平滑肌和哮喘培训课件.ppt

1、平滑肌和哮喘第一节第一节 气道平滑肌生理气道平滑肌生理 气道平滑肌细胞呈长梭形，两端有树气道平滑肌细胞呈长梭形，两端有树状突起。肌细胞平行排列组成肌束，肌束状突起。肌细胞平行排列组成肌束，肌束之间被含有胶原和弹性纤维的空隙分隔。之间被含有胶原和弹性纤维的空隙分隔。平滑肌和哮喘2 气道平滑肌细胞没有明显的横纹，主要气道平滑肌细胞没有明显的横纹，主要因为其肌原纤维的肌小节排列不整齐。因为其肌原纤维的肌小节排列不整齐。组成肌小节的收缩成分为粗肌丝和细肌组成肌小节的收缩成分为粗肌丝和细肌丝。丝。平滑肌和哮喘3 粗肌丝由肌球蛋白（粗肌丝由肌球蛋白（myosinmyosin）每个肌球蛋白每个肌球蛋白 2

2、2个高分子量亚单位（重链，分子量为个高分子量亚单位（重链，分子量为 200kD 200kD）两个不同类型的低分子量亚单位（轻链，两个不同类型的低分子量亚单位（轻链，分子量分别为分子量分别为20kD20kD和和17kD17kD）HHL HHL1 1L L2 2组成方式。组成方式。平滑肌和哮喘4平滑肌和哮喘5 2 2条重键的尾部相互缠绕形成粗肌丝的主条重键的尾部相互缠绕形成粗肌丝的主干，头部伸出粗肌丝主干形成横桥。干，头部伸出粗肌丝主干形成横桥。头部含有与细肌丝结合的位点及头部含有与细肌丝结合的位点及ATPATP酶活酶活性位点性位点。平滑肌和哮喘6 细肌丝的成分为肌纤蛋白，当胞浆细肌丝的成分为肌纤

3、蛋白，当胞浆CaCa2+2+浓浓度升高到一定水平时，呈游离状态的球度升高到一定水平时，呈游离状态的球形肌纤蛋白单体聚合成纤维状的细肌丝。形肌纤蛋白单体聚合成纤维状的细肌丝。平滑肌和哮喘7气道平滑肌收缩的启动机制：气道平滑肌收缩的启动机制：肌细胞膜电位去极化或膜受体激活，肌细胞膜电位去极化或膜受体激活，钙通道开放，引起外钙内流或胞内钙库释钙通道开放，引起外钙内流或胞内钙库释放，使胞浆放，使胞浆CaCa2+2+浓度增高，浓度增高，平滑肌和哮喘8 Ca2+钙调素（钙调素（CaM）形成形成Ca2+-CaM复合物复合物（Ca2+)4-CaM-MLCK三元复合物三元复合物 +肌球蛋白轻链激酶（肌球蛋白轻链

4、激酶（MLCK）肌球蛋白轻链激酶肌球蛋白轻链激酶（MLCK）平滑肌和哮喘9 肌球蛋白轻链磷酸化肌球蛋白轻链磷酸化 粗、细肌丝结合，水解粗、细肌丝结合，水解ATPATP释放能量使横桥释放能量使横桥摆动摆动,启动平滑肌的横桥循环，肌细胞产生启动平滑肌的横桥循环，肌细胞产生机械收缩。机械收缩。平滑肌和哮喘10平滑肌和哮喘11 第二节第二节 气道平滑肌与哮喘气道平滑肌与哮喘 哮喘是一种常见的累及各年龄哮喘是一种常见的累及各年龄组的慢性阻塞性肺疾病，以气道高反应组的慢性阻塞性肺疾病，以气道高反应性和可逆性气道阻塞为主要临床特征。性和可逆性气道阻塞为主要临床特征。随着对哮喘发病机制的深入研究，气道随着对哮

