医学课件-急性髓系白血病中骨髓微环境介导耐药的探索教学课件.pptx

1、.1.2急性髓细胞白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是髓系造血干/祖细胞恶性疾病。以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征，临床表现为贫血、出血、感染和发热、脏器浸润、代谢异常等，多数病例病情急重，预后凶险，如不及时治疗常可危及生命。化疗联合造血干细胞移植是AML的主要治疗手段。尽管患者预后已有极大改善，仍有部分患者复发或难药，降低了AML患者的OS及PFS。文献报道急性髓系白血病对化疗不敏感，部分原因是骨髓中的基质细胞对白血病细胞的保护作用。.32013年cancer letter一篇文章报道了Wnt信号通路在MSC介导的ALL细胞耐药中的作用机制，阐

2、明此通路可作为靶向治疗靶点。.4该文首先报道MSC对ALL细胞增殖和凋亡中的影响。(A)与MSC共培养的ALL细胞系其凋亡率下降。(B)与MSC共培养的ALL原代细胞其凋亡率下降。.5Western blot结果发现与MSC共培养后细胞周期相关蛋白的表达改变。.6与MSC共培养后ALL细胞的wnt通路相关基因及蛋白表达改变。.7加入wnt抑制剂后，可促进ALL细胞的凋亡.8小动物活体成像实验发现加入wnt通路抑制剂及阿糖胞苷后，小鼠体内瘤体明显缩小，生存期延长。说明wnt通路抑制剂可拮抗MSC诱导的ALL细胞耐药.9 白血病微环境中的多种细胞成分对白血病细胞有保护作用，其中包括基质细胞（间充质

3、干细胞）。为阐明机制，该文作者将急性淋巴细胞白血病细胞与骨髓基质细胞共培养，研究后者对白血病细胞基因和蛋白水平的影响。结果表明Wnt信号参与MSC介导白血病细胞耐药。阻断Wnt通路可增强白血病细胞对化疗的敏感率，改善白血病小鼠模型的存活率。Yang Yang,Saradhi Mallampati,Baohua Sun,et al.Wnt pathway contributes to the protection by bone marrow stromal cells of acute lymphoblastic leukemia cells and is a potential therap

4、eutic target.Cancer Lett.2013 June 1;333(1):.doi:10.1016/j.canlet.2012.11.056.总结：.102009年Blood一篇文章报道骨髓基质细胞可保护CLL细胞逃避药物诱导的凋亡，从而导致CLL细胞的耐药.11小鼠MSC与CLL细胞共培养后，可降低氟达拉滨诱导的CLL细胞凋亡.12同样，人MSC与CLL细胞共培养后，可降低氟达拉滨诱导的CLL细胞凋亡.13MSC与CLL细胞共培养后，可降低地塞米松诱导的CLL细胞凋亡.14当环磷酰胺与氟达拉滨联用时MSC对CLL细胞的保护作用消失.15Western blot结果显示CLL细胞

5、与MSC共培养后，促细胞凋亡相关蛋白如Mcl-1和PARP的剪切体表达下降.16骨髓基质细胞慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞耐药中起重要作用。该文作者将人和小鼠骨髓基质细胞系和人CLL细胞共培养，检测药物诱导的细胞凋亡的改变。研究结果表明骨髓基质细胞可保护CLL细胞免受氟达拉滨诱导细胞凋亡。骨髓基质细胞也保护CLL细胞免受地塞米松和环磷酰胺诱导的细胞凋亡。骨髓基质细胞可保持Mcl-1，并保护CLL细胞免受氟达拉滨诱导的Mcl-1和PARP裂解Antonina V.Kurtova,1 Kumudha Balakrishnan,2 Rong Chen,et al.Diverse marrow st

6、romal cells protect CLL cells from spontaneous and drug-induced apoptosis:development of a reliable and reproducible system to assess stromal cell adhesion-mediated drug resistance.Blood.2009;114:4441-4450.172013年JCI一篇文章报道c-Myc/miR-548m/HDAC6通路在非霍奇金B细胞淋巴瘤的细胞耐药中起重要作用.18将B细胞淋巴瘤细胞系与MSC细胞系HK共培养后，通过基因芯片发

7、现miR-548m,miR-548f和miR-548h的表达下调(A)。Taqman realtime PCR结果发现B细胞淋巴瘤细胞系Jeko-1,HBL-2,SUDHL-4与MSC细胞系HK共培养后，miR-548m的表达下调(B)。Western blot结果同样显示在这三种细胞系与HK共培养后，HDAC6的蛋白表达上调(C)。淋巴瘤细胞系HBL-2,SUDHL-4与另一种MSC细胞系HS-5共培养后，HDAC6的蛋白表达上调（左），miR-548m的表达下调（右）.19套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡淋巴瘤(FCL)，弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的原代淋巴瘤细胞与MSC细胞系HK共

