乙型肝炎血清学与分子生物学检测技术课件.ppt

1、乙肝病毒研究历史1963年Blumberg 在澳洲土著人血清中发现，简称澳抗。1970年Dane发现HBV病毒颗粒，称Dane颗粒1983年将HBV归为嗜肝病毒科2020/11/1423我国我国HBVHBV感染概况感染概况 一般人群HBsAg携带率高达7.18%；现有慢性HBV感染者约9 300万人，占全世界的1/4；其中慢性乙型病毒性肝炎患者超过 2 000万例，占全世界慢性乙肝患者的1/3；15岁以下儿童HBsAg携带率下降显著，1-4岁组仅为0.96%。32020/11/143嗜肝嗜肝DNA病毒科病毒科(Hepadnaviridae)正肝正肝DNA病毒属病毒属电镜：电镜：3 3种形态种形

2、态2020/11/144结构和基因nHBV的基因组长约3.2kb非闭合的双股环状DNA。n短链：为正链，长度是长链的50100n长链：为负链，含HBV全部遗传信息n有4个开放读码框架：S区：编码HBsAg；C区：编码HBcAg和HBeAg；X区：编码HBxAg，并与肝细胞癌变有关 P区：编码DNA多聚酶。n其中S区和前S区的基因容易发生变异。2020/11/1453200 bp4 open reading frames7 proteins 大蛋白大蛋白(preS1-preS2-S)中蛋白中蛋白(preS2-S)小蛋白小蛋白(HBsAg)核衣壳核衣壳(HBcAg)HBeAg 聚合酶聚合酶 X蛋白

3、蛋白2020/11/1462020/11/147HBV基因型的世界分布基因型的世界分布基因型基因型分布的国家和地区分布的国家和地区ABCDEFGH西欧、北欧、北美、中非西欧、北欧、北美、中非东南亚、东南亚、中国中国、日本、日本东亚、东亚、中国中国、日本、波利尼西亚等、日本、波利尼西亚等南欧、地中海、印度南欧、地中海、印度西非西非美国土著人、波利尼西亚、中南美美国土著人、波利尼西亚、中南美美国、法国美国、法国尼加拉瓜、墨西哥、美国尼加拉瓜、墨西哥、美国血清型血清型adw2 ayw1adw2 ayw1adw2 adrq+adrq-ayrayw2 ayw3ayw4adw4q-adw2 ayw4adw

4、2?2020/11/148机体感染机体感染HBVHBV后产生相应的免疫反应，形成后产生相应的免疫反应，形成多种不同的抗原抗体系统多种不同的抗原抗体系统 表面抗原抗体系统表面抗原抗体系统 (HBsAgHBsAg，抗，抗-HBsHBs)e e 抗原抗体系统抗原抗体系统 (HBeAgHBeAg，抗，抗-HBeHBe)核心抗原抗体系统核心抗原抗体系统 (HBcAgHBcAg，抗抗-HBcHBc)2020/11/149 最早出现的血清学标志之一最早出现的血清学标志之一 是是HBV感染的基本标志感染的基本标志 HBsAg阳性见于阳性见于 乙肝的潜伏期、急性期乙肝的潜伏期、急性期 慢性乙肝慢性乙肝 病毒携带

5、病毒携带 与与HBV感染有关的肝硬化和原发性肝细胞癌感染有关的肝硬化和原发性肝细胞癌 2020/11/1410特异性中和抗体、保护性抗体特异性中和抗体、保护性抗体 抗抗-HBs阳性可见于阳性可见于 乙型肝炎恢复期，在乙型肝炎恢复期，在HBsAg消失后间隔一定时消失后间隔一定时间抗间抗-HBs出现隐性感染的健康人，自身产生了免疫出现隐性感染的健康人，自身产生了免疫力力 注射乙肝疫苗或乙肝高效价免疫球蛋白注射乙肝疫苗或乙肝高效价免疫球蛋白(HBIG)后，产生的主动或被动免疫后，产生的主动或被动免疫2020/11/1411 与与HBsAg平行出现，较平行出现，较HBsAg消失早消失早 意义意义 体内