5、喘发病机制的深入研究，气道平滑肌（平滑肌（airway smooth muscleairway smooth muscle，ASMASM）在哮喘气道高反应性产生中的作用日益在哮喘气道高反应性产生中的作用日益受到重视。它的增生和肥大可引起气道受到重视。它的增生和肥大可引起气道结构重建，直接影响哮喘患者气道高反结构重建，直接影响哮喘患者气道高反应性的产生。应性的产生。平滑肌和哮喘12l ASMl ASM在气道高反应性产生中的作用在气道高反应性产生中的作用1 1）单单位（单单位（Single-UnitSingle-Unit）及多单位）及多单位（Multi-UnitMulti-Unit）型平滑肌）型平

6、滑肌 气道平滑肌可以分为单单位及多单位气道平滑肌可以分为单单位及多单位两种类型，单单位平滑肌肌细胞之间神经两种类型，单单位平滑肌肌细胞之间神经分布稀疏，具有明显的自发性节律运动；分布稀疏，具有明显的自发性节律运动；多单位平滑肌神经分布密集，不具有自发多单位平滑肌神经分布密集，不具有自发的节律运动。有人认为正常人的节律运动。有人认为正常人ASMASM是多单是多单位型，而哮喘患者则变为单单位型。位型，而哮喘患者则变为单单位型。平滑肌和哮喘13平滑肌和哮喘14 KroegerKroeger等研究氯化四乙铵对等研究氯化四乙铵对ASMASM的影响时的影响时发现，在哮喘的发病过程中，发现，在哮喘的发病过程

7、中，ASMASM由多单由多单位型向单单位型转化。单单位状态兴奋性位型向单单位型转化。单单位状态兴奋性增加，易发生哮喘；增加，易发生哮喘；平滑肌和哮喘15 NewmanNewman等等认为，正常人认为，正常人ASMASM具有单单位型具有单单位型特征，但表现形式较弱，哮喘时则以较强特征，但表现形式较弱，哮喘时则以较强的形式表现出来。认为的形式表现出来。认为ASMASM由多单位型向由多单位型向单单位型转变，可能与气道高反应性的产单单位型转变，可能与气道高反应性的产生有关。因为在生有关。因为在ASMASM内任何一点受刺激，内任何一点受刺激，都导致整个气管都导致整个气管-支气管树的电扩散支气管树的电扩散

8、。平滑肌和哮喘162 2）ASM ASM体积增加体积增加 严重、慢性哮喘患者严重、慢性哮喘患者ASMASM数量增多，数量增多，可产生较大的肌张力，气道壁厚度增厚，可产生较大的肌张力，气道壁厚度增厚，使气道阻力变大，均可使其气道反应性进使气道阻力变大，均可使其气道反应性进一步亢进。然而，用狗所作实验结果表明，一步亢进。然而，用狗所作实验结果表明，支气管对组胺的敏感性与其平滑肌的厚度支气管对组胺的敏感性与其平滑肌的厚度无任何关系。无任何关系。平滑肌和哮喘173 3）ASM ASM舒缩运动反应性增强舒缩运动反应性增强 理化或药物因素，甚至运动和吸入冷空气理化或药物因素，甚至运动和吸入冷空气所致哮喘发

9、作的症状和体征，均在应用所致哮喘发作的症状和体征，均在应用-肾上腺素能受体兴奋剂后迅速消失，肾上腺素能受体兴奋剂后迅速消失，从而提示气道反应性亢进主要是平滑肌过从而提示气道反应性亢进主要是平滑肌过度收缩，而非呼吸道粘膜水肿、粘液栓塞度收缩，而非呼吸道粘膜水肿、粘液栓塞等原因所致。还有人发现哮喘患者吸入支等原因所致。还有人发现哮喘患者吸入支气管活性药物后，气道阻力的剂量气管活性药物后，气道阻力的剂量-效应效应斜率增大。反映气道平滑肌舒缩反应性增斜率增大。反映气道平滑肌舒缩反应性增强。强。平滑肌和哮喘18 MccaigMccaig应用玻璃微电极研究豚鼠应用玻璃微电极研究豚鼠ASMASM的电的电生理

