狂犬病病毒分子生物学基础-课件.pptx

1、狂犬病病毒分子生物学基础病原狂犬病病毒:Rabies virus,RV。有两种主要抗原:一种是外膜上的糖蛋白抗原,为主要抗原,决定病毒的嗜神经性、致病性和产生中和抗体;内层的核蛋白抗原,可使体内产生补体结合抗体和沉淀素,无保护作用。从患者或患病动物体内分离的毒株成为自然毒株或街毒株(street virus),毒力强;经过脑组织多次传代后,成为固定毒株(fixed virus),毒力弱,能够用于疫苗制备。病原学病毒主要存在于中枢神经系统、唾液腺和唾液内。在唾液腺、海马角、大脑皮层细胞浆内形成嗜酸性包涵体,称为Negri bodies(NB),是病毒复制和装配的场所。病毒能够在大鼠、小鼠、家兔和

2、鸡胚等脑组织内增殖、致弱,也能够通过驯化,习惯于非脑组织细胞。狂犬病疫苗疫苗:所有用减毒或者杀死的病原生物(包括细菌、病毒、立克次氏体等)或其抗原性物质所制成,用于预防接种的生物制品。目的:预防、控制疾病(如狂犬病)的发生、流行。1881年法国巴斯德最早应用连续传代减弱病毒毒力,成功制造出狂犬病疫苗。目前接种狂犬病疫苗是预防狂犬病唯一有效的手段。由于狂犬病几乎100%的致死性,人用狂犬病疫苗必须是灭活苗。狂犬病疫苗的历史经历五代疫苗1.神经组织疫苗2.禽胚培养疫苗3.3.细胞培养疫苗4.亚单位及精巧疫苗5.基因工程疫苗人用狂犬病疫苗生产流程细胞制备及培养接种毒株培育收获病毒上清病毒纯化病毒灭活

3、原液检定分装及冻干RV的灭活病毒对H2O2、KMNO4、新洁尔液、来苏儿、肥皂水、70%酒精、碘酒以及-丙内酯敏感。目前通用-丙内酯来灭活疫苗收获液中的活毒,用量为1:4000,方法:4过夜,37水浴2h水解残留的-丙内酯。里程碑:分子生物学的诞生1962 Nobel prize in Physiology or Medicine中心法则蛋白质原核生物和真核生物在基因表达上的区别什么是病毒？生物病毒是一类个体微小,结构简单,只含单一核酸(DNA或RNA),必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型微生物。特点:不具细胞结构,具有遗传、复制等生命特征,既无能能量代谢系统也无蛋白质和核酸合成系统

4、病毒的形态球状病毒;杆状病毒;砖形病毒;冠状病毒;丝状病毒;链状病毒;有包膜的球状病毒;具有球状头部的病毒;封于包含体内的昆虫病毒等。病毒粒的对称体制:病毒粒的对称体制只有两种,即螺旋对称(代表烟草花叶病毒)二十面体对称(等轴对称,代表腺病毒)。一些结构较复杂的病毒,实质上是上述两种对称相结合的结果,故称作复合对称(代表T偶数噬菌体)。杆状病毒 HIV丝状病毒 腺病毒病毒的分类从遗传物质分类:DNA病毒、RNA病毒、蛋白质病毒(如:朊病毒)。从病毒结构分类:真病毒(EuvirusEuvirus,简称病毒)和亚病毒(SubvirusSubvirus,包括类病毒、拟病毒、朊病毒)。从寄主类型分类:

5、噬菌体(细菌病毒)、植物病毒(如烟草花叶病毒)、动物病毒(如禽流感病毒、天花病毒、H等)。从性质来分:温和病毒(H)、烈性病毒(狂犬病病毒)。病毒的分类国际病毒分类委员会(International mittee on Taxonomy of Viruses:ICTV)弹状病毒科病毒结构示意图弹状病毒科成员弹状病毒科水泡性病毒属狂犬病病毒属短暂热病毒属细胞核弹状病毒属非毒粒弹状病毒属细胞质弹状病毒属58种植物病毒未归类植物病毒VSVVSVRVRV狂犬病病毒:Rabies virus,RV75 nm(6085 nm)180 nm(60400 nm)RV基因组构成大小:约12 kbp。单股负链RN

6、A(-ssRNA)。基因排布(3to 5):核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(即依赖RNA的RNA聚合酶,L)。其中N基因最保守,常用于进化分析;G基因编码的G蛋白是病毒唯一暴露在外表面的蛋白,是病毒的主要抗原,同时也是引起宿主免疫应答的主要组分。-ssRNA vs+ssRNA定义:一般来说依照RNA能否直截了当起mRNA作用而分成单股正链RNA病毒(正股RNA病毒)与单股负链RNA病毒(负股RNA病毒)两种。RV属于单股负链RNA病毒,即-ssRNA病毒。RV感染周期(Cited from Dietzschold et al、,2005)逆轴突运输机制(Cit

