大学课程植物组织培养15种质保存-组培课件.ppt

1、种质贮存种质贮存 一 引言 二 冷冻保存三 低温贮存四 离体无性系冷冻的意义五 课后问题 一一 引言引言1 1 利用种子进行种质保存的优缺点：利用种子进行种质保存的优缺点：优点：空间小，保存多年，易于干燥和包装优点：空间小，保存多年，易于干燥和包装 局限性：随着贮存时间的延长种子的生活力下降，病虫害侵袭。局限性：随着贮存时间的延长种子的生活力下降，病虫害侵袭。除了无融合生殖物种以外，难以保存各种来源不同的除了无融合生殖物种以外，难以保存各种来源不同的 无性系；无性系；不适用于营养繁殖的作物。不适用于营养繁殖的作物。2 2 利用离体无性系培养物进行进行种质保存的优点：利用离体无性系培养物进行进行

2、种质保存的优点：（1 1）空间小空间小 （2 2）不受病虫害侵袭不受病虫害侵袭 （3 3）可以快速扩繁可以快速扩繁 （4 4）便于国际间种至交流）便于国际间种至交流 3 3 离体无性系贮存的两种方法：离体无性系贮存的两种方法：（1 1）冷冻保存）冷冻保存 （2 2）低温贮存低温贮存 国家种质资源库国家种质资源库n国家种质库是全国作物种质资源长期保存与研究中心。该库在美国洛克菲勒基金会和国际植物遗传资源委员会的部分资助下，于1986年10月在中国农业科学院落成，隶属于作物品种资源研究所。国家种质库保存资源的对象国家种质库保存资源的对象n保存对象：凡能通过种子繁殖维持物种遗传完整性的各类植物种质资

3、源，都可保存到国家种质库，其种子应是耐低温和耐干燥类型，即正常型种子（orthodox seeds）。n贮存条件：温度-18，相对湿度低于50%。根据理论上推算，含水量为5-8%的种子，在上述贮存条件下，其寿命可延长到50年以上。发芽率监测结果表明，库存大部分种子经过15年贮藏，其发芽率没有出现明显的下降。因此，低温贮藏是目前种子体种质的最佳保存途经。n位于北京中国农业科学院大院内的新建成“国家农作物种质保存中心”保存设施，于2002年投入使用，使国家种质库长期贮存总容量增加到6070万余份。因此，凡能通过种子繁殖维持物种遗传特性的植物种子都可送国家种质库保存。中国科学院西双版纳热带植物园中国

4、科学院西双版纳热带植物园热带植物种质资源库热带植物种质资源库(原原“珍稀濒危特有植物种质资源库珍稀濒危特有植物种质资源库”)n以种子和植物组织体为基本材料，收集、评价、保藏和分发我国热带、亚热带重要植物资源特别是稀有濒危特有植物种质资源IRRIInternational Rice Research Institute世界末日种子库世界末日种子库The Svalbard Doomsday Seed Vault位于距离北极点约位于距离北极点约1000 公里的挪威斯瓦尔巴群岛的一处山公里的挪威斯瓦尔巴群岛的一处山洞中，约洞中，约1 亿粒世界各地的农作物种子被保存在零下亿粒世界各地的农作物种子被保存在

5、零下18 摄摄氏度的地窖中。氏度的地窖中。此外，该种子库堪称全球最安全的基因储存库，其安全性此外，该种子库堪称全球最安全的基因储存库，其安全性堪比美国国家黄金储藏库，甚至可以抵御地震和核武器堪比美国国家黄金储藏库，甚至可以抵御地震和核武器.这座种子库的建设目的，是把世界各地的各种植物种子保这座种子库的建设目的，是把世界各地的各种植物种子保存在地下仓库里，以防因为全球物种多样性迅速减小造成存在地下仓库里，以防因为全球物种多样性迅速减小造成物种灭绝。物种灭绝。Construction began in July 2006 on the Svalbard Global Seed Vault.Orig