10、特性，发现反复吸入卵蛋白气溶胶后，生理特性，发现反复吸入卵蛋白气溶胶后，豚鼠豚鼠ASMASM电位显著降低，对组胺、异丙肾电位显著降低，对组胺、异丙肾上腺素的反应性亦发生变化。上腺素的反应性亦发生变化。平滑肌和哮喘19 BensonBenson认为在药物刺激和平滑肌收缩之间认为在药物刺激和平滑肌收缩之间存在着存在着“S”“S”型曲线关系。起初，当刺激型曲线关系。起初，当刺激增加时平滑肌几乎没有反应，但其增加时平滑肌几乎没有反应，但其“活性活性状态状态”在增高；随着刺激增强，由于平滑在增高；随着刺激增强，由于平滑肌对药物的敏感性增高，反应骤然增加。肌对药物的敏感性增高，反应骤然增加。因而推测，哮喘

11、患者的某些体液和神经性因而推测，哮喘患者的某些体液和神经性因素可促使支气管平滑肌的静息因素可促使支气管平滑肌的静息“活性状活性状态态”增高增高 ，以致在接受刺激前平滑肌就，以致在接受刺激前平滑肌就处于处于“S”“S”型曲线较陡直部分，从而对低型曲线较陡直部分，从而对低浓度的药物刺激显示急剧增强的反应。浓度的药物刺激显示急剧增强的反应。平滑肌和哮喘204 4）气道管腔狭窄对）气道管腔狭窄对ASMASM收缩效应的影响收缩效应的影响 某些情况下，气道几何形状改变可以某些情况下，气道几何形状改变可以增加增加ASMASM的收缩效应。哮喘患者气道炎症细的收缩效应。哮喘患者气道炎症细胞渗出，基底膜增厚、粘液

12、腺及杯状细胞胞渗出，基底膜增厚、粘液腺及杯状细胞增生、肌层增厚，使气道管壁增厚，管腔增生、肌层增厚，使气道管壁增厚，管腔部分阻塞，横截面积明显减小，气道阻力部分阻塞，横截面积明显减小，气道阻力加大。此时轻度的肌肉收缩就可能造成管加大。此时轻度的肌肉收缩就可能造成管腔的严重阻塞。以往研究也已表明，在气腔的严重阻塞。以往研究也已表明，在气道壁增厚的情况下，轻度的肌肉缩短可引道壁增厚的情况下，轻度的肌肉缩短可引起较显著气道狭窄。起较显著气道狭窄。平滑肌和哮喘21 MorenoMoreno等等曾描述气道壁面积与肌内缩短引曾描述气道壁面积与肌内缩短引起的气道阻力变化之间的关系。非哮喘患起的气道阻力变化之

13、间的关系。非哮喘患者者ASMASM缩短缩短4040，气道阻力增加约，气道阻力增加约1515倍，倍，而哮喘患者而哮喘患者ASMASM同等程度缩短，气道阻力同等程度缩短，气道阻力增加增加290290倍。倍。平滑肌和哮喘225 5）平滑肌细胞内）平滑肌细胞内Ca+2Ca+2浓度升高浓度升高 细胞膜上存在两种主要的钙通道，一细胞膜上存在两种主要的钙通道，一种是电压依赖性钙通道（种是电压依赖性钙通道（VOCVOC），对膜电），对膜电位的改变非常敏感；另一种是受体依赖性位的改变非常敏感；另一种是受体依赖性钙通道（钙通道（ROCROC），对膜电位的改变不敏感。），对膜电位的改变不敏感。平滑肌和哮喘23 可以

14、设想，气道高反应性可能与细胞膜上可以设想，气道高反应性可能与细胞膜上钙通道的异常（引起钙流入增多）有关，钙通道的异常（引起钙流入增多）有关，但至今尚无实验直接证明。但至今尚无实验直接证明。另外，许多实验表明另外，许多实验表明CaCa2+2+有如下作用：有如下作用：促进肥大细胞介质释放，增加粘膜下腺体促进肥大细胞介质释放，增加粘膜下腺体分泌和炎性细胞的趋化作用分泌和炎性细胞的趋化作用 降低非肾上腺素非胆碱能（降低非肾上腺素非胆碱能（NANCNANC）抑制性）抑制性神经系统的效应。神经系统的效应。平滑肌和哮喘242 ASM2 ASM的增殖的增殖l l）ASM ASM的增殖的增殖 多年前人们已观察到