6、体内HBVHBV复制、传染性强的标志复制、传染性强的标志 急性乙型肝炎的辅助诊断急性乙型肝炎的辅助诊断 判断预后的指标：判断预后的指标：HBeAg转阴，表示转阴，表示HBV复制减复制减少或终止，预后好；若少或终止，预后好；若HBeAg持续阳性，则预后不良，易持续阳性，则预后不良，易转为慢性转为慢性HBeAg消失后出现无症状消失后出现无症状HBV携带者及非活动携带者及非活动期慢性肝炎患者表示期慢性肝炎患者表示HBV在体内复制减少或终止，传染性在体内复制减少或终止，传染性减弱或消失减弱或消失 2020/11/1412 不能从血清中直接检出不能从血清中直接检出 Dane颗粒经去垢剂处理颗粒经去垢剂处

7、理HBcAg释放检测释放检测 非中和抗体、分非中和抗体、分IgM和和IgG 主要见于慢性感染和既往感染主要见于慢性感染和既往感染 通常在出现症状时即可检出，一般持续约通常在出现症状时即可检出，一般持续约6个月，提个月，提示示HBV 复制，是急性感染的重要指标，也是慢性活动性肝炎的重复制，是急性感染的重要指标，也是慢性活动性肝炎的重要标志要标志 在抗在抗-HBc IgM下降及消失后出现，可伴随感染者终生下降及消失后出现，可伴随感染者终生存在存在2020/11/1413IgM anti-HBcHBsAg0481216202428323652100暴露后时间暴露后时间滴滴度度HBeAganti-HB

8、eSymptomsanti-HBsTotal anti-HBcHBV DNAWindow Period2020/11/1414IgM anti-HBcTotal anti-HBcHBsAgAcute(6 months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe048 12 16 20 24 28 32 3652滴滴度度暴露后时间暴露后时间2020/11/1415临床及流行病学意义临床及流行病学意义HBsAgHBsAg 抗抗-HBs-HBs 抗抗-HBc-HBcIgG IgMIgG IgMHBeAgHBeAg抗抗-HBe-HBe潜伏期末期潜伏期末期+/+/急性乙肝，病毒长期携带急性乙

9、肝，病毒长期携带+HBsAgHBsAg阴性的急性感染阴性的急性感染+感染消除，抗感染消除，抗-HBs-HBs尚未出现尚未出现+健康携带者健康携带者+/-+/-+慢性乙肝，病毒长期携带慢性乙肝，病毒长期携带+-+/-+/-+-HBVHBV近期感染，恢复期近期感染，恢复期+/-+/-+HBVHBV既往感染，已恢复既往感染，已恢复+/-+/-+乙肝疫苗接种乙肝疫苗接种+2020/11/141617生物化学检测生物化学检测1HBV血清标志物的检测血清标志物的检测2HBV 分子生物学诊断分子生物学诊断3 HBV HBV感染的实验室检查感染的实验室检查2020/11/1417乙型肝炎的生物化学检测乙型肝炎

10、的生物化学检测 主要指标：ALT,AST,血清白蛋白，球蛋白血清胆红素，碱性磷酸酶其它182020/11/1418 方法学的发展方法学的发展ELISA：灵敏性高，成本低，适用于普通病人筛查；胶体金免疫层析法胶体金免疫层析法(金标法金标法)：简便易行，可用于急诊病人快速检测或无偿献血人员粗筛检测HBsAg；化学发光法定量检测：化学发光法定量检测：价格昂贵，可用于HBVMs为临界值的病人的确证；在评价抗病毒治疗的病毒学应答、疗效和判断预后方面有重要意义。新增检测指标新增检测指标PreS1抗原等192.HBV HBV 血清标志物检测血清标志物检测2020/11/1419HBV基因型和基因变异研究：必

11、要性主要方法 HBV-DNA病毒载量测定：PCR结合荧光探针技术病毒复制水平最可靠，最直接的证据，与传染性和疾病进展密切相关；主要用于HBV感染的判断，治疗适应症的选择及抗病毒疗效的判断。HBV耐药突变的检测3.HBV分子生物学检测分子生物学检测2020/11/1420病毒基因突变病毒基因突变疾病进展疾病进展临床表现临床表现对干扰素应答对干扰素应答耐药变异耐药变异生化学改善生化学改善HBeAg血清学转血清学转换换HBV DNA清除清除急性乙型肝炎急性乙型肝炎慢性乙型肝炎慢性乙型肝炎肝硬化肝硬化(LC)肝细胞癌肝细胞癌(HCC)21HBV基因型基因型/基因亚型基因亚型2020/11/142122

