大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件.ppt

1、植物脱毒技术植物脱毒技术一 植物病毒及植物物脱毒技术 1 植物病毒 2 植物病毒的危害 3 植物脱毒技术概念 4 植物脱毒技术的一般方法二 茎尖脱毒技术的方法步骤 1 原理 2 基本步骤 3 影响茎尖脱毒效果的因素三 其它脱毒技术方法介绍四 脱毒技术的应用 一一 植物病毒及植物物脱毒技术植物病毒及植物物脱毒技术 1 1 植物病毒：植物病毒：A A 病毒（病毒（virusvirus）是一类非细胞结构的专性寄生的，是一类非细胞结构的专性寄生的，极微极微 小的分子生物，有核酸和蛋白质组成，以复制繁殖。小的分子生物，有核酸和蛋白质组成，以复制繁殖。B B 主要存在于植物细胞内的病毒（类病毒）称为植主要

2、存在于植物细胞内的病毒（类病毒）称为植物病毒（非系统分类）物病毒（非系统分类）。C C 植物病毒形态植物病毒形态 在生物界中，植物病毒形态最小，观察病毒需放大在生物界中，植物病毒形态最小，观察病毒需放大数万倍的电子显微镜，度量病毒大小的尺度为纳米，数万倍的电子显微镜，度量病毒大小的尺度为纳米，其形态有球状、杆状、线条状，少数弹状其形态有球状、杆状、线条状，少数弹状。D D 植物病毒结构植物病毒结构 植物病毒结构简单，杆状、线条状的病毒，粒体中间植物病毒结构简单，杆状、线条状的病毒，粒体中间是螺旋状的核酸链，外面是蛋白质亚基组成的衣壳。是螺旋状的核酸链，外面是蛋白质亚基组成的衣壳。E E 植物病

3、毒的发展简史植物病毒的发展简史 1 1症状描述期症状描述期2 2病原研究期病原研究期 代表人物：代表人物：Adolf mayerAdolf mayer（18821882），），Dmitrii IvanowskiDmitrii Ivanowski（18921892），），Martinus BeijernekMartinus Beijernek（18981898）。）。3 3病理学研究期病理学研究期 研究植物病毒的传播介体。研究植物病毒的传播介体。4 4生物化学、生物物理学研究期生物化学、生物物理学研究期StanleyStanley（19351935）从从TMVTMV汁液中提取出一种蛋白质的汁液中

4、提取出一种蛋白质的晶体。晶体。BawdenBawden和和PiriePirie（91369136）证实证实TMVTMV汁液中除蛋白质外汁液中除蛋白质外，还有核酸，两者比例为核酸，还有核酸，两者比例为核酸5%5%、蛋白质、蛋白质95%95%。2 2 植物病毒的危害：植物病毒的危害：A A 种类多，范围广，已发现植物病毒有种类多，范围广，已发现植物病毒有700700种。大多数种。大多数农作物特别是利用无性繁殖生产的农作物都受到一种农作物特别是利用无性繁殖生产的农作物都受到一种或一种以上病毒感染而且带毒株率高。或一种以上病毒感染而且带毒株率高。Ex.Ex.苹果苹果60%-60%-100%-100%B

5、 B 危害程度仅次于真菌病害危害程度仅次于真菌病害 C C 不易防治，潜隐性危害更大不易防治，潜隐性危害更大 D D 植物病毒的症状类型植物病毒的症状类型 症状是认识病毒的第一步，具有诊断价值，其症状类症状是认识病毒的第一步，具有诊断价值，其症状类型有花叶、坏死、畸形型有花叶、坏死、畸形。E E 复合侵染和复合症复合侵染和复合症 1 1干扰作用干扰作用 指两种有亲缘关系的病毒侵染同一种植物，其表现的症状指两种有亲缘关系的病毒侵染同一种植物，其表现的症状比单一侵染所表现的症状要轻。其中主要是交互保护，指先侵入的病毒比单一侵染所表现的症状要轻。其中主要是交互保护，指先侵入的病毒可以保护植物不受另一