15、哮喘患者多年前人们已观察到哮喘患者ASMASM增厚，并增厚，并试图测量其厚度：纤毛功能缺陷或丧失的试图测量其厚度：纤毛功能缺陷或丧失的患者，患者，ASMASM的蠕动有利于清除气道内的分的蠕动有利于清除气道内的分泌物，并认为泌物，并认为ASMASM增厚是由肌细胞肥大所增厚是由肌细胞肥大所致，而非增生引起。致，而非增生引起。平滑肌和哮喘25 MesserMesser等研究发现，一组生前诊断为哮喘等研究发现，一组生前诊断为哮喘并死于哮喘持续状态的患者中并死于哮喘持续状态的患者中3434存在严存在严重的支气管平滑肌肥大；另一组死于哮喘重的支气管平滑肌肥大；另一组死于哮喘并发症者，只有并发症者，只有16

16、16的患者存在严重平滑的患者存在严重平滑肌肥大。他们同时还发现末梢呼吸性细支肌肥大。他们同时还发现末梢呼吸性细支气管也存在平滑肌的增生。气管也存在平滑肌的增生。平滑肌和哮喘26 DunnillDunnill等利用位点计数方法（等利用位点计数方法（Point-Point-count methodcount method）对哮喘持续状态患者及）对哮喘持续状态患者及正常人的支气管进行研究，发现前者的正常人的支气管进行研究，发现前者的ASMASM的百分体积显著增加（的百分体积显著增加（11.911.93.363.36），约为正常人（），约为正常人（4.64.62.22.2）的）的3 3倍；倍；同时对平

17、滑肌细胞核计数表明上述变化同时对平滑肌细胞核计数表明上述变化是由于肌细胞数增加，即平滑肌增生引是由于肌细胞数增加，即平滑肌增生引起。起。平滑肌和哮喘27 2 2）ASMASM增殖的的信号通路增殖的的信号通路(1)(1)气道平滑肌增殖的调节因子气道平滑肌增殖的调节因子 许多炎症因子在哮喘病人的支气管肺泡灌洗液中许多炎症因子在哮喘病人的支气管肺泡灌洗液中升高，有些已经证实在体外可又诱导气道平滑肌升高，有些已经证实在体外可又诱导气道平滑肌增殖。增殖。促有丝分裂原包括生长因子：如内皮生长因子促有丝分裂原包括生长因子：如内皮生长因子（EGFEGF）、胰岛素样生长因子、血小板源生长因）、胰岛素样生长因子、

18、血小板源生长因子（子（PDGFPDGF）的）的BBBB和和ABAB亚型和纤维生长因子。亚型和纤维生长因子。致痉剂：内皮素致痉剂：内皮素-1-1、组胺、组胺、P P物质、物质、5-HT5-HT和白三和白三烯烯D4D4。总体上，致痉剂（并非全部）激活。总体上，致痉剂（并非全部）激活G G蛋白蛋白耦联受体促进人类耦联受体促进人类ASMASM增殖。增殖。平滑肌和哮喘28(2)(2)体外调节气道平滑肌增殖的信号通路体外调节气道平滑肌增殖的信号通路 生长因子诱导有丝分裂通过激活酪氨酸激生长因子诱导有丝分裂通过激活酪氨酸激酶（酶（RTKRTK）炎细胞释放的致痉剂通过激活炎细胞释放的致痉剂通过激活G G蛋白耦

19、联受蛋白耦联受体体 细胞因子通过细胞膜表面的糖蛋白受体耦细胞因子通过细胞膜表面的糖蛋白受体耦联到联到SrcSrc家族酪氨酸激酶。家族酪氨酸激酶。平滑肌和哮喘29Figure 1.signal transduction mechanisms that regulate ASM proliferation.ASM mitogens act via RTKs,cytokine receptors,or GPCRs,to activate the small GTPase p21ras.The ERK and PI3K pathways are considered to be two major i