12、2020/11/1422MWIEDFYMS195196I19821015816499121124137138 139107149147GD-S-S-S-SS-SS-SLoop 1 of“a”determinantLoop 2 of“a”determinant145144ERAlpha helicase Vaccine escape mutant Lamivudine resistant mutant F(苯丙苯丙)Y(酪酪)E(谷谷)D(天冬天冬)I(异白异白)M(蛋蛋)W(色色)S(丝丝)M(蛋蛋)I(异白异白)D(天冬天冬)E(谷谷)G(甘甘)R(精精)2020/11/1423 2013中

13、央补助地方项目抗-HBc IgM实验室检测技术2020/11/1424HBV感染的血清学诊断方法感染的血清学诊断方法2020/11/1425ELISA检测实验室配备基本仪器2020/11/1426 抗-HBcIgM 酶免检测收样：血清标本收样登记表：抗抗-HBc IgM 1:1000标本检测登记表标本检测登记表.doc（县级需检测）（县级需检测）慢性乙型肝炎血标本送检表慢性乙型肝炎血标本送检表.doc（县级不必检测）（县级不必检测）样品整理、编号样本保存：标本宜新鲜时检测，若5天内检测，可使用冰箱28保存，超过1周测定，应-20 保存检测项目：抗-HBc IgM检测时限：每月10日前完成上月标

14、本检测检测试剂：省统一购置，分次到省疾控免疫所肝炎实验室领取。试剂储存：28保存，注意效期结果反馈2020/11/1427 抗抗-HBc IgM 1:1000标本检测登记表标本检测登记表 （乙肝监测项目用）.省（直辖市）市 县（市、区）试剂生产厂家：血标本编号报告卡编号姓名性别送检日期检测日期检测结果2020/11/1428 慢性乙型肝炎血标本送检表慢性乙型肝炎血标本送检表 （乙肝监测项目用）.省（直辖市）市 县（市、区）标本送检人签字：标本接受人员签字：血标本编号报告卡编号姓名性别采样日期送检日期2020/11/1429乙型肝炎病毒核心乙型肝炎病毒核心IgM抗体诊断试剂盒（抗体诊断试剂盒（E

15、LISA法）操作说明法）操作说明u原理原理:采用捕获法采用捕获法ELISAELISA原理，原理，用抗人用抗人 链捕获待测血清中特异链捕获待测血清中特异性性I g M，洗板侯加入抗原结合酶进行二次温育。当样品中存在，洗板侯加入抗原结合酶进行二次温育。当样品中存在核心核心I g M抗体时，形成抗体时，形成”抗抗 链链-I g M抗体抗体-抗原结合酶抗原结合酶“复合物。复合物。最后加底物显色。最后加底物显色。u标本要求：标本要求：血清或血浆，样本量足够；污染、标本量不足、严血清或血浆，样本量足够；污染、标本量不足、严重溶血标本不宜作此项检测重溶血标本不宜作此项检测u试剂生产厂家试剂生产厂家：北京万泰

16、生物药业股份有限公司：北京万泰生物药业股份有限公司u包装规格包装规格：48人份人份/盒盒u试剂盒组成：试剂盒组成：包被反应板，包被反应板，酶标试剂，酶标试剂，阳性对照血清，阳性对照血清，阴性阴性对照血清，对照血清，浓缩洗涤液，显色剂浓缩洗涤液，显色剂A液，显色剂液，显色剂B液，终止液，封液，终止液，封口膜，密封袋。口膜，密封袋。u试剂储存条件及有效期：试剂储存条件及有效期：2-8C 保存保存2020/11/1430操作步骤操作步骤1、平衡：将试剂盒取出，平衡至室温30min，微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。标本也需室温平衡30min。2、配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解）

17、，浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：1 9 稀释后使用。3、编号：将微孔条固定于支架，按序编号，设阴阳性对照各2孔和空白对照1孔（双波长可不设空白孔）。4、稀释：将待测标本用生理盐水做1：1000稀释（质控品及阴阳性对照不稀释）5、加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴阳性对照100ul，6、温育：封板、37温育30分钟。7、洗涤：5遍，最后1次尽量扣干8、加酶：每孔加酶标试剂100ul，空白孔除外9、温育：同步骤610、洗涤：同步骤711、显色：每孔加入显色剂A、B液各50ul，混匀，37避光显色15min12、测定：每孔加入终止液50ul，混匀，10min内测定结果。设酶标仪波长450nm（