6、inally scheduled for completion in September 2007,the first seeds were delivered in February 2008.The remote location,harsh conditions and unique engineering were all challenges for builders.For nearly four months every year,the region is completely dark.摄影师卡洛琳摄影师卡洛琳波伦拍摄了把印度海得拉巴一农场种波伦拍摄了把印度海得拉巴一农场种植

7、的植物种质运输到挪威植的植物种质运输到挪威“末日末日”种子库的全过程。种子库的全过程。国际半干旱热带地区作物研究院的科学家挑选合格的种子装船。国际半干旱热带地区作物研究院的科学家挑选合格的种子装船。国际半干旱热带地区作物研究院将为该种子库捐献出在印度生长的国际半干旱热带地区作物研究院将为该种子库捐献出在印度生长的5种植物的种植物的20000个样本。个样本。种子选好后，他们会通过真空包装，把这些种子装到种子选好后，他们会通过真空包装，把这些种子装到4层的特殊塑料袋里层的特殊塑料袋里，并通过热封口方式，去除潮气。，并通过热封口方式，去除潮气。这批从印度运来的种子到达斯瓦尔巴特群岛，稍后将被运往挪威

8、种子库。这批从印度运来的种子到达斯瓦尔巴特群岛，稍后将被运往挪威种子库。斯瓦尔巴德岛全球种子库斯瓦尔巴德岛全球种子库(Svalbard Global Seed Vault)的管理员奥拉的管理员奥拉韦森韦森在机场把这些种子集中到一起。在机场把这些种子集中到一起。到达了到达由挪威政府建造，全球作物多样性信托基金到达了到达由挪威政府建造，全球作物多样性信托基金(The Global Crop Diversity Trust)经营的斯瓦尔巴德岛全球种子库经营的斯瓦尔巴德岛全球种子库，可，可以储存来自以储存来自100个国家的个国家的1亿种作物种子。亿种作物种子。在把印度运来的种子放进种子库以前，韦森对出

9、货清单上的所有种子进行在把印度运来的种子放进种子库以前，韦森对出货清单上的所有种子进行核实。核实。斯瓦尔巴德岛全球种子库的储藏区位于一座沙岩山下大约斯瓦尔巴德岛全球种子库的储藏区位于一座沙岩山下大约400英尺的地方。英尺的地方。挪威之所以会选择在这里建设种子库，是因为这一地区地质活动较少，而挪威之所以会选择在这里建设种子库，是因为这一地区地质活动较少，而且处于永冻土地带。由于这座山位于海平面以上且处于永冻土地带。由于这座山位于海平面以上430英尺的地方，即使冰雪英尺的地方，即使冰雪融化，这座种子库仍会很干燥。融化，这座种子库仍会很干燥。斯瓦尔巴全球种子库冷藏温度在零下斯瓦尔巴全球种子库冷藏温度

10、在零下18度，因大多数作物的种子都能保存上百度，因大多数作物的种子都能保存上百年年二二 冷冻保存冷冻保存 1 1 定义定义 通过一定处理，把离体无性系保存在液氮中，使通过一定处理，把离体无性系保存在液氮中，使 培养物的活动处于停滞状态，达到种质保存的目的。培养物的活动处于停滞状态，达到种质保存的目的。2 程序或步骤：程序或步骤：材料予处理材料予处理 冷冻降温冷冻降温 贮存贮存 解冻解冻 重新培养重新培养 二 冷冻保存3低温对细胞的伤害和冷冻保护剂的必要性低温对细胞的伤害和冷冻保护剂的必要性 （1）低温对细胞的伤害：低温对细胞的伤害：A 细胞内冰晶形成引起细胞破裂，细胞内冰晶形成引起细胞破裂，造