20、ndependent signaling pathways regulating ASM cell growth.平滑肌和哮喘303 ASM3 ASM增殖的近期研究增殖的近期研究近期研究已发现多种能促进近期研究已发现多种能促进ASMASM堵殖的生长堵殖的生长因子，它们分别来源于炎症细胞、气道上因子，它们分别来源于炎症细胞、气道上皮、血源性因子和生长因子。皮、血源性因子和生长因子。平滑肌和哮喘31 PanettieriPanettieri用组胺、血清和血小板源生长用组胺、血清和血小板源生长因子（因子（PDGFPDGF）刺激狗）刺激狗ASMASM细胞，发现组胺细胞，发现组胺等不仅诱导等不仅诱导AS

21、MASM细胞增殖，同时刺激平滑细胞增殖，同时刺激平滑肌细胞内原癌基因肌细胞内原癌基因c-fosc-fos表达。提示这种表达。提示这种原癌基因可能参与对这些分裂素的早期反原癌基因可能参与对这些分裂素的早期反应。表皮生长因子（应。表皮生长因子（EGFEGF）也能刺激狗）也能刺激狗ASMASM增殖，但作用较弱。增殖，但作用较弱。平滑肌和哮喘32 DelamereDelamere等用血小板源生长因子等用血小板源生长因子(PDGF)(PDGF)，表皮生长因子（表皮生长因子（EGFEGF）和血清刺激牛）和血清刺激牛ASMASM细细胞，发现这些分裂素经激活蛋白酪氨酸激胞，发现这些分裂素经激活蛋白酪氨酸激酶促

22、进平滑肌细胞的增殖。酶促进平滑肌细胞的增殖。StewartStewart等用内皮素等用内皮素-1-1和表皮生长因子和表皮生长因子（EGFEGF）刺激豚鼠）刺激豚鼠ASMASM，发现引起平滑肌细，发现引起平滑肌细胞增殖的机制与前者类似。另外，胞增殖的机制与前者类似。另外，PDGF-PDGF-ABAB、内皮素和血栓烷素、内皮素和血栓烷素A2A2可引起兔可引起兔ASMASM增增殖。殖。平滑肌和哮喘33 最新研究发现，溶酶体水解酶和最新研究发现，溶酶体水解酶和-氨基氨基糖苷脂酶能促进牛糖苷脂酶能促进牛ASMASM细胞的有丝分裂；细胞的有丝分裂；白介素一白介素一l l、血小板源生长因子、血小板源生长因子

23、(PDGF)(PDGF)、凝血酶能促进豚鼠凝血酶能促进豚鼠ASMASM细胞的有丝分裂。细胞的有丝分裂。目前对人目前对人ASMASM增殖的研究较少，仅发现表增殖的研究较少，仅发现表皮生长因子（皮生长因子（EGFEGF）有促有丝分裂作用。）有促有丝分裂作用。平滑肌和哮喘341 1）cAMP cAMP和和cGMPcGMP cAMP cAMP是是ASMASM细胞内一种重要的信号传导媒细胞内一种重要的信号传导媒介，内源性儿茶酚胺和介，内源性儿茶酚胺和2 2-肾上腺素能兴肾上腺素能兴奋剂可使其增加，它是哮喘时最常用的支奋剂可使其增加，它是哮喘时最常用的支气管扩张剂。气管扩张剂。PanettieriPane

24、ttieri等用培养的人等用培养的人ASMASM细胞研究细胞研究2 2 肾上腺素能受体腺苷酸激酶系统对细胞肾上腺素能受体腺苷酸激酶系统对细胞增殖的影响。增殖的影响。平滑肌和哮喘35 用用lumollumolL L、10umol10umolL L和和100umol100umolL L异异丙肾上腺素分别预处理细胞，然后用佛波丙肾上腺素分别预处理细胞，然后用佛波醇酯（醇酯（Phorbol 12-Myristate 13 Phorbol 12-Myristate 13 AcetateAcetate，PMA PMA，能刺激蛋白激酶，能刺激蛋白激酶C C引起细引起细胞胞DNADNA合成）或合成）或EGFE

