乙型肝炎病毒cccDNA培训课件.ppt

1、乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒cccDNAcccDNA一、几个相关问题简介一、几个相关问题简介乙型肝炎病毒cccDNA2什么是什么是HBV cccDNA?HBV cccDNA?即共价闭合环状即共价闭合环状DNADNA（covalently covalently closed circular DNA)closed circular DNA)。乙肝病毒感染宿。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并主细胞后在细胞内复制并建立建立感染状态，感染状态，病毒松弛环状病毒松弛环状DNADNA（rcDNArcDNA）进入细胞核，）进入细胞核，利用利用宿主宿主DNADNA聚合酶和拓扑酶等聚合酶和拓扑酶等“修复修复”形

2、形成的、结构完整的、超螺旋双链成的、结构完整的、超螺旋双链DNADNA分子。分子。乙型肝炎病毒cccDNA3乙型肝炎病毒基因组结构示意图乙型肝炎病毒基因组结构示意图乙型肝炎病毒cccDNA4乙型肝炎病毒的复制过程乙型肝炎病毒的复制过程乙型肝炎病毒cccDNA5我们为什么要关注我们为什么要关注HBV cccDNA?HBV cccDNA?cccDNAcccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制“池池”目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNAcccDNA 的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治的药物，这也是现有

3、抗病毒药物治疗效果不佳和治 疗后容易复发的原因之一疗后容易复发的原因之一 肝脏以外器官组织细胞可能存在肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNAcccDNA，成为肝脏，成为肝脏 移植术后乙肝复发的来源移植术后乙肝复发的来源 还没有稳定、可靠、敏感的还没有稳定、可靠、敏感的cccDNAcccDNA检测试剂盒问世检测试剂盒问世乙型肝炎病毒cccDNA6为什么没有为什么没有cccDNAcccDNA检测试剂盒问世检测试剂盒问世?研究和开发该检测技术的时间不长研究和开发该检测技术的时间不长检测技术上的难度较大检测技术上的难度较大前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏 模，

4、不能满足临床检验的需求模，不能满足临床检验的需求现有技术灵敏度不高，检测低限现有技术灵敏度不高，检测低限10104 4 copycopy /ml /ml左右左右分研究机构和学者对检测技术的特异性认分研究机构和学者对检测技术的特异性认 识不足，存在缺陷识不足，存在缺陷乙型肝炎病毒cccDNA7多种同源的乙肝病毒多种同源的乙肝病毒DNADNA分子并存分子并存(cccDNA(cccDNA、rcDNA rcDNA、ssDNAssDNA、整合的、整合的HBV DNAHBV DNA），必须有），必须有 效地分离效地分离cccDNAcccDNA和其他类型的病毒和其他类型的病毒DNADNA如何进一步解决特异性

5、的问题？如何进一步解决特异性的问题？如何解决灵敏度不高的问题（细胞内如何解决灵敏度不高的问题（细胞内cccDNAcccDNA 含量的较低），血清中含量？含量的较低），血清中含量？如何简化检测步骤？如何简化检测步骤？建立建立cccDNAcccDNA检测技术必须克服的难点检测技术必须克服的难点乙型肝炎病毒cccDNA8cccDNAcccDNArcDNArcDNA核酸一级结构核酸一级结构完整的双链完整的双链两条链均不完整两条链均不完整核酸空间结构核酸空间结构闭合环状，超螺旋闭合环状，超螺旋松弛环状，非超螺旋松弛环状，非超螺旋是否与蛋白质结合是否与蛋白质结合不结合不结合共价结合共价结合对某些核酸酶抗性

6、对某些核酸酶抗性强，不容易被降解强，不容易被降解弱，容易被降解弱，容易被降解分离分离cccDNAcccDNA和和rcDNArcDNA的分子基础的分子基础分离分离cccDNAcccDNA和和rcDNArcDNA的任何手段均基于上述差异的任何手段均基于上述差异乙型肝炎病毒cccDNA9二、二、HBV cccDNA检测技术检测技术乙型肝炎病毒cccDNA101.1.选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)2.2.侵入者探针法（侵入者探针法（Invader assaayInvader assaay）3.3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR

