细胞工程学医学知识培训课件.ppt

1、细胞工程学医学知识2细胞工程学医学知识3细胞工程学医学知识4细胞工程学医学知识5细胞工程学医学知识16651665年：年：Robert HookeRobert Hooke（英）（英）用自己制造的显微镜观察软木片，发用自己制造的显微镜观察软木片，发现有许多小孔，状如蜂窝，他便称之为细现有许多小孔，状如蜂窝，他便称之为细胞（胞（cellcell）。这是）。这是细胞的发现细胞的发现。18381838年年:M.J.SchleidenM.J.Schleiden（德）（德）植物学家施莱登提出：细胞是一切植植物学家施莱登提出：细胞是一切植物的基本构造；细胞不仅本身是独立的生物的基本构造；细胞不仅本身是独立的

2、生命，并且是植物体生命的一部分，并维系命，并且是植物体生命的一部分，并维系着整个植物体的生命。着整个植物体的生命。6细胞工程学医学知识18391839年：年：T.A.H.SchwannT.A.H.Schwann（德）（德）动物学家施旺受到施莱登的启发动物学家施旺受到施莱登的启发，结合自身的动物细胞研究成果，把，结合自身的动物细胞研究成果，把细胞说扩大到动物界，提出一切动物细胞说扩大到动物界，提出一切动物组织均由细胞组成，从而建立了生物组织均由细胞组成，从而建立了生物学中统一的学中统一的细胞学说细胞学说。7细胞工程学医学知识18591859年：年：Vupian(Vupian(法法)蛙尾部组织切下

3、放入蛙尾部组织切下放入普通水普通水中进行中进行“培养培养”，观察到生长和分化现象。，观察到生长和分化现象。18851885年：年：Roux(Roux(德德)把鸡胚的神经板在把鸡胚的神经板在温热的生理盐水温热的生理盐水中中维持其存活数天，这是有记录的维持其存活数天，这是有记录的第一个体第一个体外移植成功外移植成功的例子，也是的例子，也是首次体外培养的首次体外培养的尝试尝试 。8细胞工程学医学知识 18971897年年：B.LoebB.Loeb 首次在含有少量首次在含有少量血浆血浆凝块凝块的试管的试管中培养成年兔的肝、肾、甲状腺和卵中培养成年兔的肝、肾、甲状腺和卵巢植块，植块在巢植块，植块在3 3

4、天内仍能保持正常天内仍能保持正常的组织学结构。这是的组织学结构。这是器官培养的最早器官培养的最早尝试尝试。9细胞工程学医学知识19061906年：年：SP Beele J EwingSP Beele J Ewing 盖片悬滴法用盖片悬滴法用动物血清动物血清使狗的淋使狗的淋巴肉瘤细胞在体外存活了巴肉瘤细胞在体外存活了7272小时。小时。体外培养技术的开端。体外培养技术的开端。问题：血浆与血清的区别？问题：血浆与血清的区别？10细胞工程学医学知识 血浆血浆是离开血管的全血经抗凝是离开血管的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞成分的液体，其中含有不含细胞成分

5、的液体，其中含有纤纤维蛋白原维蛋白原（纤维蛋白原纤维蛋白原能转换成能转换成纤纤维蛋白维蛋白，具有，具有凝血作用凝血作用），若向血），若向血浆中加入浆中加入Ca2+Ca2+，血浆会发生再凝，血浆会发生再凝固，因此固，因此血浆中不含游离的血浆中不含游离的Ca2+Ca2+。血浆和血清的区别血浆和血清的区别 11细胞工程学医学知识 血清血清是离体的血液凝固之后，经血是离体的血液凝固之后，经血凝块聚缩释出的液体，其中已凝块聚缩释出的液体，其中已无纤维蛋无纤维蛋白原白原，但，但含有游离的含有游离的 Ca2+Ca2+，若向其中再，若向其中再加入加入 Ca2+Ca2+，血清也不会再凝固。，血清也不会再凝固。血