6、个病毒的侵染，一般是弱株系诱发对强株系的抗可以保护植物不受另一个病毒的侵染，一般是弱株系诱发对强株系的抗性。性。2 2协生作用协生作用 两种无亲缘关系的病毒混合侵染后所表现的症状比它们单两种无亲缘关系的病毒混合侵染后所表现的症状比它们单独侵染所表现的症状更为严重。独侵染所表现的症状更为严重。F F 植物病毒症状隐潜植物病毒症状隐潜 潜伏侵染潜伏侵染 病毒侵染植物后不表现症状或难以觉察的症状，但病毒可以在病毒侵染植物后不表现症状或难以觉察的症状，但病毒可以在体内增殖称潜伏侵染。体内增殖称潜伏侵染。带毒体带毒体 受病毒侵然而不表现症状的植物。受病毒侵然而不表现症状的植物。I I 感病寄主内部病理变

7、化感病寄主内部病理变化 （一）筛管、筛板堵塞（一）筛管、筛板堵塞（二）组织坏死产生坏死斑（二）组织坏死产生坏死斑（三）病细胞结构发生变化（三）病细胞结构发生变化（四）内含体的产生（四）内含体的产生内含体是寄主细胞内的病毒核酸和寄主细胞内的蛋白质、甘糖等物质聚内含体是寄主细胞内的病毒核酸和寄主细胞内的蛋白质、甘糖等物质聚集在一起形成的一种混合体。其种类有集在一起形成的一种混合体。其种类有X-X-体和晶状体。体和晶状体。3 3 植物脱毒技术概念植物脱毒技术概念：A A 广义：消除包括病毒、真菌、细菌在内的微生物病原体广义：消除包括病毒、真菌、细菌在内的微生物病原体 B B 狭义：单指消除植物细胞、

8、组织内的病毒、类病毒狭义：单指消除植物细胞、组织内的病毒、类病毒 （本节重点为狭义脱毒所涉及内容）（本节重点为狭义脱毒所涉及内容）4 4 植物脱毒技术的一般方法植物脱毒技术的一般方法：A A 从材料角度分：从材料角度分：茎尖培养脱毒（或顶端分生组织）、珠心胚培养脱毒、茎尖培养脱毒（或顶端分生组织）、珠心胚培养脱毒、微尖嫁接脱毒、花药培养脱毒、愈伤组织培养脱毒微尖嫁接脱毒、花药培养脱毒、愈伤组织培养脱毒 B 从处理手段角度分：高温处理 物理方法脱毒 低温处理 化学方法脱毒 病毒唑（1,2,4-三唑-3-酰胺-1-BD-呋喃糖）抗病毒血清处理 生物方法脱毒 RNA 合成抑制物（防线菌素D）高温处理

9、：高温处理：（该方法可能会遇到的问题是什么？如何解决？）（该方法可能会遇到的问题是什么？如何解决？）原理：基本原理是在高于正常的温度下，植物组织中的病毒原理：基本原理是在高于正常的温度下，植物组织中的病毒 可部分或全部失活（钝化），但是很少或甚至不伤害寄主植物组可部分或全部失活（钝化），但是很少或甚至不伤害寄主植物组 织细胞。织细胞。A B C 低 热处理区 高 温 温 生长区 无损伤 病毒热死点 植物热死点 应用热处理脱毒也有一定的局限性，主要缺点在于并非所有病毒都对热处理敏感。热处理只对那些球状的病毒(如葡萄扇叶病毒、苹果花叶病毒)或线状的病毒(如马铃薯X、Y病毒及康乃馨病毒)有效果，而对

10、杆状病毒(如牛蒡斑驳病毒、千日红病毒)不起作用。二 茎尖脱毒技术的原理和方法 1 1 基本原理基本原理（采用茎尖的原理采用茎尖的原理）利用病毒在植物体内的分布不均匀性，一般情况下，病毒利用病毒在植物体内的分布不均匀性，一般情况下，病毒在植物的顶端分生组织中不存在或只有较低的浓度（胚中也是在植物的顶端分生组织中不存在或只有较低的浓度（胚中也是这种情况，为什么这种情况，为什么？）？）2 2病毒分配不均匀性的可能原因病毒分配不均匀性的可能原因：A A 物理隔离：分生组织微管系统或胞间连丝不发达，细胞分物理隔离：分生组织微管系统或胞间连丝不发达，细胞分 裂速度快于病毒侵染速度裂速度快于病毒侵染速度 B

