检验科广医一附院检验科临床生物化学实验室基本知识广医一附院检验科教学内容与教学要求专业技术基本知识?常用玻璃仪器?常用基本仪器设备?常用试剂及纯水?临床生化检验样品?临床生化检验实验方法?临床生化检验质量控制?实验数据的有效使用行政管理基本知识教学内容与教学要求专业技术基本知识?常用玻璃仪器?常用基本仪实验用纯水实验用纯水天然水含有许多杂质点悬浮物?泥沙、藻类、植物遗体等粘土胶粒、溶胶等胶体物质?溶解物质?Na+/K+/Cl+/Ca+HCO3-/NH3有机物微生物天然水含有许多杂质点悬浮物?泥沙、藻类、植物遗体等粘土胶粒、天然水的处理天然水 简单的物理、化学

2、方法处理，除去悬浮物和部分无机盐。自来水 蒸馏、电渗析等处理，除去杂质。实验用纯水天然水的处理天然水 简单的物理、化学方法处理，除去悬浮物和纯水的制备方法蒸馏法：经典方法。理论上为“纯水”，但难除去挥发性物质和微滴。离子交换法：除去水中的阴、阳离子杂质。电渗透析法：除去水中的阴、阳离子杂质。炭吸附法：除去水中的有机物。超滤膜法：除去水中的悬浮物。混合纯水系统纯水的制备方法蒸馏法：经典方法。理论上为“纯水”，但难除去挥纯水的纯度检查指标电导率或电阻率?用电导仪或欧姆表测定；电导单位为西门子（S），电导是电阻的倒数；1S=1-1每cm长的电导为电导率（S.CM-1）可溶性硅检验细菌菌落计数纯水的纯

3、度检查指标电导率或电阻率?用电导仪或欧姆表测定美国NCCLS等级纯水的规定级别级级级微生物含量（最大菌落/ml）10 103未定pH 未定未定5.0-8.0电阻率（M/cm,25）10 2.0 1.0硅（mgSiO2,最大量）0.05 0.1 1.0 微粒（m微孔膜滤过）0.2 未定未定有机物活性炭过滤未定未定美国N C C L S 等级纯水的规定级别级级级微生物含量（最大NCCLS、CAP规定的等级纯水用途级别用途NCCLS 原子吸收、火焰光度、电解质、荧光、酶、高灵敏度层析、电泳、参比液、缓冲液 一般实验检验、玻璃器皿冲洗 玻璃器皿洗涤、要求不高的定性试验CAP 原子吸收、火焰光度、电解质

4、、血气、酶、无机元素、参比液、缓冲液 一般实验检验、血液学、血清学、微生物学 普通定性、尿液检验、组织切片、寄生虫、器皿洗涤N C C L S、C A P 规定的等级纯水用途级别用途N C C L S 影响实验用纯水质量的环节制备贮存运输使用所有环节均应避免污染。影响实验用纯水质量的环节制备贮存运输使用所有环节均应避免污染临床生物化学实验方法的选择与评价临床生物化学实验方法的选择与评价教学内容与教学安排实验方法选择与评价的流程实验方法的选择实验方法的评价教学内容与教学安排实验方法选择与评价的流程实验方法的选择实验实验方法选择与评价的流程方法选择方法选择方法评价方法发展 常规分析前的准备预防措施

5、 常规分析后的补充诊断性能常规分析统计质控结果报告实验方法选择与评价的流程 方法选择 方法评价临床生化实验方法的选择临床生化实验方法的选择实验方法选择的目的结合自身的条件，确定合适的、某项目的检测方法；保证拟使用的方法在正式使用前，已了解方法分析性能及可能引入的误差。实验方法选择的目的结合自身的条件，确定合适的、某项目的检测方实验方法的分级决定性方法（definitive method)：?准确度最高，系统误差最小，用于评价参考方法和一级标准品。准确度与精密度已充分证实的分析方法，干扰，系统误差小，用于鉴定常规方法和二级标准品。参考方法（reference method）：?常规方法（rout