6、清中少了很多的凝血因子，但多了血清中少了很多的凝血因子，但多了很多的很多的凝血产物凝血产物。另外，血清中含有特。另外，血清中含有特异性免疫体异性免疫体(如抗毒素或凝集素如抗毒素或凝集素)的免疫的免疫血清血清(抗菌素血清抗菌素血清)。12细胞工程学医学知识19071907年：年：R Harrison A CarrelR Harrison A Carrel 将蛙胚髓管部的小片接种于蛙的将蛙胚髓管部的小片接种于蛙的淋淋巴液巴液中，并用中，并用盖片悬滴法盖片悬滴法培养细胞，有培养细胞，有神经突起神经突起从培养的神经组织块长出。第从培养的神经组织块长出。第一次较为系统的观察了体外培养活体组一次较为系统的

7、观察了体外培养活体组织的织的结果结果。真正创立体外培养技术。真正创立体外培养技术。13细胞工程学医学知识19071907年的实验标志着：年的实验标志着：体外培养技术创立；体外培养技术创立；盖玻片悬滴法的建立；盖玻片悬滴法的建立；神经组织体外培养的开始；神经组织体外培养的开始；神经突起是由神经细胞长出的重大神经突起是由神经细胞长出的重大理论诞生。理论诞生。14细胞工程学医学知识法国科学家法国科学家A.A.CarrelCarrel的实验贡献的实验贡献:第一次将第一次将无菌操作概念无菌操作概念引入体外引入体外培养实验中。培养实验中。创立培养组织包埋技术、营养供创立培养组织包埋技术、营养供应以及传代培

8、养等许多条件和方法并应以及传代培养等许多条件和方法并引入盖玻片悬滴培养系统。引入盖玻片悬滴培养系统。15细胞工程学医学知识作为他技术才华的标志：作为他技术才华的标志：他在完全没有抗生素的条件下，他在完全没有抗生素的条件下，从一个鸡胚心脏组织开始，将不断进从一个鸡胚心脏组织开始，将不断进行细胞传代，竟使鸡胚心脏的细胞维行细胞传代，竟使鸡胚心脏的细胞维持生存了持生存了3434年年，先后，先后传代传代34003400次，令次，令人信服地证明动物细胞有可能在体外人信服地证明动物细胞有可能在体外无限地生长。无限地生长。16细胞工程学医学知识 19111911年：年：M R Lewis M R Lewis

9、 和和W H LewisW H Lewis兄弟对兄弟对体外细胞生存体外细胞生存所必需的条所必需的条件进行了研究初步探索，研究了件进行了研究初步探索，研究了NaClNaCl、CaClCaCl、KClKCl、NaHCONaHCO3 3等生理等生理盐溶液成分与培养物生长的关系盐溶液成分与培养物生长的关系。17细胞工程学医学知识19131913年：年：Steinhand Steinhand 体外培养体外培养痘苗病毒痘苗病毒，为，为病毒学病毒学应应用奠定基础。用奠定基础。19151915年：年：GoldschmidtGoldschmidt 无脊椎动物组织无脊椎动物组织的体外培养，成的体外培养，成功的培养

10、了功的培养了鳞翅目昆虫组织鳞翅目昆虫组织。18细胞工程学医学知识19251925年：年：Maximow Maximow 双盖片悬滴培养法双盖片悬滴培养法。19261926年：年：CarrelyCarrely 卡氏瓶培养法卡氏瓶培养法，开创玻璃瓶培养方法。，开创玻璃瓶培养方法。19261926年：年：StrangewaysStrangeways 试管培养法试管培养法。19细胞工程学医学知识19331933年：年：Gel Gel 旋转管培养法旋转管培养法，并以此建立了许多细，并以此建立了许多细胞系，如：胞系，如：HelaHela细胞系细胞系。19491949年：年：PolgePolge等等 发现发

11、现甘油甘油保护保护储存细胞储存细胞功能，解决冷功能，解决冷冻细胞受损的问题。冻细胞受损的问题。20细胞工程学医学知识19501950年：年：MorganMorgan等人提出的等人提出的199199人工培养基人工培养基 配方。配方。19511951年：年：ShannonShannon和和EarleEarle建立建立T T瓶培养法瓶培养法。19511951年：年：PomentPoment改良和设计了结构简单改良和设计了结构简单 且易于消毒的且易于消毒的灌流小室灌流小室，使得，使得 体外培养的细胞能够在不断更体外培养的细胞能够在不断更 新的培养液中生长。新的培养液中生长。19541954年：年：Ea