11、 B能量竞争能量竞争 ：病毒核酸和植物细胞分裂时都须要消耗大量的：病毒核酸和植物细胞分裂时都须要消耗大量的 能量，而分生组织细胞本身很活跃，其能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNADNA合成是合成是 自我提供能量自我复制，这样病毒核酸复制就得不自我提供能量自我复制，这样病毒核酸复制就得不 到足够的能量。到足够的能量。C C 存在病毒钝化系统：植物不同部位细胞的防卫系统能力的存在病毒钝化系统：植物不同部位细胞的防卫系统能力的 差别。差别。D D 抑制因子存在抑制因子存在 2 2 基本步骤基本步骤 （1 1）母体的选择）母体的选择 （2 2）母体（预）处理）母体（预）处理 （3 3）茎尖的分离）

12、茎尖的分离 （4 4）茎尖的培养和小批量快繁）茎尖的培养和小批量快繁 （5 5）效果检验）效果检验 （6 6）大批量快繁及无毒原种保存。）大批量快繁及无毒原种保存。2 2 基本步骤基本步骤 （1 1）母体的选择）母体的选择 欲脱毒材料的品种典型性欲脱毒材料的品种典型性 植体健康程度选择植体健康程度选择 （2 2）母体（预）处理）母体（预）处理 A A 可采用物理、化学、生物方法（如前述）可采用物理、化学、生物方法（如前述）B B 但是一般是热处理（母体较大、热处理好操作）但是一般是热处理（母体较大、热处理好操作）C C 热处理的参数选择：热处理的参数选择：a a 加热方式：热水或热空气加热方式

13、：热水或热空气 b b 温度选择：视情况而定，直线式或交替式温度选择：视情况而定，直线式或交替式 c c 湿度的保持：必须湿度的保持：必须 d d 和其它方式联合实行和其它方式联合实行 热处理举例：香石竹（康乃馨）在38-40度经过两个月处理可除去全部病毒菊花在35-38度的条件下处理60天可使病毒失活马铃薯在37度条件下处理10-20天能除去卷叶病毒柑橘速衰病毒/黄化病毒在40/30度条件下处理7-12周 鳞皮病毒需要40/30度条件下处理8周 碎叶病毒需要50度条件下处理3-22小时 （3 3）茎尖的分离）茎尖的分离 A A两种情况：两种情况：无菌状态无菌状态剥离外层剥离外层根尖根尖 有菌

14、状态有菌状态剥离茎尖剥离茎尖常规消毒常规消毒 B B 注意根尖大小：注意根尖大小：茎尖过大脱毒效果不彻底茎尖过大脱毒效果不彻底 茎尖太小培养再生困难茎尖太小培养再生困难 二 茎尖脱毒技术的原理和方法 2 2 基本步骤基本步骤 （4 4）茎尖的培养和小批量快繁：）茎尖的培养和小批量快繁：丛生芽（不定芽诱导）丛生芽（不定芽诱导）单芽切割单芽切割 诱导生根（换培养基）诱导生根（换培养基）练苗练苗 移栽移栽 （5 5）脱毒效果的检测：）脱毒效果的检测：A A 直接检测法：直接检测法：直接观察待测植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒直接观察待测植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒引起的特定病状，