6、ine method）：?性能指标符合临床需要，有适当分析范围，经济实用，用于临床常规标本的检测。实验方法的分级决定性方法（d e f i n i t i v e me t h o d三级实验方法的关系图应用范围增加准确决定性方法决定性方法度参考方法增加常规方法三级实验方法的关系图应用范围增加准确决定性方法度参考方法增加临床生化部分项目的三级方法决定性方法参考方法常规方法钾ID-MS 火焰光度法 离子选择电极钠中子活化法火焰光度法 离子选择电极总蛋白凯氏定氮法双缩脲法肌酐ID-MS 离子交换层析 苦味酸比色法葡萄糖ID-MS 己糖激酶法G氧化酶法AST MDH-NADH法赖氏法ALT LDH-

7、NADH法赖氏法临床生化部分项目的三级方法决定性方法参考方法常规方法钾I D-用什么来评价和校正以上方法方法是干什么的？标准物质用什么来评价和校正以上方法方法是干什么的？标准物质标准试剂又称标准品，参考物（reference material）?它是一种或几种物理或化学性质已经充分确定，可用以校正仪器和某种测定方法的物质。用途?是进行方法学评价、仪器校正、常规分析的质量控制等不可缺少的物质。标准试剂又称标准品，参考物（r e f e r e n c e ma t e r i标准试剂的分级一级标准品（原级参考物）：?由决定性方法或高度准确的若干方法定值。杂质含量确定，有证书；用于校正决定性方法，

8、评价及校正参考方法，为二级标准品定值。由实验室自配或商品，以参考方法用一级标准品定值。用于常规方法的标化或控制物定值。以参考方法用一级或二级标准品定值，用于常规质量控制，不用于标定仪器或方法。二级标准品（次级参考物）：?控制物：?标准试剂的分级一级标准品（原级参考物）：?由决定性方法或高度各级分析方法和标准品的关系决定性方法一级标准品参考方法二级标准品常规方法控制物各级分析方法和标准品的关系决定性方法一级标准品参考方法二级标选择什么样的方法好？最好？较好？好？一般？差？选择什么样的方法好？最好？较好？好？一般？差？实验方法选择的原则一切从实际出发，确定适当的方法。选择常规方法时，尽量选择国内外

9、通用方法或推荐方法。重点考虑的性能指标：?实用性：微量快速、方法简便、安全可靠、经济实惠。?可靠性：精密性准确度高，灵敏度高，线性好，干扰少。CV5%，CB5%。实验方法选择的原则一切从实际出发，确定适当的方法。选择常规方实验方法选择的步骤广泛查阅文献：?对各种方法进行优、缺点比较论证。符合实用性、可靠性要求。精密度、准确性、线性范围、仪器与试剂要求、操作难易等进行试验。选定候选方法：?进行初步试验：?实验方法选择的步骤广泛查阅文献：?对各种方法进行优、缺点比较临床生化方法的建立临床生化方法的建立临床生化方法的建立方法原理确定：?根据不同类型的方法有不同的原理光谱法、层析法、电泳法、酶法等实验

10、条件选择：?合适的吸收光谱、PH、杂质干扰、反应的温度和时间、稳定性试验。临床生化方法的建立方法原理确定：?根据不同类型的方法有不同临床生化实验方法学的评价临床生化实验方法学的评价实验方法学评价目的通过对实验误差的测定，决定侯选方法是否可以被接受。实验方法学评价目的通过对实验误差的测定，决定侯选方法是否可以方法评价的基本内容通过实验途径，测定并评价方法的准确度和精密性。不论精密度还是准确度强调的都是对误差的测定。方法评价的基本内容通过实验途径，测定并评价方法的准确度和精密方法评价的基本步骤评价前阶段?评价前实验：最适条件的研究初步评价：批内重复、干扰、回收试验最后评价：批间重复、比较方法对比、