7、法法现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介乙型肝炎病毒cccDNA11现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)2.2.侵入者探针法（侵入者探针法（Invader assaayInvader assaay）3.3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法乙型肝炎病毒cccDNA12设计一对特殊引物：跨设计一对特殊引物：跨双双缺口引物缺口引物 正义引物正义引物P1 P1：与负链互补结合，位于正：与负链互补结合，位于正 链缺口上游链缺口上游 反

8、义引物反义引物P2 P2：与正链互补结合，位于负：与正链互补结合，位于负 链缺口下游链缺口下游目的：目的：rcDNArcDNA不被扩增不被扩增1.1.选择性选择性PCRPCR乙型肝炎病毒cccDNA13选择性选择性PCR：rcDNA不被扩增不被扩增乙型肝炎病毒cccDNA14选择性选择性PCRPCR：cccDNAcccDNA能被扩增能被扩增乙型肝炎病毒cccDNA15PCR产物自身退火（产物自身退火（self annealing）“选择性选择性”PCR”PCR：并非万无一：并非万无一失失乙型肝炎病毒cccDNA16 rcDNA rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结被大量扩增，阳性结果不

9、可靠，定量结果也不可靠果也不可靠 HepatologyHepatology Research 2003;15:234-243 Research 2003;15:234-243（PBMCPBMC）World J World J GastroenterolGastroenterol 2004;10(1):82-85(2004;10(1):82-85(血清血清)l KockKock等：反应管中等：反应管中rcDNArcDNA含量不能超过含量不能超过10105 5copycopy HepatologyHepatology 1996;23:405-4131996;23:405-413 血清血清HBV r

10、cDNAHBV rcDNA超过超过10108 8copy/mlcopy/ml，进行荧光，进行荧光PCRPCR可能会出现检测结果假阳性可能会出现检测结果假阳性“选择性选择性”PCR”PCR：并非万无一：并非万无一失失乙型肝炎病毒cccDNA17 与定性法比较增加了一个荧光探与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与下游），与cccDNAcccDNA的负链互补。的负链互补。选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA18rcDNArcDNA不能被扩增不能被扩增无荧光信号无荧光信号

11、EcoR I5+P1 P2 3200(1)53159031820P118201590+3200（1）EcoR I P2cccDNAcccDNA能被扩增能被扩增检测到荧光信号检测到荧光信号选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA19实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理乙型肝炎病毒cccDNA20实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理乙型肝炎病毒cccDNA21实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理乙型肝炎病毒cccDNA22l 标准曲线方程标准曲线方程Y YCtCt=42.0827-3.5554log

12、X=42.0827-3.5554logXcopycopyl 相关指数：相关指数：R R2 2=0.995=0.995l 灵敏度至少可以达到灵敏度至少可以达到10103 3copy/ml copy/ml 结果结果：选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA23同样存在同样存在PCRPCR产物自身退火引起的产物自身退火引起的rcDNArcDNA 非特异性扩增的问题非特异性扩增的问题由于灵敏度较普通由于灵敏度较普通PCRPCR高，假阳性率比普高，假阳性率比普 通通PCRPCR更高更高缺陷：缺陷：选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRP

13、CR检测检测cccDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA24质粒标准品质粒标准品107copy/ml3.5108copy/ml携带者血清携带者血清质粒标准品质粒标准品105copy/ml105107copy/ml携带者血清携带者血清选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA25解决方案解决方案l 特异性抽提分离特异性抽提分离cccDNAcccDNA与其它形式的病毒与其它形式的病毒DNADNA 采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法l 酶切纯化酶切纯化cccDNAcccDNA 采用绿豆核酸酶或采用绿豆核酸

14、酶或ATPATP依赖的依赖的plasmid-safe DNAplasmid-safe DNA酶酶选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA261.1.选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)侵入者探针法（侵入者探针法（Invader assaayInvader assaay）3.3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介乙型肝炎病毒cccDNA27乙型肝炎病毒cccDNA29乙型肝炎病毒cccDNA30侵