15、从而可以判断病毒是否存在。引起的特定病状，从而可以判断病毒是否存在。例如矮缩病毒引起寄主植物叶片褪绿、坏死、扭曲、植株矮例如矮缩病毒引起寄主植物叶片褪绿、坏死、扭曲、植株矮缩等。缩等。但是对于多年生木本植物本法存在在着效率不高的缺陷。但是对于多年生木本植物本法存在在着效率不高的缺陷。B B 指示植物法：将一些对某种病毒反应敏感、症状特征显著的植物作为指示植物，指示植物法：将一些对某种病毒反应敏感、症状特征显著的植物作为指示植物，用以检验待测植物体内特定病毒的存在。该法具有灵敏、准确、可靠、操作简单，用以检验待测植物体内特定病毒的存在。该法具有灵敏、准确、可靠、操作简单，在传统的检验方法中有着不

16、可代替的作用。（包括在传统的检验方法中有着不可代替的作用。（包括a a汁液涂抹法和汁液涂抹法和b b嫁接法）嫁接法）a a汁液涂抹法：汁液涂抹法：待测脱毒植物幼叶待测脱毒植物幼叶1-31-3克克+0.1+0.1M M磷酸缓冲液磷酸缓冲液 指示植物指示植物 磨成匀浆磨成匀浆 叶片上涂一层金刚砂叶片上涂一层金刚砂 脱脂棉蘸取少量匀浆脱脂棉蘸取少量匀浆 创伤叶片创伤叶片 适宜条件培养适宜条件培养 观察目标形状观察目标形状 ：C C 电镜观察电镜观察常用的负染技术是指染料的重金属离子在样品四周堆积，常用的负染技术是指染料的重金属离子在样品四周堆积，增强样品四周的电子密度，造成很强的电子散射能力，增强样

17、品四周的电子密度，造成很强的电子散射能力，形成了一个很暗的背景，而样品对这种染料无亲和作用，形成了一个很暗的背景，而样品对这种染料无亲和作用，所以没有重金属离子堆积，很容易为电子束穿过，形成所以没有重金属离子堆积，很容易为电子束穿过，形成一个明亮的电子透明区，衬托出样品的形态和大小一个明亮的电子透明区，衬托出样品的形态和大小。D D 血清血清 学技术学技术是植物病毒诊断鉴定和分类工作的最重要手段之一，也是进行植物是植物病毒诊断鉴定和分类工作的最重要手段之一，也是进行植物病毒研究的重要方法及确定病毒种类、株系，测定病毒之间亲缘关病毒研究的重要方法及确定病毒种类、株系，测定病毒之间亲缘关系的重要工

18、具。系的重要工具。1 1抗血清的制备抗血清的制备利用植物病毒衣壳蛋白的抗原（利用植物病毒衣壳蛋白的抗原（antigenantigen）特性，可以制备病毒特异性的抗血特性，可以制备病毒特异性的抗血清（清（antiserumantiserum）。）。抗原是指能刺激动物机体产生抗体，并能与所产生的抗体进行专化性结合的抗原是指能刺激动物机体产生抗体，并能与所产生的抗体进行专化性结合的物质。物质。抗体（抗体（anti-bodyanti-body）指生物机体由于受外来抗原的刺激而产生的物体，存在于指生物机体由于受外来抗原的刺激而产生的物体，存在于动物的血清中，是一种免疫球蛋白。动物的血清中，是一种免疫球蛋

19、白。2血清学反应血清学反应 是抗原和抗体专化性的结合，最常用的有两种方是抗原和抗体专化性的结合，最常用的有两种方法。法。（1）琼脂单向扩散法）琼脂单向扩散法 在一定浓度的琼脂凝胶中，抗体与抗原互相扩散，在适当的位置在一定浓度的琼脂凝胶中，抗体与抗原互相扩散，在适当的位置形成沉淀线，沉淀线的形状说明抗原与抗体的相互关系。形成沉淀线，沉淀线的形状说明抗原与抗体的相互关系。（2 2）酶联免疫吸附（）酶联免疫吸附（enzyme linked immuno sorbent assayenzyme linked immuno sorbent assay，ELISAELISA）法，该方法利用酶的放大作用，使