11、总体判断评价后实验：临床相关研究方法应用：建立质控系统，引入常规工作等。评价阶段?评价后阶段?方法评价的基本步骤评价前阶段?评价前实验：最适条件的研究初步实验误差实验误差的类型?系统误差（systematic error,SE）随机误差（random error,RE）平均误差标准偏差绝对或相对误差和偏差变异系数实验误差的表示方法?实验误差实验误差的类型?系统误差（s y s t e ma t i c e方法评价指标精密度（precision）准确度（accuracy）特异度（specificity）干扰（interference）检测能力（detection limit）方法评价指标精密度（

12、p r e c i s i o n）准确度（a c c u r a评价实验重复性试验回收试验干扰试验方法对比试验评价实验重复性试验回收试验干扰试验方法对比试验分析误差类型与评价实验的关系分析误差的类型偶然误差恒定误差比例误差评价实验初步试验最后试验批内重复批间重复干扰与比较方法对比回收分析误差类型与评价实验的关系分析误差的类型偶然误差恒定误差比重复性试验（1）目的：?考察候选方法的随机（偶然）误差。衡量精密度。对同一材料分成数份试验样品进行多次（n=20）测定，计算X、S、CV。方法：?重复性试验（1）目的：?考察候选方法的随机（偶然）误差。衡量重复性试验（2）形式：?批内重复性试验，天内重复

13、性试验，天间重复性试验，病人标本的平行双份测定。注意问题：?分析样品的选择：标准液、质控液、病人标本均可。分析物浓度的选择：医学决定水平重复性试验（2）形式：?批内重复性试验，天内重复性试验，天间回收试验（1）目的：?测定候选方法的比例系统误差，衡量准确度。将被测标准液加入常规分析物（病人标本）中，成为分析标本，测定计算回收率。回收率=回收浓度/加入浓度100%，理想回收率100%，一般要求为95%105%方法：?回收试验（1）目的：?测定候选方法的比例系统误差，衡量准确度回收试验（2）注意事项：?吸量准确；加入标准液后，其实验样品的被子测浓度最好达到医学决定水平；总浓度必须在方法分析范围内；

14、需加入高中低不同浓度回收试验，计算平均回收率；加入标准液的体积一般在 10%内；重复2-3次。回收试验（2）注意事项：?吸量准确；加入标准液后，干扰试验（1）目的?评价候选方法准确度，发现恒定系统误差。与回收试验相似，但加入的是干扰物质。干扰值分析标本测得值基础标本测得值方法：?干扰试验（1）目的?评价候选方法准确度，发现恒定系统误差。与干扰试验（2）注意事项?被试验的物质：胆红素、溶血、防腐剂、抗凝剂、药物等可疑干扰物的浓度：干扰物浓度有可能达到病理标本最高浓度值。空白对照，物理、化学方法分离干扰物双波长微量样本（标本与试剂比例加大）消除干扰常用方法?干扰试验（2）注意事项?被试验的物质：胆

15、红素、溶血、防腐剂对比试验（1）目的?用于评价候选方法的系统分析误差分析误差的性质，包括比例和恒定两种系统误差。对同一组病人标本用候选方法和对比方法同时进行分析测定；分析二者差异。方法：?对比试验（1）目的?用于评价候选方法的系统分析误差分析误差对比试验（2）注意事项：?比较方法的选择：最好为参考方法标本数：一般为40100，分析物浓度：最好包括各种情况重复分析：最好分批测定 2次时间间隔：每天2-5个标本，20天图示结果统计处理对比试验（2）注意事项：?比较方法的选择：最好为方法学评价实验小结重复性试验：?测定候选方法的偶然误差，衡量精密度。回收试验：测定比例系统误差，衡量准确度。干扰试验：