15、入者探针法侵入者探针法定量检测定量检测cccDNAcccDNA的优缺点的优缺点优点优点：线性信号放大，特异性比荧光：线性信号放大，特异性比荧光 PCR PCR法强法强缺点缺点：灵敏度低：灵敏度低：10104 4copy/mlcopy/ml乙型肝炎病毒cccDNA311.1.选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)2.2.侵入者分析法（侵入者分析法（Invader assaayInvader assaay）嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介乙型肝炎病毒cccDNA

16、323.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法Shao,et al.J Virol Methods 2003；112：45-52+PNN：与：与HBVDNA非同源片段非同源片段5N533p+rcDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA33PNNP253533.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法乙型肝炎病毒cccDNA34 嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR的优缺点的优缺点 优点：优点：克服了荧光克服了荧光PCRPCR法的部分缺陷，灵敏法的部分缺陷，灵敏 度比侵入法提高度比侵入法提高 缺点：缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的仍不能完全避免待测标本中存在的 rcDNA rcDNA被非

17、特异性扩增被非特异性扩增乙型肝炎病毒cccDNA35 无论是选择性荧光无论是选择性荧光PCRPCR，还是侵，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光入者探针法或嵌合引物荧光PCRPCR，本身都不能解决在高本身都不能解决在高rcDNArcDNA背景条背景条件下的假阳性问题，必须结合抽提件下的假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提高特分离、酶切纯化等步骤，以提高特异性。异性。乙型肝炎病毒cccDNA36三、影响三、影响cccDNA池的因素池的因素乙型肝炎病毒cccDNA371.cccDNA1.cccDNA池的自身恒定池的自身恒定 cccDNAcccDNA池：感染肝细胞核内池：感染肝细胞核内HBV

18、 cccDNAHBV cccDNA的的 含量在无外来干扰的情况下保含量在无外来干扰的情况下保 持恒定持恒定(5(550copy/cell)50copy/cell)病毒自身调节：关于病毒的进化病毒自身调节：关于病毒的进化 关于病毒的关于病毒的“思维思维”病毒自身的调节病毒自身的调节 外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果乙型肝炎病毒cccDNA382.2.抗病毒药物对抗病毒药物对cccDNAcccDNA的影响的影响l现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物，可以一过性地减少似物，可以一过性地减少cccDNAcccDNA，但

19、均不能，但均不能清除清除cccDNAcccDNAl细胞核内细胞核内cccDNAcccDNA含量的相对稳定性，决定了含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性长疗程抗病毒治疗的必要性乙型肝炎病毒cccDNA393.3.肝外组织也是肝外组织也是cccDNAcccDNA的储存池？的储存池？肝外组织细胞中肝外组织细胞中HBVHBV标志的存在情况：标志的存在情况：肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏 膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺 等组织或细胞中均检测到等组织或细胞中均检测到HBVHBV的标志物的标志物HBVHBV吸附？暂居？建立感染状

20、态？吸附？暂居？建立感染状态？依据：从上述组织细胞中检测到依据：从上述组织细胞中检测到cccDNAcccDNA，但必须解决检测技术问题但必须解决检测技术问题乙型肝炎病毒cccDNA40(2)(2)关于血清中是否存在关于血清中是否存在cccDNAcccDNA的问题的问题 “血清中血清中rcDNArcDNA含量越高，含量越高，cccDNAcccDNA阳性率阳性率 越高和含量越高越高和含量越高”的现象，使我们对方法的现象，使我们对方法 学提出质疑学提出质疑肝衰竭的病人在一定病期有可能大量释放肝衰竭的病人在一定病期有可能大量释放 cccDNA cccDNA入血入血细胞坏死后，细胞坏死后，cccDNAcccDNA释放入血是必然的，释放入血是必然的，但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少 时间？时间？乙型肝炎病毒cccDNA41乙型肝炎病毒cccDNA42