20、免疫监测的灵敏度大大法，该方法利用酶的放大作用，使免疫监测的灵敏度大大提高。提高。优点：灵敏度高；速度快；专化性强，重复性好；检测对优点：灵敏度高；速度快；专化性强，重复性好；检测对象广；处理样品多。此法是实现象广；处理样品多。此法是实现“快速、准确、经济快速、准确、经济”检测的最检测的最好手段之一。好手段之一。（1 1）将抗原吸附在酶联板表面，保湿吸附后冲洗；将抗原吸附在酶联板表面，保湿吸附后冲洗；（2 2）加抗原、冲洗，形成抗体加抗原、冲洗，形成抗体+抗原复合物。抗原复合物。（3 3）加入酶标抗体、冲洗，形成抗体加入酶标抗体、冲洗，形成抗体+抗体抗体-酶的复合物。酶的复合物。（4 4）加入

21、酶的底物。加入酶的底物。（5 5）酶联板静放）酶联板静放1 1小时，底物进行水解，根据溶液的颜色变化判断小时，底物进行水解，根据溶液的颜色变化判断反应结果反应结果 E E 核酸杂交技术核酸杂交技术核酸的分子杂交主要在核酸的分子杂交主要在DNADNA和和RNARNA之间进行，依据是之间进行，依据是RNARNA与互补的与互补的DNADNA之间存在着对应的碱基互补关系，当双链之间存在着对应的碱基互补关系，当双链DNADNA之间的之间的H H键在加键在加热等变性条件下被破坏时，两条链解开成单链，此时加入互补的热等变性条件下被破坏时，两条链解开成单链，此时加入互补的RNARNA，在一定的温度和离子强度条

22、件下会形成稳定的在一定的温度和离子强度条件下会形成稳定的RNA-DNARNA-DNA异质双链。异质双链。形成异质双链的过程称杂交，由于杂交在分子水平上进行，所以称形成异质双链的过程称杂交，由于杂交在分子水平上进行，所以称分子杂交，这种异质的双链分子称杂交分子。分子杂交，这种异质的双链分子称杂交分子。（关键是特异探针制备）（关键是特异探针制备）（6 6）大批量快繁及无毒原种保存）大批量快繁及无毒原种保存 （无性系的保存参考无性系的保存参考1515章）章）3 3 影响茎尖脱毒效果的因素影响茎尖脱毒效果的因素 *母体材料病毒侵染的程度母体材料病毒侵染的程度 *外植体的生理状态外植体的生理状态 *起始

23、培养茎尖的大小起始培养茎尖的大小 三 其它植物脱毒技术 1 珠心胚培养脱毒 例子：柑橘类多胚品种中除了一个受精胚以外，尚有多个由珠心细胞形成的无性柑橘类多胚品种中除了一个受精胚以外，尚有多个由珠心细胞形成的无性胚，称为珠心胚。珠心胚与维管束系统无联系，因此由珠心胚产生的植株胚，称为珠心胚。珠心胚与维管束系统无联系，因此由珠心胚产生的植株全部均无病毒。但珠心胚全部均无病毒。但珠心胚 大多是不育的，必须分离培养才能发育成正常的大多是不育的，必须分离培养才能发育成正常的幼苗。珠心胚培养技术对除去柑橘主要病毒，如引起银屑病、叶脉突出病、幼苗。珠心胚培养技术对除去柑橘主要病毒，如引起银屑病、叶脉突出病、

24、柑橘裂皮病、柑橘速衰病等的病毒，都十分有效。柑橘裂皮病、柑橘速衰病等的病毒，都十分有效。珠心胚由珠心组织细胞即体细胞发育而成，具有和母体相同的遗传特性。2 微尖嫁接脱毒（Micrografting shoot-tip,MGST)木本植物茎尖培养难以生根形成植株。为了克服这个困难、木本植物茎尖培养难以生根形成植株。为了克服这个困难、可将实生苗砧木培育在培养基上，再从成年无病毒树枝上切可将实生苗砧木培育在培养基上，再从成年无病毒树枝上切取茎尖（取茎尖（0.141.0mm），在砧木切断面上进行试管微体嫁接），在砧木切断面上进行试管微体嫁接，就可获得无病毒的幼苗。利用这个方法，柑橘类嫁接成活，就可获得