16、?测定恒定系统误差，衡量准确度。方法对比试验：?检测候选方法的系统分析误差。?方法学评价实验小结重复性试验：?测定候选方法的偶然误差，衡量方法学性能判断原则候选方法接受与否，?根据实验误差结果进行归纳，作出判断。?依据Westgard制定的“可允许误差的95%限度”，计算各项误差与其比较，任何一项大于可允许误差（标准限）都不能被接受。方法学性能判断原则候选方法接受与否，?根据实验误差结果进行归方法学性能标准性能标准（Performance Standards，PS)，也称分析目标，由允许分析误差和医学决定水平这两项内容决定。?允许分析误差（EA）：表示95%的样本允许误差限度。?医学决定水平（

17、Xc）：具有临床意义的分析物浓度。EA和Xc两项是一个测定方法的性能指标。方法学性能标准性能标准（P e r f o r ma n c e S t a n d a文献报道的性能指标测定项目 医学决定水平 允许误差（barneff）钾3.0mmol/L 0.56.0mmol/L 0.5钙11mgl/dL 0.5葡萄糖11mgl/dL 10.0100mg/dL 10.0120mg/dL 10.0总蛋白7.0g/dL 0.6文献报道的性能指标测定项目医学决定水平允许误差（b a r n e f方法学性能标准制定原则制定性能标准，要反映临床应用与解释结果的要求（医学效用限度），又要基本符合实验室所能做

18、到的技能状态。方法学性能标准制定原则制定性能标准，要反映临床应用与解释结果目前常用的性能判断指标单值判断指标可信区间判断指标?较复杂，客观，起最后判断作用目前常用的性能判断指标单值判断指标可信区间判断指标?较复杂，单值判断指标误差类别随机误差（RE）备注STM=重复试验的标准差比例误差（PE）(|R-100|)(XC/100)EAR=平均回收率恒定误差(CE)|偏差|EA由干扰试验测出系统误差(SE)|(a+bXc)-Xc|EA对比试验回归方程总误差(TE)RE+SEEA包括偶然及系统误差结果判断结果判断:试验样品较小试验样品较小,其分析误差可靠性差其分析误差可靠性差,只有假设实只有假设实验结

19、果正确的前提下才能按上表计算验结果正确的前提下才能按上表计算判断指标1.96STMEA单值判断指标误差类别随机误差（R E）备注S T M=重复试验的标可信区间判断指标误差类别随机误差比例误差恒定误差系统误差总误差实验接受指标EUEA重复性1.96STMUEA回收|RU或L-100|U(XC/100)EA*干扰|d|+t(sd)/NUEA*对比|(a+bXcW)-XC|UEA*重复(1.96STMU)2+W2 (1.96STML)2+W2对比+|a+bXc)-XC|EA#*特例:当RU100RL,PEL=0*特例:当t(sd)/NL/偏差/,CEL=0*特例:当(a+bXc+W)XC(a+bX

20、c-W),CEL=0#特例:当SE=0,TE=RELLL可信区间判断指标误差类别随机误差比例误差恒定误差系统误差总误评价实验书面报告内容?原理、试剂配制、所用器材、操作步骤等可接受或不被接受评价后实验和应用阶段。结论?后期工作?评价实验书面报告内容?原理、试剂配制、所用器材、操作步骤等可常规分析前的准备常规分析前的准备教学内容与教学要求制定参考值临床病例观察质量控制观察教学内容与教学要求制定参考值临床病例观察质量控制观察制定参考值参考个体（预定标准个体）参考人群参考标本参考值（X）将病人标本参考分布（正态或偏态）的结果与之参考限（计算S）对照参考区间（X2S）制定参考值参考个体（预定标准个体）