25、GF（能活化酪氨酸激酶，（能活化酪氨酸激酶，刺激细胞增殖）刺激，其结果与应用单一刺激细胞增殖）刺激，其结果与应用单一分裂素产生的影响比较，发现异丙肾上腺分裂素产生的影响比较，发现异丙肾上腺素以剂量依赖方式完全抑制佛波醇酯素以剂量依赖方式完全抑制佛波醇酯PMAPMA诱导的诱导的DNADNA合成（合成（P P0.010.01），对表皮生长），对表皮生长因子（因子（EGFEGF）诱导的）诱导的DNADNA合成也抑制合成也抑制14143.53.5。平滑肌和哮喘36 用异丙肾上腺素和心得安（用异丙肾上腺素和心得安（受体阻受体阻滞剂）同时处理滞剂）同时处理ASMASM细胞，发现异丙肾上细胞，发现异丙肾上腺

26、素对佛波醇酯腺素对佛波醇酯PMAPMA诱导诱导DNADNA合成的抑制合成的抑制作用消失。同样，用可透入细胞的作用消失。同样，用可透入细胞的cAMPcAMP处理细胞，其增殖亦受到抑制。最近还处理细胞，其增殖亦受到抑制。最近还发现，经微量注射发现，经微量注射cAMPcAMP被催化的亚单位，被催化的亚单位，可抑制猪可抑制猪ASMASM的增殖。在牛的增殖。在牛ASMASM中，发现中，发现cAMPcAMP具有双重功能，在短时间内有促进具有双重功能，在短时间内有促进有丝分裂作用，长时间后对细胞则起抑有丝分裂作用，长时间后对细胞则起抑制作用。制作用。平滑肌和哮喘37 硝基类血管扩张剂和心钠素能引起硝基类血管

27、扩张剂和心钠素能引起ASMASM中中cGMPcGMP增加。尽管已发现这些因素能抑制血增加。尽管已发现这些因素能抑制血管平滑肌增殖，但是否能影响管平滑肌增殖，但是否能影响ASMASM的增殖，的增殖，目前尚未见报道。另外，最近发现肝素能目前尚未见报道。另外，最近发现肝素能抑制豚鼠抑制豚鼠ASMASM的增殖，其机制尚不清。的增殖，其机制尚不清。平滑肌和哮喘382 2）气道上皮的调节气道上皮的调节 收缩因子（如：内皮素）和舒张因子（如：收缩因子（如：内皮素）和舒张因子（如：NONO、PGE2PGE2）均来源于气道上皮。研究表明，）均来源于气道上皮。研究表明，内皮素内皮素-1-1能促进兔能促进兔ASMA

28、SM有丝分裂，而有丝分裂，而PGE2PGE2经经cGMPcGMP对对ASMASM的增殖起抑制作用的增殖起抑制作用。平滑肌和哮喘39 当哮喘患者气道上皮脱落时，当哮喘患者气道上皮脱落时，PGE2PGE2的增的增殖抑制作用和内皮素殖抑制作用和内皮素1 1的促有丝分裂作的促有丝分裂作用均消失。此时对用均消失。此时对ASMASM的影响应取决于此的影响应取决于此两种因子和气道上皮上的其它因子的平两种因子和气道上皮上的其它因子的平衡情况。衡情况。平滑肌和哮喘40 4 4 结结 论论 ASMASM的增生和肥大导致气道壁增厚，气道的增生和肥大导致气道壁增厚，气道几何形状改变；另外也引起平滑肌自身紧几何形状改变

29、；另外也引起平滑肌自身紧张性和收缩性增强，从而使哮喘患者气道张性和收缩性增强，从而使哮喘患者气道高反应性增加。高反应性增加。ASMASM细胞数目少量增加即细胞数目少量增加即可对气道高反应性产生显著影响。因此，可对气道高反应性产生显著影响。因此，ASMASM不仅参与哮喘的发病，而且还是决定不仅参与哮喘的发病，而且还是决定气道高反应性大小的最重要因素。气道高反应性大小的最重要因素。平滑肌和哮喘41 在哮喘发病过程中，在哮喘发病过程中，ASMASM的增生和肥大受的增生和肥大受到多种因素的调节，故在临床上对哮喘患到多种因素的调节，故在临床上对哮喘患者既要治疗气道的炎症反应，又要防治气者既要治疗气道的炎