25、无病毒的幼苗。利用这个方法，柑橘类嫁接成活率为率为30%50%，移栽成活率约，移栽成活率约95%，嫁接两年后即可结实。，嫁接两年后即可结实。应用这个技术，可获得柑橘类没有银屑病植株、桃树没有洋应用这个技术，可获得柑橘类没有银屑病植株、桃树没有洋李环斑病毒、洋李矮缩病毒、褪绿叶斑病毒的无病毒苗。李环斑病毒、洋李矮缩病毒、褪绿叶斑病毒的无病毒苗。3 愈伤组织培养脱毒 在带毒植物脱分化形成的愈伤组织中，并不是所有的细胞都 均匀带毒，利用此种现象，可以把脱分化的愈伤组织细胞再 分化形成植株的过程中，结合化学、生物除毒手段实现植物脱 毒。*脱分化细胞不带毒原因？4 花药培养脱毒 主要在草莓中实现 1 病

26、毒的复制、侵染速度赶不上细胞分裂速度2 细胞获得了抗性还有其他方法吗？5 5超低温处理超低温处理超低温脱除植物病毒法是基于超低温保存超低温脱除植物病毒法是基于超低温保存(Cryopreservation)(Cryopreservation)结合组织培养和病毒检测技术达结合组织培养和病毒检测技术达到脱毒的目的。到脱毒的目的。超低温保存是种质资源长期保存的一种理想方法。因为在液氮中超低温保存是种质资源长期保存的一种理想方法。因为在液氮中(196)196)不仅可以长期保存不仅可以长期保存植物材料，而且可以保证材料的遗传稳定性，并且要求的存贮空间最小，维护费用低在超植物材料，而且可以保证材料的遗传稳定

27、性，并且要求的存贮空间最小，维护费用低在超低温处理过程中，导致细胞死亡主要发生在冰冻和冻融期间，在此期间，细胞的结构和功低温处理过程中，导致细胞死亡主要发生在冰冻和冻融期间，在此期间，细胞的结构和功能受到严重损伤，致死冻融的细胞难以恢复生长而死亡。含有病毒的顶端细胞液泡较大，能受到严重损伤，致死冻融的细胞难以恢复生长而死亡。含有病毒的顶端细胞液泡较大，胞液中含有的水分也较多，在超低温保存过程中易被形成的冰晶破坏致死，而增殖速度较胞液中含有的水分也较多，在超低温保存过程中易被形成的冰晶破坏致死，而增殖速度较快的分生组织含的水分少，胞质浓，抗冻性强，不宜被冻死。这样超低温处理过的植株再快的分生组织

28、含的水分少，胞质浓，抗冻性强，不宜被冻死。这样超低温处理过的植株再生后可能是无病毒的，生后可能是无病毒的，因此，超低温保存作为一种可能去除病毒的方法而受到人们关注。因此，超低温保存作为一种可能去除病毒的方法而受到人们关注。BrisonBrison等首次报道采用茎尖超低温保存方法成功去除了李树等首次报道采用茎尖超低温保存方法成功去除了李树PPVPPV病毒，脱除率达到病毒，脱除率达到50%50%，而茎尖，而茎尖脱毒只有脱毒只有20%20%。HelliotHelliot等研究表明，香蕉茎尖通过超低温保存，等研究表明，香蕉茎尖通过超低温保存，2%2%材料脱除香蕉材料脱除香蕉(CMV)(CMV)，87%

29、87%材料无香蕉条纹材料无香蕉条纹病毒病毒(BSV)(BSV)感染，而常规分生组织方法不能脱除感染，而常规分生组织方法不能脱除CMVCMV病毒，对病毒，对BSVBSV的脱除率只为的脱除率只为76%76%。WangWang等用玻璃化超低温法去除了葡萄病毒等用玻璃化超低温法去除了葡萄病毒A(GVA)A(GVA)，成功率高达，成功率高达97%97%，而单独的分生组织培养脱，而单独的分生组织培养脱毒率仅为毒率仅为12%12%。蔡斌华等首次利用玻璃化超低温法成功地去除了草莓轻型黄边病毒（蔡斌华等首次利用玻璃化超低温法成功地去除了草莓轻型黄边病毒（SMYEV)SMYEV)，脱毒率达到，脱毒率达到95%95