21、参考人群 参考标本 参考临床病例观察（1）常规标本的测定特殊标本的测定高低值?溶血?药物干扰?临床病例观察（1）常规标本的测定特殊标本的测定高低值?溶血?临床病例观察（2）观察指标?诊断特异性、灵敏度和准确度?与疾病发生概率有关?预示值?一项诊断试验确定或排除某些疾病存在与否的诊断概率。?表示诊断与排除把握程度多少临床病例观察（2）观察指标?诊断特异性、灵敏度和准确度?与疾质量控制观察质控物与日常工作测定，连续测定一个月。观察常规实验中的准确性和精密性。质量控制观察质控物与日常工作测定，连续测定一个月。观察常规实诊断试验的诊断性能评价诊断试验的诊断性能评价诊断性能评价与技术性能评估采样检测机体

22、标本信息（状态）（指标）（数据）判断、推断?指标能否反映状态？诊断准确性？疾病临床试验流行病学调查数据是否真实？检测准确性？样本实验室实验统计学分析诊断性能评价与技术性能评估采样检测机体标本检验诊断性能评价两个层次非量化的临床意义解释（判断疾病及程度）?内容：参考值（健康状态健康或疾病）医学决定水平（状态与要求程度与措施）?基础：病理生理、生化知识等医学知识量化的诊断性能评估（判断的可信度）?内容：诊断灵敏度、诊断特异性、诊断正确率阳性预示值、阴性预示值、实验有效率阳性似然比、阴性似然比?基础：遵循EBM原则的临床随机对照试验检验诊断性能评价两个层次非量化的临床意义解释（判断疾病及程度检验项目

23、临床意义的解释（判断有无疾病以及疾病的程度）检验项目临床意义的解释（判断有无疾病以及疾病的程度）参考值1969年，Grasbeck首先提出，经IFCC认可，“参考值”与“参考范围”概念：?规定人群中抽样进行测定，由此得到的均数及分布范围，作为代表人群的判断参考参考个体指选择用于决定界点的个体，参考总体指所有参加抽样的参考个体，参考值指反映总体的观察值，参考值分布指参考样本观察值的分布，参考限指参考分布值上、下限参考值1 9 6 9 年，G r a s b e c k 首先提出，经I F C C 认可，参考值确定确定参考值：将参考总体的结果，经统计学处理求出X和S，通常参考值定为X2S，非正态分

24、布用百分位数表示参考值应着重考虑样本代表性和可用性参考值确定确定参考值：将参考总体的结果，经统计学处理求出X 和正常人与病人的分布曲线图正常人与病人的分布曲线图医学决定水平医学决定水平指临床按照不同病情给予不同处理的指标阈值一个诊断试验一般确定三个决定水平：提示需要进一步检查的阈值提示需要治疗措施的界点提出预后或要紧急处理的界值医学决定水平医学决定水平指临床按照不同病情给予不同处理的指标医学决定水平实例分析血清cTnI浓度0.1g/L 0.8g/L正常可疑AMI医学决定水平实例分析血清c T n I 浓度0.1 g/L 诊断试验诊断价值评估诊断试验诊断价值评估评估指标与患病情况的关系患病情况有

25、病无病流行率阳性预测值诊断阳性真阳性假阳性试验结果阴性假阴性真阴性敏感性特异性阴性预测值阳性似然比评估指标与患病情况的关系患病情况有病无病流行率阳性预测值诊断诊断试验准确性准确性（accuracy，AC）又称真实性（validity），是诊断试验测量值与实际值的符合程度，即判断受试者有病与无病的能力。常见指标?灵敏度、特异性；漏诊率、误诊率一致性：诊断准确度、Kappa指数诊断试验准确性准确性（a c c u r a c y，A C）又称真实性（v灵敏度灵敏度（sensitivity,Sen）又称敏感性、真阳性率（True positive rate，TPR），指在患病者中，应用该诊断试验检查