7、ed from Dietzschold et al、,2005)小结狂犬病病毒RV是弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属(Lyssavirus)的模式病毒种。RV 呈子弹状,长约为180 nm(60-400 nm),直径约为75 nm(60-85 nm)。具有囊膜包被,基因组为12 kbp大小的单股负链 RNA(-ssRNA)。高度嗜神经性,且逆轴突传播。含有5个结构基因,从3到5依次为N、P、M、G和L。病毒粒子大小:51058105 kDa,沉降系数为600S。依照N基因5端500 bp碱基的同源性分析,能够将狂犬病病毒属分为7种基因型(Genotype,GT):狂犬病病毒

8、属的分类GTGT病毒名称缩写I I狂犬病病毒RVRVIIIILagosLagos蝙蝠株LagVLagVIIIIIIMokolaMokola病毒MokVMokVIVIVDuvenhageDuvenhage病毒DuvVDuvVV V欧洲蝙蝠病毒-1-1EBL-1EBL-1VIVI欧洲蝙蝠病毒-2-2EBL-2EBL-2VIIVII澳大利亚蝙蝠病毒ABLABL、两个遗传谱系疫苗的交叉保护作用仅存在与同一个遗传谱系内的病毒中！病毒感染的一般步骤吸附进入脱壳病毒基因转录和复制子代病毒装配释放RV感染的一般步骤RV的复制和转录RV基因转录vs复制两种状态的RNA聚合酶:RNA转录酶和RNA复制酶。RNA转

9、录酶:L、P、EF-1、Hsp60、GT(鸟苷转移酶),从N基因处直截了当开始转录。RNA复制酶:L、P、可溶性的N蛋白(N-P复合物形式存在,为复制必须),从基因组的第一个bp处开始合成leader RNA和复制基因组。RV基因的转录转录重要的顺式作用元件:启动子、转录起始位点和转录终止信号。RV基因转录调控模式:stop-start model。RV基因组仅有一个启动子,5个基因有相同的转录起始位点:UUGU和转录终止信号:A/UCUUUUUUU。通用模式:-间隔区UUGU-ORF-A/UCUUUUUUU间隔区。RV转录元件Stop-start model一个基因转录的终止是下一个基因转录

10、起始必须的。RNA聚合酶在终止上一个基因转录时,大约有30%的RNA聚合酶不能起始下游基因的转录,造成转录依次递减30%。研究发现,-ssRNA基因表达的调控主要是通过基因与3端启动子的位置来控制的。RV基因组的复制3leader和5trailer互补链均含有复制起始信号,但5的trailer互补链的复制信号强度大于3 leader,造成-ssRNA:+ssRNA=50:1,因此包装成熟的病毒粒子含有-ssRNA与含有+ssRNA的比例也约为50:1VSV转录和复制模型病毒粒子的装配研究发现,RV的基因组两端不存在特定的包装信号,-ssRNA或+ssRNA包装入病毒粒子完全由两种RNA在细胞内

11、的丰度决定(Finker et al、,1997)。然而,对VSV的研究发现,VSV基因组-ssRNA 5端的trailer区含有包装信号,使-ssRNA被选择性包装入核衣壳(Whelan and Wertz,1999)。G 蛋白简介狂犬病病毒G蛋白参与病毒的组织趋向性和致病性,是主要的保护性抗原,负责诱导病毒中和抗体的产生。整个G蛋白分为四个结构域:信号肽(signal peptite,SP)膜外区(ectodomain,ECTO),跨膜区(transmembrane region,TM)和膜内区(endodomain,ENDO),成熟的G蛋白包括后面三个结构域。G 全长:522-533 a

12、a成熟G蛋白:503-514 aaSP:19 aa,TM:22 aa,ECTO:439 aa,ENDO:42-53 aaRV G蛋白主要抗原位点膜34-4234-42198-200198-200IIII膜外区:1-439 aa1-439 aaI I231231IVIV264264IIIIII330-357330-357a a342-343342-343244-281244-281G5G5跨膜区:440-460 aa440-460 aa膜内区:462-505 aa462-505 aa反向遗传学技术经典遗传学技术 Gregor Johann Mendel 1822-18841 ：1表型(pheno

13、typephenotype)基因型(genotypegenotype)反向遗传学技术表型(phenotypephenotype)基因型(genotypegenotype)基因重组技术-ssRNA反向遗传学建立的基础L、P、N和病毒-ssRNA或+ssRNA包装形成核糖核蛋白复合体(ribonucleoprotein,RNP)。RNP负责病毒进入细胞后的所有复制过程,包括病毒基因的转录和基因组的复制等。体外构建具有活性的病毒单位必须提供:1、病毒-ssRNA或+ssRNA;2、L、P和N三种蛋白。病毒-ssRNA或+ssRNA的提供:提取病毒基因组 反转录得到cDNA 插入合适的载体 转入细胞,在外源提供RNA聚合酶的情况下转录出全长的-ssRNA或+ssRNA。病毒三种蛋白的提供:提取病毒基因组 分别克隆相应的基因 插入合适的载体 转入细胞,表达出相应的蛋白。感谢您的聆听！