30、%。白建明等尝试用超低温保存法和常规方法白建明等尝试用超低温保存法和常规方法(茎尖分生组织培养茎尖分生组织培养、温热疗法以及温热疗法结合茎尖分生组织培养、温热疗法以及温热疗法结合茎尖分生组织培养)来去除马铃来去除马铃薯试管苗中的马铃薯纺锤块茎类病毒薯试管苗中的马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)和和PVX。结果显示，马铃薯茎尖经过超低温保存后，存活率和成苗率结果显示，马铃薯茎尖经过超低温保存后，存活率和成苗率分别为分别为8364%和和7204%，高于茎尖分生组织培养，高于茎尖分生组织培养(4667%和和3149%)、温热疗法、温热疗法(7222%和和4444%)以及温热以及温热疗法结合茎尖分生组

31、织培养疗法结合茎尖分生组织培养(5054%和和3038%)。4种方法种方法都可以去除都可以去除PVX，其中超低温保存法的脱毒率最高，为，其中超低温保存法的脱毒率最高，为5913%，温热疗法结合茎尖分生组织培养为，温热疗法结合茎尖分生组织培养为5602%，温热疗，温热疗法和茎尖分生组织培养较低，为法和茎尖分生组织培养较低，为4261%和和3583%。曾继吾等采用玻璃化法超低温保存技术保存带有香蕉束顶病曾继吾等采用玻璃化法超低温保存技术保存带有香蕉束顶病毒（毒（BBTV)的香蕉茎尖，再生后植株的香蕉茎尖，再生后植株BBTV脱除率达到脱除率达到606%，而常规的茎尖培养对，而常规的茎尖培养对BBTV

32、的脱除率仅为的脱除率仅为267%。采用玻璃化法超低温保存还可以去除病原菌的感染，如黄龙采用玻璃化法超低温保存还可以去除病原菌的感染，如黄龙病是影响世界柑橘产业的一种毁灭性病害，目前尚无有效方病是影响世界柑橘产业的一种毁灭性病害，目前尚无有效方法防治，采用玻璃化超低温法处理使柑橘黄龙病病原菌去除法防治，采用玻璃化超低温法处理使柑橘黄龙病病原菌去除率达到率达到981%，而采用茎尖分生组织脱毒法只有，而采用茎尖分生组织脱毒法只有253%的的植株无病原菌侵染。植株无病原菌侵染。超低温脱毒法不仅脱毒率很高，而且明显优于其他超低温脱毒法不仅脱毒率很高，而且明显优于其他3种方法，种方法，主要表现在易于操作主

33、要表现在易于操作;存活率、再生率和脱毒率高存活率、再生率和脱毒率高;不需要昂贵不需要昂贵的仪器的仪器;短时间内就可以生产出无毒植株。短时间内就可以生产出无毒植株。四 植物脱毒的应用 1 起源国外1952年法国莫勒尔用生长点培养法获得无病毒植株成功 2 已实现脱毒快繁成熟体系的植物：马铃薯、大蒜、草莓、苹果、香蕉、柑橘、草莓、花卉 3 存在问题：品种局限、成本问题、重视程度丁兰等从2010年开始，利用双抗体夹心方法对国内广东、深圳、上海、兰州等一些较大型蝴蝶兰生产基地分生苗种苗的常规品系的种主要病毒进行了调查。数据显示，受试品系中，有的品系携带病毒，并且呈强阳性反应。其中有的品系为复合感染（携带双病毒），仅有的品系携带单种病毒。结果表明，国内蝴蝶兰种苗品质不容乐观，各兰花基地种苗生产所面临的品种由于严重带毒而导致品质退化的问题应该给予足够的重视，脱毒研究引入生产环节势在必行。作业：作业：脱毒植物的检验方法有那些，原理是什脱毒植物的检验方法有那些，原理是什么么？柑橘黄化病