12、rleEarle建立了建立了悬浮培养法悬浮培养法。21细胞工程学医学知识19571957年：年：DullbeccoDullbecco等人开始采用等人开始采用胰蛋胰蛋 白酶消化白酶消化处理来分离细胞的方法以及处理来分离细胞的方法以及应用液体培养基的方法，使得体外培应用液体培养基的方法，使得体外培养单层细胞成为可能。养单层细胞成为可能。19591959年：年：LovelockLovelock发现了一种新的化学发现了一种新的化学冷冻保护剂冷冻保护剂二甲亚砜二甲亚砜，冻存细胞效果，冻存细胞效果更好。更好。22细胞工程学医学知识19671967年：年：AL Van Wezel AL Van Wezel

13、创立了创立了微载体培养微载体培养系系统统，增加了细胞附着的表面，增加了细胞附着的表面,充分利用空间充分利用空间和营养液，大大提高细胞和产物的数量及和营养液，大大提高细胞和产物的数量及质量质量,大大减少劳力和成本。大大减少劳力和成本。19721972年：年：RA KnazekRA Knazek等创立了等创立了中空纤维细胞培中空纤维细胞培养技术养技术，提高了空间利用效率，将二维空，提高了空间利用效率，将二维空间扩展为三维空间，与体内毛细管效应更间扩展为三维空间，与体内毛细管效应更为接近。为接近。23细胞工程学医学知识第二节第二节 细胞培养室和仪器设备的准备细胞培养室和仪器设备的准备24细胞工程学医

14、学知识25细胞工程学医学知识一、实验室设计总体要求一、实验室设计总体要求环境环境：清爽整齐、井然有序、明洁清静、简单高效。清爽整齐、井然有序、明洁清静、简单高效。要求要求：无尘、无毒、无菌。无尘、无毒、无菌。布局布局：内外有别。门、窗、墙的合理布局。内外有别。门、窗、墙的合理布局。26细胞工程学医学知识准备室：准备室：培养器皿的清洗、烘干、包装、培培养器皿的清洗、烘干、包装、培养物品的消毒、培养用液的配制以及供应物养物品的消毒、培养用液的配制以及供应物品的储藏。品的储藏。缓冲室：缓冲室：换取消毒服、帽、罩、鞋等。换取消毒服、帽、罩、鞋等。培养室：培养室：专用进行细胞培养和各种无菌操作专用进行细

15、胞培养和各种无菌操作的实验室。的实验室。27细胞工程学医学知识28细胞工程学医学知识29细胞工程学医学知识30细胞工程学医学知识31细胞工程学医学知识32细胞工程学医学知识2 2、培养设备、培养设备（1）恒温培养箱：恒温培养箱：干热式；隔水式。干热式；隔水式。（2 2）COCO2 2培养箱：培养箱：5%CO5%CO2 2，维持培养液维持培养液pHpH稳定稳定 减缓培养液的酸化。减缓培养液的酸化。33细胞工程学医学知识3 3、消毒设备、消毒设备 （1 1）高压蒸汽消毒锅）高压蒸汽消毒锅 （2 2）电热干燥箱）电热干燥箱 （3 3）过滤除菌装置）过滤除菌装置 34细胞工程学医学知识4 4、冰、冰

16、箱箱（1 1）家用冰箱）家用冰箱 （2 2）低温冰箱）低温冰箱 （3 3）冷藏柜）冷藏柜 （4 4）冷冻柜）冷冻柜 35细胞工程学医学知识5 5、水质纯化装置、水质纯化装置（1 1）重蒸水装置）重蒸水装置（2 2）去离子水制备）去离子水制备（3 3）逆向渗透净水装置）逆向渗透净水装置 36细胞工程学医学知识水质处理与制备水质处理与制备重蒸水蒸馏器重蒸水蒸馏器去离子水生产机去离子水生产机37细胞工程学医学知识6 6、显、显 微微 镜镜（1 1）倒置相差显微镜）倒置相差显微镜 （2 2）荧光显微镜）荧光显微镜 （3 3）紫外光显微镜）紫外光显微镜 （4 4）普通光学显微镜）普通光学显微镜38细胞工