26、得到阳性结果的百分比。灵敏度反映诊断试验正确地识别患病者的能力,该值愈大愈好。真阳性灵敏度-100%真阳性假阴性灵敏度灵敏度（s e n s i t i v i t y,S e n）又称敏感性、特异度特异度(specificity,Spe)又称特异性、真阴性率（True negative rate，TNR），指在非某病者中，应用该试验获得阴性结果的百分比。特异度反映诊断试验正确地鉴别非患者的能力，该值愈大愈好。真阴性特异度-100%假阳性真阴性特异度特异度(s p e c i f i c i t y,S p e)又称特异性、预测值预测值（predictive value,PV）也称预告值或诊断

27、价值，包括阳性预测值和阴性预测值，分别表示诊断试验结果确定或排除某种疾病存在与否的诊断概率。预测值受流行率的影响。预测值预测值（p r e d i c t i v e v a l u e,P V）也称预阳性预测值阳性预测值(positive predictive value，PPV或PV)表示在诊断试验结果为阳性的人数中，真正患病者所占的百分率，即试验结果阳性者属于真病例的概率。也叫患病的试验后可能性。真阳性阳性预测值-100%真阳性假阳性阳性预测值阳性预测值(p o s i t i v e p r e d i c t i v e阴性预测值阴性预测值(negative predictive v

28、alue，NPV或PV)表示在诊断试验结果为阴性的人中，非患病者所占的百分率，即试验结果阴性者属于非病例的概率。也叫非患病的试验后可能性。真阴性阴性预测值-100%真阴性假阴性阴性预测值阴性预测值(n e g a t i v e p r e d i c t i v e诊断试验的选择原则临床灵敏度?指诊断试验检出阳性病人的百分率（TP率）指诊断试验检出阴性百分率（TN）灵敏度高，漏诊率低，误诊率高；特异性高，漏诊率高，误诊率低临床多采用灵敏度与特异性相结合的方法临床特异性?选择原则?诊断试验的选择原则临床灵敏度?指诊断试验检出阳性病人的百分率受试者工作特征曲线受试者工作特征曲线ROC曲线的概念受

29、 试 者 工 作 特 征 曲 线（receiveroperator characteristic curve,ROC曲线），是根据一系列不同的二分类方式（分界值或决定阈），以真阳性率（灵敏度）为纵坐标，假阳性率（1特异度）为横坐标绘制的曲线。R O C 曲线的概念受试者工作特征曲线（r e c e i v e r o p e rROC曲线的主要作用ROC曲线能很容易地查出任意界限值时的对疾病的识别能力。选择最佳的诊断界限值。两种或两种以上不同诊断试验对疾病识别能力的比较。R O C 曲线的主要作用R O C 曲线能很容易地查出任意界限值时的对受试工作曲线（ROC）不同分界值的阳性率、阴性率和假

30、阳性率（CK为例）分界值，血清CK水平（U/L）百分率（%）280 80 40 1TP 42 93 99 100TN 99 88 68 0FP 1 12 32 100将上表数据，以TP率对FP率作图，并将对于每对TP率和FP率的点（代表不同分界值）连接起来就得一条ROC曲线受试工作曲线（R O C）不同分界值的阳性率、阴性率和假阳性率（1.000.900.800.700.60阳性0.40率0.300.100.00阴性率0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00曲图140线 2807，-ROC0.502800.200.10 0.20 0.3

31、0 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00假阳性率1.0 0 0.9 0 0.8 0 0.7 0 0.6 0 阳性0.4 0 率0.3ROC曲线ROC曲线值得注意的性质,如图左上角代表一个完美的诊断试验TP=1.00,FP=0.00,最靠近左上角的ROC曲线上的点是犯错最少的最好分界值,在这点,假阳性和假阴性最低ROC曲线除了选择适合的分界值外,也可用于比较诊断同种疾病的两个不同诊断试验。这时最靠近左上角的一条ROC曲线所代表的诊断试验最准确R O C 曲线R O C 曲线值得注意的性质,如图左上角代表一个完美的THE ENDT H E E N Ds&w)z1C4

32、F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjU

33、mXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B

34、2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePh

35、TkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)

36、z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9L9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9K

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