30、症反应，又要防治气道的结构变化（如道的结构变化（如ASMASM增生）。增生）。平滑肌和哮喘42 而广泛应用的支气管扩张剂，而广泛应用的支气管扩张剂，-肾上腺肾上腺素能受体激动剂，则能抑制某些因素对素能受体激动剂，则能抑制某些因素对ASMASM的增殖性反应，但对经激活酪氨酸激的增殖性反应，但对经激活酪氨酸激酶起作用的生长因子所诱导的有丝分裂作酶起作用的生长因子所诱导的有丝分裂作用相对较弱。用相对较弱。平滑肌和哮喘43 第三节第三节 研究气道平滑肌的实验技术研究气道平滑肌的实验技术、气道平滑肌肌条制备、气道平滑肌肌条制备气道平滑肌离体肌条的制备广泛应用于收缩气道平滑肌离体肌条的制备广泛应用于收缩力

31、学、电学的生理或药理研究。根据实验力学、电学的生理或药理研究。根据实验条件不同，可制作螺旋形肌条和单气管环条件不同，可制作螺旋形肌条和单气管环肌条。肌条。平滑肌和哮喘44 螺旋形肌条制备螺旋形肌条制备：动物处死后，从甲状软骨：动物处死后，从甲状软骨至支气管分叉全程分离气管，仔细清除附至支气管分叉全程分离气管，仔细清除附着之结缔组织。用小木棒在气管腔内反复着之结缔组织。用小木棒在气管腔内反复摩擦，以去除气管粘膜上皮。用剪刀将气摩擦，以去除气管粘膜上皮。用剪刀将气管螺旋形剪开，即成肌条。将两端结扎固管螺旋形剪开，即成肌条。将两端结扎固定于肌浴槽内。肌浴槽外槽定于肌浴槽内。肌浴槽外槽3737恒温，内

32、恒温，内槽置槽置K-HK-H平衡液，通以平衡液，通以95%95%的的0 02 2和和5 5COCO2 2混混合气。合气。平滑肌和哮喘45 平滑肌和哮喘46 平滑肌和哮喘47 平滑肌和哮喘48 平滑肌和哮喘49 单气管环肌条制备单气管环肌条制备：取出气管、清除结缔组织后，根据实验动取出气管、清除结缔组织后，根据实验动物大小及实验需要，可横行切取气管段，物大小及实验需要，可横行切取气管段，每段长可含每段长可含1 1个或数个气管环。将一段环个或数个气管环。将一段环从气管软骨的中间纵行剪开，则成为气管从气管软骨的中间纵行剪开，则成为气管环肌条，两端固定于肌槽内，搔刮腔面去环肌条，两端固定于肌槽内，搔刮

33、腔面去除支气管上皮，可用于微电极记录或张力除支气管上皮，可用于微电极记录或张力记录实验。记录实验。平滑肌和哮喘51 二、气道平滑肌细胞分离、培养二、气道平滑肌细胞分离、培养 气道平滑肌细胞培养主要用于测定细胞的气道平滑肌细胞培养主要用于测定细胞的增殖、分泌及蛋白质合成等。增殖、分泌及蛋白质合成等。移植块法移植块法 分离牛、猪等大动物的分离牛、猪等大动物的3 34 4级支气管，清级支气管，清除结缔组织及支气管上皮。将平滑肌剪碎除结缔组织及支气管上皮。将平滑肌剪碎成小于成小于lmmlmm的组织块，种植于用胶原蛋白的组织块，种植于用胶原蛋白包被的培养瓶中。包被的培养瓶中。平滑肌和哮喘52 F12F1