17、程学医学知识39细胞工程学医学知识40细胞工程学医学知识 41细胞工程学医学知识7 7、离、离 心心 机机（1 1）台式离心机）台式离心机 （2 2）冷冻高速离心机）冷冻高速离心机 42细胞工程学医学知识43细胞工程学医学知识44细胞工程学医学知识8 8、细胞冷冻贮存装置、细胞冷冻贮存装置 1 1液氮罐液氮罐 2 2超低温冰箱超低温冰箱 45细胞工程学医学知识液氮罐液氮罐超低温冰箱超低温冰箱46细胞工程学医学知识9.9.其它仪器设备其它仪器设备（1 1）清洗装置：）清洗装置：浸泡器皿、冲洗水槽、超声浸泡器皿、冲洗水槽、超声波玻璃器皿洗涤机等。波玻璃器皿洗涤机等。47细胞工程学医学知识（2 2）

18、酸）酸 度度 机：机：甘汞电极酸度计甘汞电极酸度计 电子精密酸度计电子精密酸度计 48细胞工程学医学知识49细胞工程学医学知识50细胞工程学医学知识（4 4）消化设备）消化设备恒温水浴锅恒温水浴锅 恒温磁力搅拌器恒温磁力搅拌器旋涡震荡器旋涡震荡器51细胞工程学医学知识52细胞工程学医学知识1 1、金属器具、金属器具解剖剪刀解剖剪刀止血钳止血钳镊子镊子刀片刀片解剖刀解剖刀53细胞工程学医学知识2 2、玻璃器皿和塑料器皿、玻璃器皿和塑料器皿 54细胞工程学医学知识3 3、辅助工具、辅助工具各式各式移液器移液器55细胞工程学医学知识56细胞工程学医学知识一、清洗与包扎一、清洗与包扎 清洗和消毒好的玻

19、璃器皿，清洗和消毒好的玻璃器皿，一方面一方面防止细菌污染防止细菌污染，另一方面另一方面有利于细胞的粘附和生长。有利于细胞的粘附和生长。玻璃玻璃表面性质与细胞的粘附和生长能表面性质与细胞的粘附和生长能力有关。力有关。57细胞工程学医学知识1 1清洗玻璃器皿的流程清洗玻璃器皿的流程浸泡浸泡 洗涤洗涤 冲洗冲洗 烘干烘干 酸浸酸浸 冲洗冲洗 蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗 沥水沥水 烘干烘干 包扎包扎58细胞工程学医学知识洗洗 涤涤 剂剂1 1洗洁净类洗洁净类2 2强氧化剂类强氧化剂类强酸洗液的配制：强酸洗液的配制：弱液弱液：重铬酸钾重铬酸钾 50g50g 蒸馏水蒸馏水 1000ml1000ml 浓硫酸浓硫酸

20、 90ml 90ml 强液强液：重铬酸钾重铬酸钾 120g120g 蒸馏水蒸馏水 1000ml1000ml 浓硫酸浓硫酸 160ml160ml(先加热溶解重铬酸钾，冷后缓缓加入浓硫酸先加热溶解重铬酸钾，冷后缓缓加入浓硫酸)59细胞工程学医学知识2、清洗橡胶制品的流程清洗橡胶制品的流程 新制品：新制品：浸泡浸泡 碱煮碱煮（0.5mol/L NaOH 30min0.5mol/L NaOH 30min）冲洗冲洗 酸煮酸煮（0.5mol/L HCl 30min0.5mol/L HCl 30min）冲洗冲洗 蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗 烘干烘干 包扎包扎旧制品：旧制品：水煮水煮 冲洗冲洗 蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗

21、 烘干烘干 包扎包扎 60细胞工程学医学知识3 3、清洗金属制品的流程、清洗金属制品的流程 75%75%酒精擦洗酒精擦洗超净台处吹干超净台处吹干包扎包扎 61细胞工程学医学知识 62细胞工程学医学知识消毒方法分为三类：消毒方法分为三类：物理消毒法物理消毒法化学消毒法化学消毒法抗生素抑菌法抗生素抑菌法63细胞工程学医学知识（一）物理消毒法（一）物理消毒法 1 1、高压蒸气消毒、高压蒸气消毒玻璃器皿玻璃器皿 1515磅磅 121 30121 30分分橡胶制品橡胶制品 1515磅磅 121 15121 15分分 塑料制品塑料制品 5 5磅磅 108 15108 15分分64细胞工程学医学知识2 2、