18、建议用双波长450/600-650nm检测），用空白孔调零后测定各孔A值。2020/11/1431参考范围 阴性对照的正常范围：正常情况下，阴性对照孔A值0.1（若有1孔阴性对照孔A值大于0.1应舍弃该空，弱两孔或以上阴性对照孔A值都大于0.1，应重复实验。阳性对照的正常范围：正常情况下，阳性对照孔A值0.82020/11/1432结果判定 临界值（CUTOFF)计算：临界值=阴性对照孔A均值2.1 阳性判定：样品A值临界值（CUTOFF)判为阳性 阴性判定：样品A值临界值（CUTOFF)判为阴性2020/11/1433注意事项注意事项 待测待测样品要求样品要求冷冻样品实验前需溶解并混匀，使用

19、前请将样品室温平衡30分钟以上。如样品有杂质、浑浊现象，检测前应3500转/分离心5分钟，取上清液检测2020/11/1434续 待测样品待测样品1：1000稀释方法稀释方法-非常关键非常关键稀释液为0.9%生理盐水。稀释方法:尽可能连续倍比稀释（1：10，连续3次）不建议直接在1ml生理盐水中加入1l血清,此种操作容易出现误差。2020/11/1435续 实验操作严格按照标准操作步骤进行。每次均需设阴性和阳性对照原始记录：原始记录：完整的实验原始记录，如试剂批号，结果原始OD值，并保存好原始记录。每次实验结束后，将结果及时填写在抗抗-HBc IgM 1:1000标标本检测登记表本检测登记表.

20、doc，注意表中请增加两点，试剂批号和，注意表中请增加两点，试剂批号和结果原始结果原始S/CO值值:s为标本为标本OD值，值，CO为该批标本检测判为该批标本检测判定的临界值，二者的比值。定的临界值，二者的比值。2020/11/1436 抗抗-HBc IgM 1:1000标本检测登记表标本检测登记表 （乙肝监测项目用）.省（直辖市）市 县（市、区）试剂生产厂家：试剂批号：试剂批号：血标本编号报告卡编号姓名性别送检日期检测日期检测结果S/CO注：1.“报告卡编号”为NNDRS中自动生成的病例编号（18位）；2.“检测结果”在相应位置填写：1=阳性；2=阴性；3=未检测。检测单位：检测人员：2020

21、/11/1437续 试剂使用试剂在使用之前室温平衡30分钟。国产试剂为定性试剂，不能作为定量试剂使用。不同批次试剂最好不要混用。一次检测未使用完的剩余试剂注意密封，保持干燥和洁净。2020/11/1438 避免在有挥发性物质及次氯酸类消毒剂（如84消毒液）的环境下操作。加液时须用加样器，并经常校对加样器的准确性。加入不同样品或不同试剂组分时，应更换加样器吸头和加样槽。封板膜不能重复使用，以防出现交叉污染。所用样品，废液和废弃物都应按传染物处理，终止液为硫酸，使用时注意安全。其它注意事项2020/11/1439样本上送县级送检到省级：每月20日前，冷藏运送至省疾控中心病毒性肝炎实验室标本：未明确

22、诊断慢性乙肝病例全部剩余血标本（县级需检测）必须用2ml螺旋口血清保存管，按顺序放置于血清保存盒 标本标记：用记号笔标记样本编号，最好再标记上姓名 标本送检表：抗-HBc IgM 1:1000标本检测登记表（含试剂批号和标本S/CO原始值），填写完整。明确诊断为慢性乙肝者血标本（县级不必检测）必须用2ml螺旋口血清保存管，按顺序放置于血清保存盒 标本标记：用记号笔标记样本编号，最好再标记上姓名 标本送检表：慢性乙肝标本送检表标本量：约1ml，血量不足标本也要送检2020/11/1440标本复核省级复核：定期按比例抽检国家级复核：按照要求定期送国家疾控中心进行实验室复核 2020/11/1441n与进口雅培试剂相比，Anti-HBc IgM国产酶免试剂的灵敏度100%，但是特异度低，有的厂家甚至低于50%，试剂质量有待提高。Anti-HBc IgM 阳性的病人，不一定是急性乙肝病例（曾有文献报道采用雅培试剂，约70%以上的可能性是AHB），还需要结合其他临床特征或开展随访来鉴别。Anti-HBc IgM结果几点问题2020/11/14422020/11/1443谢谢！