34、2或或RPMI1640RPMI1640培养液，内含胰岛素、生培养液，内含胰岛素、生长因子（如长因子（如 PDGF PDGF）、抗生素等。）、抗生素等。在在3737、5%CO5%CO2 2饱和湿度空气中培养，每饱和湿度空气中培养，每2 23 3天更换一次培养液。天更换一次培养液。待细胞从组织块向四周生长并铺满整个瓶待细胞从组织块向四周生长并铺满整个瓶底时（底时（7 7天左右），可进行实验或传代。天左右），可进行实验或传代。平滑肌和哮喘53酶消化法酶消化法雄性雄性SDSD大鼠（大鼠（10-12W10-12W）引颈处死，无菌取出气）引颈处死，无菌取出气管管置于置于4 4摄氏度摄氏度HBSSHBSS剥

35、离出结缔组织等附属组织，把平滑肌剪成剥离出结缔组织等附属组织，把平滑肌剪成1MM1MM3 3 的小块的小块HBSSHBSS洗洗2-32-3次，加入次，加入1ml1ml消化液（胶原酶四消化液（胶原酶四2mg/ml,2mg/ml,木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶1mg/ml1mg/ml）培养箱内孵育培养箱内孵育3737摄氏度，摄氏度，5%CO5%CO2 2，消化，消化30min30min，其间吹打继续消化其间吹打继续消化30min30min或者或者4 4摄氏度过夜，消化摄氏度过夜，消化10 min10 min左右左右平滑肌和哮喘54待瓶内液体变浑浊后，待瓶内液体变浑浊后，980rmp/min,980rmp/m

36、in,离心离心10min10min用完全培养基洗两次，离心后收获细胞，用完全培养基洗两次，离心后收获细胞，并悬浮于完全培养基制成悬浮液并悬浮于完全培养基制成悬浮液接种于培养瓶，培养箱内孵育接种于培养瓶，培养箱内孵育3737摄氏度，摄氏度，5%CO5%CO2 22020分钟后取上清液于新培养瓶，培养箱分钟后取上清液于新培养瓶，培养箱内孵育内孵育3737摄氏度，摄氏度，5%CO5%CO2 23 3天后贴壁，生长最快一般在天后贴壁，生长最快一般在10-2010-20天，天，25-3025-30天长满瓶底待细胞融合后天长满瓶底待细胞融合后以胰酶消化传代，每以胰酶消化传代，每3-43-4更换培养液，第更

37、换培养液，第3-53-5代细胞用于实验代细胞用于实验 平滑肌和哮喘55 气道平滑肌细胞在培养增殖状态仍可特异气道平滑肌细胞在培养增殖状态仍可特异性表达平滑肌肌球蛋白重链（性表达平滑肌肌球蛋白重链（sm-MHCsm-MHC）和）和平滑肌平滑肌肌动蛋白（肌动蛋白（sm-actinsm-actin），可），可用特异性抗体进行免疫细胞化学鉴定或用用特异性抗体进行免疫细胞化学鉴定或用cDNAcDNA探针原位杂交鉴定。探针原位杂交鉴定。平滑肌和哮喘56。组织块组织块X10平滑肌和哮喘57。组织块组织块X20平滑肌和哮喘58酶酶X10平滑肌和哮喘59。酶酶 X 20平滑肌和哮喘60。用小鼠抗大鼠的用小鼠抗大

38、鼠的-SMA抗体鉴定大鼠的抗体鉴定大鼠的ASMCs，荧光显微镜下可见细胞胞浆呈绿色阳性着色，荧光显微镜下可见细胞胞浆呈绿色阳性着色 100 平滑肌和哮喘61。用小鼠抗大鼠的用小鼠抗大鼠的-SMA抗体鉴定大鼠的抗体鉴定大鼠的ASMCs，荧光显微镜下可见细胞内的肌动蛋白丝呈平行排列，荧光显微镜下可见细胞内的肌动蛋白丝呈平行排列 400 平滑肌和哮喘62BY BY!BY BY!平滑肌和哮喘63考试通知考试通知时间：时间：20102010年年1 1月月2222日下午日下午2:30-4:302:30-4:30地点：地点：12-1A12-1A形式：开卷（形式：开卷（5 5个问答题）个问答题）内容：临床生理学内容：临床生理学注：注：20102010年年1 1月月9 9日无课（不用来啦）！日无课（不用来啦）！请班长通知并同学们互相转告！请班长通知并同学们互相转告！平滑肌和哮喘64