22、干热消毒、干热消毒 消毒耐高温的材料器皿，消毒耐高温的材料器皿，如玻璃、金属等。如玻璃、金属等。一般一般 160 60160 60分钟。分钟。注意：注意：冷却后才能打开烘箱门冷却后才能打开烘箱门 ，防止，防止玻璃爆裂或起火燃烧。玻璃爆裂或起火燃烧。65细胞工程学医学知识3 3、滤过消毒、滤过消毒（1 1）负压滤过）负压滤过 66细胞工程学医学知识4 4、紫外线消毒、紫外线消毒 环境消毒环境消毒5 5、辐射消毒、辐射消毒 由由6060CoCo产生的产生的射线，穿透力强，灭射线，穿透力强，灭菌物品不升温。菌物品不升温。6 6、煮沸消毒煮沸消毒 适宜于临时需要消毒的耐热物品，适宜于临时需要消毒的耐热

23、物品，如金属器具和注射器等在水中煮沸如金属器具和注射器等在水中煮沸20203030分钟即可用。分钟即可用。67细胞工程学医学知识（二）化学消毒法（二）化学消毒法 化学消毒剂，包括酒精、新洁尔化学消毒剂，包括酒精、新洁尔灭、来苏儿、过氧乙酸、环氧乙烷、灭、来苏儿、过氧乙酸、环氧乙烷、碘酒、戊二醛等。碘酒、戊二醛等。68细胞工程学医学知识（三）抗生素消毒法（三）抗生素消毒法 抗生素消毒作用主要是抑制液体抗生素消毒作用主要是抑制液体内的细菌繁殖，因此适用于细胞培养内的细菌繁殖，因此适用于细胞培养用液的消毒。实验室常用的是用液的消毒。实验室常用的是青、链青、链霉素混合液也称霉素混合液也称“双抗双抗”液

24、，还有液，还有卡卡那霉素那霉素液等，其抑菌效果均很好。液等，其抑菌效果均很好。69细胞工程学医学知识70细胞工程学医学知识71细胞工程学医学知识 72细胞工程学医学知识 73细胞工程学医学知识74细胞工程学医学知识3 3、天然培养基、天然培养基 血清、组织血清、组织提取液（如鸡血提取液（如鸡血浆、鸡胎汁等），浆、鸡胎汁等），血清血清是一种广是一种广泛应用的天然培养基，市场有售泛应用的天然培养基，市场有售，血浆血浆应用较少，用时多自己制应用较少，用时多自己制备。备。75细胞工程学医学知识76细胞工程学医学知识（2 2）鸡胚浸出液的制备）鸡胚浸出液的制备 77细胞工程学医学知识鸡胚浸出液的制备过程

25、鸡胚浸出液的制备过程78细胞工程学医学知识（3）血）血 清清 1 1）种类种类：人血清人血清 胎牛血清胎牛血清 动物血清动物血清 牛血清牛血清 小牛血清小牛血清 马血清马血清 79细胞工程学医学知识80细胞工程学医学知识 多肽多肽 凝成血块后析出的血清有增殖作用，要凝成血块后析出的血清有增殖作用，要比去掉血细胞后分离出的血浆作用强。原因比去掉血细胞后分离出的血浆作用强。原因是在凝血过程中从血小板释放出一种是在凝血过程中从血小板释放出一种多肽血多肽血小板促生长因子小板促生长因子（PDGFPDGF）的结果。）的结果。81细胞工程学医学知识82细胞工程学医学知识 83细胞工程学医学知识 激激 素素

26、激素多方面对细胞作用。激素多方面对细胞作用。胰岛素胰岛素（INSINS）有促细胞摄取葡萄糖和氨基酸的）有促细胞摄取葡萄糖和氨基酸的作用，这些作用可能与其促细胞分裂相作用，这些作用可能与其促细胞分裂相关。关。84细胞工程学医学知识其其 它它 成成 分分血清中还含有：血清中还含有：o 氨基酸氨基酸o 葡萄糖葡萄糖o 酮酸酮酸o 一些与蛋白相结合状态的微量元素一些与蛋白相结合状态的微量元素o 一些抑制细胞增殖的成分一些抑制细胞增殖的成分 85细胞工程学医学知识（4 4）水解乳蛋白）水解乳蛋白 常用的天然培养基，水解乳蛋常用的天然培养基，水解乳蛋白是乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解白是乳白蛋白经蛋白酶和肽酶