11、成物理理损伤造成物理理损伤 B 自由水冷冻后引起细胞脱水，造成自由水冷冻后引起细胞脱水，造成 生理伤害生理伤害 （2）冷冻保护剂的作用：）冷冻保护剂的作用：A 提高溶液的粘滞性，防止细胞内大提高溶液的粘滞性，防止细胞内大 冰晶的形成，防止物理损伤冰晶的形成，防止物理损伤 B降低冰点，促进细胞胶质的降低冰点，促进细胞胶质的“玻璃玻璃 化化”态形成，态形成，C 稳定细胞内大分子物质的正常结构稳定细胞内大分子物质的正常结构 特别是膜结构，阻止低温对其伤害特别是膜结构，阻止低温对其伤害 二 冷冻保存4 冷冻前的预处理冷冻前的预处理 （1）预处理的必要性：预处理的必要性：调整生理状态（如渗透压的调整）调

12、整生理状态（如渗透压的调整）（2）采取的一般措施：）采取的一般措施：加入冷冻保护剂培养一段时间加入冷冻保护剂培养一段时间 3 取材：取材：1 分生能力较强的细胞或组织分生能力较强的细胞或组织 A 茎尖茎尖 B 胚性愈伤组织胚性愈伤组织 C 处于处于延迟后期延迟后期或或对数生长期对数生长期的悬浮细胞的悬浮细胞 5 冷冻降温冷冻降温 （1）冷冻降温的几种方法：）冷冻降温的几种方法：A慢冻法慢冻法：温度下降速度为温度下降速度为0.1-1摄氏度摄氏度/分钟分钟 B快冻法：快冻法：温度下降速度为温度下降速度为50-1200摄氏度摄氏度/分钟分钟 C 分步冷冻法：分步冷冻法：先用慢速把温度降低到先用慢速把

13、温度降低到-30 -50度，停留度，停留 一段时间，然后再快速投入到液氮罐中。一段时间，然后再快速投入到液氮罐中。事实上在实际操作过程中，三种方法没有明显的区分，事实上在实际操作过程中，三种方法没有明显的区分，大多数联用。大多数联用。5 解冻和重新培养解冻和重新培养 （1）解冻）解冻 一般措施：把材料从液氮罐中取出投入一般措施：把材料从液氮罐中取出投入 3040度水浴锅中（速度度水浴锅中（速度500-750度度/分分 钟）。钟）。（2）清洗）清洗 A 目的：去掉冰冻保护剂，降低渗透压目的：去掉冰冻保护剂，降低渗透压 B 清洗液一般为液体培养基清洗液一般为液体培养基 清洗有坏处吗？为什么？如何应

14、对？清洗有坏处吗？为什么？如何应对？（3）培养物的存活率：）培养物的存活率：A 理论存活率的公式：理论存活率的公式：重新生长的细胞或器官组织数目重新生长的细胞或器官组织数目/解冻的细胞或器官组织数目解冻的细胞或器官组织数目 B 实际测定存活率的公式（方法）：实际测定存活率的公式（方法）：冷冻后的细胞活力冷冻后的细胞活力/冷冻前的细胞活力冷冻前的细胞活力 C 实际测定存活率的方法：实际测定存活率的方法：荧光素双醋酸酯（荧光素双醋酸酯（FDA）法、）法、氯化三苯四唑（氯化三苯四唑（TTC）法）法、伊凡蓝法伊凡蓝法 三 低温保存种质也可以用离体培养的方式保存在非冻结程度的低温下（1-9）植物材料的老

15、化过程减慢，但不像在超低温保存中完全停止，因此仍需继代，但间隔时间延长。主要用于芽主要用于芽 苗的保存，费用低廉，时间较短苗的保存，费用低廉，时间较短 还会有那些保存方式？还会有那些保存方式？新型冷冻保护剂新型冷冻保护剂抗冻蛋白抗冻蛋白近20年来,低温冻存技术的改进极大地促进了细胞工程的发展,而这一切又离不开冷冻保存剂的研究与探索。目前抗冻蛋白(Antifreeze Proteins,AFP)作为一种新型冷冻保存剂,已经引起研究者的足够重视,并成为目前的研究热点之一随着研究的不断深入,抗冻蛋白有可能逐渐取代传统的冷冻保存剂脱水法脱水法原理：是在冷冻前先用人工的方法把待保存材料中的自由水脱除，以