8、培养后，miR-548m的表达均下降套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡淋巴瘤(FCL)，弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的原代淋巴瘤细胞与MSC细胞系HK共培养后，HDAC6蛋白的表达均上调.20通过逆转录病毒载体感染Jeko-1使之高表达miR-548m（左上），通过realtime PCR（左下）和western（右）检测HDAC6的表达，结果发现HDAC6的表达下降。反之，干扰Jeko-1细胞miR-548m的表达（左上）后，HDAC6的表达增加。.21荧光素酶报告载体实验证实miR-548m负向调控HDAC6.22HBL-2与HK共培养后，生成的集落数明显多于单独培养组。HBL-2高表达

9、miR-548m后，生存的集落数低于对照组。miR-548m+HBL-2与HK共培养后，集落数也低于对照。干扰HBL-2中HDAC6后，生存的集落数低于对照组。HDAC6 knockout-HBL-2与HK共培养后，集落数也低于对照。.23在单独培养组与共培养组加入环孢素A和/或米托蒽醌，检测淋巴瘤细胞的凋亡率。集落形成实验结果显示，加入环孢素A后，共培养组的集落数多于单独培养组。.24体内成瘤实验结果显示，将HK和HBL-2共同皮下注射组的瘤体明显大于单独注射HBL-2组.25HBL-2细胞高表达miR-548m后，瘤体较对照缩小。与HK共同注射后，miR-548m+组的瘤体也小于miR-5

10、48m-组.26miR-548m的表达与c-Myc呈负相关干扰c-Myc表达后，miR-548m的表达上调.27上调miR-548m表达后，c-Myc的表达下降加入c-Myc抑制剂后检测HBL-2的凋亡率.28淋巴瘤细胞及其微环境处于一个动态的相互作用中。使用克隆培养和裸鼠移植瘤生长系统模型，本文表明，套细胞淋巴瘤（MCL）和其他非霍奇金淋巴瘤细胞与基质细胞共培养后可产生耐药性，促进淋巴瘤细胞的克隆形成，并诱导组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）的表达。此外，基质还可激发c-myc/miR-548m前馈回路，导致c-myc的持续活化，mir-548m的下调，和HDAC6的上调，从而导致淋巴瘤细胞的

11、扩增和淋巴瘤进展。加入HDAC6抑制剂和/或c-Myc抑制剂可促进淋巴瘤细胞死亡，拮抗细胞耐药，抑制淋巴瘤体外克隆形成和生长在体内。Tint Lwin,Xiaohong Zhao,Fengdong Cheng,et al.A microenvironment-mediated c-Myc/miR-548m/HDAC6 amplification loop in non-Hodgkin B cell lymphomas.The Journal of Clinical Investigation.2013;4612-4617.29AML细胞系U937,KG1a,及AML原代细胞与MSC共培养后，细

12、胞凋亡率明显下降。在单独培养的AML细胞中加入米托蒽醌后，U937，KG1a，原代AML细胞的凋亡率分别为43.5%，48.7%，71.8%。与MSC共培养后加入米托蒽醌，U937，KG1a，原代AML细胞的凋亡率明显下降。.30与MSC共培养后，KG1a，U937(A)及AML原代细胞(B)中c-Myc的表达升高。.3110058F4是c-Myc的特异性抑制剂，在AML细胞培养中加入10058F4，AML细胞c-Myc的表达明显下降(B)，AML细胞的凋亡率明显升高(A)。.32与MSC共培养体系中加入10058-F4，AML细胞的凋亡率高于未加10058F4组。.33通过siRNA干扰使A

13、ML细胞系U937中c-Myc的表达下调(A)。干扰后，AML细胞的凋亡增加，加入米托蒽醌后，干扰组的凋亡率高于未干扰组(B)。.34通过transwell实验证实，MSC对AML细胞起作用需要两者间紧密接触。如图A所示，AML细胞与MSC共培养后其凋亡率显著下降，而transwell实验显示凋亡率无明显变化。同样，如图B所示，AML细胞与MSC共培养后c-Myc的表达升高，而transwell实验中c-Myc表达无明显改变。.35MSC主要通过凋亡和血管生成两种途径干扰AML细胞的生存，通过10058F4或干扰的方法使AML细胞中的c-Myc表达下降，通过western blot检测发现抗凋

14、亡相关蛋白如Bcl2,Bcl-XL表达上调，血管生成蛋白如VEGF表达上调。而促凋亡蛋白如caspase-3和PARP的剪切体表达下调。.36急性髓系白血病（AML）是一种对化疗不敏感的恶性血液病。AML细胞和骨髓（BM）微环境之间的相互作用在AML耐药中起着至关重要的作用。基质细胞是骨髓微环境中影响AML细胞的组成部分。我们研究的目的是阐明基质细胞对AML细胞耐药的作用基质。结果发现，AML细胞系U937，KG1a细胞和原代AML细胞与MSC共培养后，可减少药物诱导的细胞凋亡。Western结果发现共培养后AML细胞c-Myc的表达上调。加入c-Myc抑制剂10058-F4或干扰c-myc表