27、水解的产物。含有丰富的氨基酸；用与的产物。含有丰富的氨基酸；用与原代细胞培养效果很好。原代细胞培养效果很好。86细胞工程学医学知识（5 5）胶）胶 原原 胶原是细胞生长良好的基胶原是细胞生长良好的基质，是从动物组织中用人工的方质，是从动物组织中用人工的方法提取出的，利于组织和细胞的法提取出的，利于组织和细胞的固定，属于固定，属于天然培养基天然培养基。87细胞工程学医学知识 88细胞工程学医学知识 例：鼠尾胶原制法如下：例：鼠尾胶原制法如下：1 1）取组织：）取组织：大鼠一只，从尾根切断鼠尾，置大鼠一只，从尾根切断鼠尾，置75%75%酒精中浸泡酒精中浸泡3030分钟；无菌条件下，抽出尾分钟；无菌

28、条件下，抽出尾腱置平皿中并切成腱置平皿中并切成1.5cm1.5cm小段；小段；2 2）溶解：）溶解：取取1.5g1.5g尾腱浸入尾腱浸入150ml150ml醋酸溶液（醋酸溶液（0.010.010.25M0.25M），置），置44冰箱中，并不时摇动冰箱中，并不时摇动，4848小时后，移入灭菌离心管；小时后，移入灭菌离心管；89细胞工程学医学知识90细胞工程学医学知识91细胞工程学医学知识4 4、合成培养基、合成培养基 （1）定义：定义：按人和动物体内细胞按人和动物体内细胞成分模拟合成的、配方恒定的一成分模拟合成的、配方恒定的一种较理想的培养基。种较理想的培养基。92细胞工程学医学知识 93细胞工

29、程学医学知识（2 2）合成培养基的成分）合成培养基的成分氨基酸：氨基酸：几乎所有细胞对几乎所有细胞对谷氨酰胺谷氨酰胺有较高有较高要求，是细胞赖以合成核酸和蛋白质的要求，是细胞赖以合成核酸和蛋白质的物质。缺少谷氨酰胺细胞会因生长不良物质。缺少谷氨酰胺细胞会因生长不良而死亡。而死亡。维生素：维生素：维持细胞生长的生物活性物质，维持细胞生长的生物活性物质，对细胞代谢有重大影响。可分为对细胞代谢有重大影响。可分为水溶性水溶性和脂溶性和脂溶性两大类。两大类。94细胞工程学医学知识95细胞工程学医学知识其它成分其它成分 抗氧化剂如抗坏血酸、谷光甘肽等抗氧化剂如抗坏血酸、谷光甘肽等 三磷酸酰苷（三磷酸酰苷（

30、ATPATP）辅酶辅酶A A 核酸降解物如嘌呤与嘧啶类核酸降解物如嘌呤与嘧啶类 96细胞工程学医学知识 97细胞工程学医学知识生长培养液生长培养液 用以维持细胞生长增殖。用以维持细胞生长增殖。含血清比例大含血清比例大，是培养工作中最主要的培养用液，其组成为：是培养工作中最主要的培养用液，其组成为：基本培养基基本培养基 80%80%90%90%血清血清(多用小牛血清多用小牛血清)10%10%20%20%抗生素抗生素(多用青霉素多用青霉素100u/ml100u/ml和链霉素和链霉素100u/ml)100u/ml)98细胞工程学医学知识维维 持持 液液 维持细胞缓慢生长或不死，维持细胞缓慢生长或不死