15、达后，可明显促进细胞凋亡。Western blot结果发现抑制c-myc基因的表达可诱导caspase-3，PARP裂解体的表达，并下调Bcl-2,Bcl-XL，VEGF的表达。因此，我们得出结论：骨髓基质细胞通过c-myc通路介导白血病细胞的耐药。因此c-myc是克服AML耐药的一个潜在的治疗靶点.37为阐明MSC上调AML细胞中c-Myc的机制，通过基因芯片比较了与MSC共培养前后AML的microRNA表达谱。.38挑选出6个与c-Myc调控相关的microRNA。通过realtime PCR验证找到miR-494和miR-17是调控c-Myc的microRNA。通过生存曲线分析，发现m

16、iR-494与AML患者的OS和PFS密切相关，定为下一步研究的靶miRNA。.39通过荧光素酶报告载体实验证实miR-494是c-Myc的负向调控子.40通过逆转录病毒载体提高AML细胞中miR-494的表达。(A)感染后AML细胞中miR-494的表达上调。(B)感染后AML细胞中c-Myc的表达下调(C)Western blot检测发现感染后AML细胞中c-Myc蛋白的表达下调.41将感染后的AML细胞与MSC共培养，发现其OD值没有明显改变，说明过表达miR-494后可拮抗MSC引起的AML增殖改变。加入米托蒽醌后，miR-494+AML细胞的OD明显下降，说明miR-494过表达可拮

17、抗MSC诱导的耐药.42体外实验证实体外实验证实miR-494活化活化可抑制化疗药物诱导的可抑制化疗药物诱导的AML细胞凋亡细胞凋亡.43皮下成瘤实验：与基质皮下成瘤实验：与基质细 胞 共 同 皮 下 注 射 的细 胞 共 同 皮 下 注 射 的AML细胞形成的肿瘤明细胞形成的肿瘤明显 大 于 单 独 皮 下 注 射显 大 于 单 独 皮 下 注 射AML形成的肿瘤，活化形成的肿瘤，活化AML细胞中细胞中miR-494的的表达后可抑制皮下肿瘤表达后可抑制皮下肿瘤的形成的形成.44体内实验：活化体内实验：活化AML细胞中细胞中miR-494表达后与基质细胞共同尾静脉注入表达后与基质细胞共同尾静脉

18、注入NOD/SCID小鼠，建立白血病小鼠模型。小鼠，建立白血病小鼠模型。miR-494高表达组的小鼠生存期高于对照组，外周血及骨髓中白血病细胞增殖速度低于对照。.45我们既往研究发现，骨髓基质细胞通过c-Myc的依赖的途径保护白血病细胞免受化疗诱导的凋亡。然而，这一过程的具体机制仍然是未知的。为了阐明机制，我们通过microRNA芯片和TaqMan实时定量PCR分析与基质细胞共培养前后白血病细胞系的microRNA表达改变。结果表明，microRNA-494（miR-494）在共培养的AML细胞表达下调。报告基因分析证实miR-494是c-myc的负向调控子。在共培养体系中活化miR-494的

19、表达，可抑制AML细胞增殖，促进细胞凋亡。在共培养体系中加入米托蒽醌后，miR-494活化的AML细胞增殖受抑明显高于对照细胞。皮下注射AML细胞系联合MSC，mir-494活化组小鼠的皮下肿瘤生长最慢，肿瘤体积最小。此外，在异基因小鼠移植模型中，miR-494活化小鼠的外周血和骨髓AML细胞增殖最慢，计数最少。我们的研究结果表明，miR-494通过下调c-myc拮抗AML细胞耐药，miR-494是AML的潜在治疗靶点。MicroRNA-494 Activation Suppresses Bone Marrow Stromal Cell-Mediated Drug Resistance in

20、Acute Myeloid Leukemia Cells.Plos One.In submission.46检测白血病干、祖细胞中Hes1、p21表达.47通过芯片比较microRNA表达改变.48荧光报告载体实验证实miR-9是Hes1负向调控子.49干扰miR-9表达可抑制AML细胞增殖.50干扰miR-9表达后检测白血病细胞周期的改变.51在异基因小鼠模型中干扰miR-9表达，检测对小鼠生存期的影响.52miR-9通过下调Hes1的表达对AML细胞的增殖、凋亡起作用。干扰miR-9表达后可抑制AML细胞扩增。Tian C,You MJ,Yu Y,Zhu L,Zheng G,Zhang Y.MicroRNA-9 promotes proliferation of leukemia cells in adult CD34-positive acute myeloid leukemia with normal karyotype by downregulation of Hes1.Tumour Biol.2015 Dec 17.Epub ahead of print(Co-corresponding author).53谢谢