31、，血清含量很血清含量很少少，一般细胞因缺少生长因子时不能增殖，一般细胞因缺少生长因子时不能增殖，生长缓慢，但发生转化或癌细胞因自身，生长缓慢，但发生转化或癌细胞因自身有产生促生长增殖因子的能力，在血清缺有产生促生长增殖因子的能力，在血清缺少情况下仍能生长；少情况下仍能生长；可用于选择发生恶性可用于选择发生恶性转化的细胞。转化的细胞。99细胞工程学医学知识100细胞工程学医学知识合成培养基的种类合成培养基的种类Eagle，s、Dulbecco，、Ham，s、CMRL、RPMI、Waymouth，s、MoCoy，s、Iscove，sMEM 、F12、1066、1640、MB751/1、5A 、DM

32、EML15、NCTC109、199、Fischer 101细胞工程学医学知识103细胞工程学医学知识 v 继续设计新的、能适应多种类型体外生长继续设计新的、能适应多种类型体外生长增殖的无血清培养基。增殖的无血清培养基。v 在研究生长因子等工作的基础上，向人工在研究生长因子等工作的基础上，向人工合成培养基内补加一定的激素、生长因子合成培养基内补加一定的激素、生长因子等已知物质来支持细胞的生长和增殖。等已知物质来支持细胞的生长和增殖。104细胞工程学医学知识 105细胞工程学医学知识（1 1）消化液）消化液 分离组织和分散细胞用的。分离组织和分散细胞用的。如：胰蛋白酶、胶原酶、二乙胺四如：胰蛋白酶

33、、胶原酶、二乙胺四乙酸二钠（乙酸二钠（EDTAEDTA）。）。106细胞工程学医学知识胰蛋白酶胰蛋白酶 采自牛或猪的胰脏采自牛或猪的胰脏,易潮解，置于阴暗干燥易潮解，置于阴暗干燥处保存。处保存。主要作用：主要作用：水解细胞间蛋白质，使细胞相互离散。水解细胞间蛋白质，使细胞相互离散。活力表示：活力表示：以解离酪蛋白的能力表示。胰蛋白酶对以解离酪蛋白的能力表示。胰蛋白酶对细胞的分离作用与细胞的类型和特性有密切的关细胞的分离作用与细胞的类型和特性有密切的关系。系。浓度大、温度高、作用时间越长，对细胞的浓度大、温度高、作用时间越长，对细胞的分离能力最大分离能力最大，但超过一定限度也会但超过一定限度也会

34、损伤细胞损伤细胞。107细胞工程学医学知识108细胞工程学医学知识 109细胞工程学医学知识比较：比较：胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别项目胰蛋白酶胶原酶消化特性适用于消化软组织适用于消化纤维多的组织用量0.01%0.5%0.10.3mg/ml（200U/ml）消化时间0.52小时（小块）112小时PH896.57.0作用强度强烈缓和细胞影响时间过长有影响无大影响血清抑活有无Ca2+和Mg2+有影响无影响110细胞工程学医学知识EDTAEDTA 主要作用：主要作用：EDTAEDTA为化学螯合剂，能螯合钙为化学螯合剂，能螯合钙、镁离子、镁离子,对细胞有一定的解离作用，

35、对细胞有一定的解离作用，毒性小，价格低廉，使用方便。常用浓毒性小，价格低廉，使用方便。常用浓度一般为度一般为0.02%0.02%，配制时用，配制时用无钙、镁离子无钙、镁离子的溶液溶解，高压消毒灭菌分装入小瓶的溶液溶解，高压消毒灭菌分装入小瓶中，置中，置44冰箱保存。冰箱保存。111细胞工程学医学知识（2 2）pHpH调整液调整液 主要作用：主要作用：维持培养液维持培养液pHpH稳定、维持渗透稳定、维持渗透压、提供能源。压、提供能源。112细胞工程学医学知识113细胞工程学医学知识 114细胞工程学医学知识细胞培养的基本条件？细胞培养的基本条件？115细胞工程学医学知识一、无菌无毒的细胞培养环境一、无菌无毒的细胞培养环境二、恒定的细胞生长温度二、恒定的细胞生长温度三、合适的细胞培养基和优质血清三、合适的细胞培养基和优质血清四、理想的渗透压四、理想的渗透压五、合适的气体环境和五、合适的气体环境和pHpH值值六、合适的细胞接种浓度（密度）六、合适的细胞接种浓度（密度）七、合适的容器转动速度和悬浮搅动速度七、合适的容器转动速度和悬浮搅动速度116细胞工程学医学知识