16、防止冷冻过程中结冰对细胞造成伤害。耐脱水的种子对脱水速率没有要求，但顽拗性种子则需要快速脱水，而且常常是用胚或胚轴做超低温保存的目标材料。快速脱水可以通过活化硅胶吸除水分或通过无菌气流带走水分来实现。在顽拗性/中间型种子方面，Grout等(1983)首先使用这一方法保存了油棕的胚，后来这一方法又被用来成功的保存了许多植物，如咖啡、蒲葵等包埋法和包埋脱水法包埋法和包埋脱水法包埋法是借用人工种子的技术发展起来的，其主要步骤是在冷冻前先把待保存包埋法是借用人工种子的技术发展起来的，其主要步骤是在冷冻前先把待保存材料悬浮在含有高浓度的甘油、蔗糖的海藻酸钠溶液中，然后用滴管把待保材料悬浮在含有高浓度的甘

17、油、蔗糖的海藻酸钠溶液中，然后用滴管把待保存材料滴到含有相同浓度的甘油、蔗糖的氯化钙溶液中，静置一段时间让海存材料滴到含有相同浓度的甘油、蔗糖的氯化钙溶液中，静置一段时间让海藻酸钙螯合和固化，在待保存材料表面形成一个包裹层，成为包埋珠。藻酸钙螯合和固化，在待保存材料表面形成一个包裹层，成为包埋珠。在包埋处理的过程中，因为渗透脱水等原因待保存材料的低温耐性有一定的提在包埋处理的过程中，因为渗透脱水等原因待保存材料的低温耐性有一定的提高，同时材料外的包裹层又具有一定的保护作用，可以减轻接下来的脱水、高，同时材料外的包裹层又具有一定的保护作用，可以减轻接下来的脱水、玻璃化及冷冻处理对材料的伤害。玻璃

18、化及冷冻处理对材料的伤害。包埋珠经吸干表面水分后，可以直接用于冷冻保存。包埋珠经吸干表面水分后，可以直接用于冷冻保存。如烟草悬浮细胞，但是更多的材料在包埋后还需要经过进一步脱水或玻璃化如烟草悬浮细胞，但是更多的材料在包埋后还需要经过进一步脱水或玻璃化处理才能实施冷冻保存，具体情况依种而定。处理才能实施冷冻保存，具体情况依种而定。梨、葡萄的茎尖和胡萝卜的体细胞胚是最早用包埋脱水法成功超低温保存的材梨、葡萄的茎尖和胡萝卜的体细胞胚是最早用包埋脱水法成功超低温保存的材料。料。目前，文献报道使用该方法成功实现超低温保存的植物材料有近百种目前，文献报道使用该方法成功实现超低温保存的植物材料有近百种玻璃化

19、法、包埋玻璃化法和微滴玻璃化法玻璃化法、包埋玻璃化法和微滴玻璃化法玻璃化玻璃化是指液相物质被过冷却到深低温，在冷冻过程中不出现结晶现象，并最终固化成是指液相物质被过冷却到深低温，在冷冻过程中不出现结晶现象，并最终固化成无定形的玻璃样状态的过程。无定形的玻璃样状态的过程。玻璃化法的原理是利用高浓度的玻璃化溶液处理待保存材料，玻璃化溶液中有些成分可玻璃化法的原理是利用高浓度的玻璃化溶液处理待保存材料，玻璃化溶液中有些成分可以引起细胞脱水，有些成分可以渗透进入原生质，从而极大的提高了原生质的粘滞程以引起细胞脱水，有些成分可以渗透进入原生质，从而极大的提高了原生质的粘滞程度，因此在接下来的快速降温过程

20、中细胞内的水分子来不及按冰晶方式排列而呈玻璃度，因此在接下来的快速降温过程中细胞内的水分子来不及按冰晶方式排列而呈玻璃态，或只能形成极微小的冰晶，避免对细胞造成伤害。态，或只能形成极微小的冰晶，避免对细胞造成伤害。植物材料超低温保存中常用的玻璃化溶液是植物材料超低温保存中常用的玻璃化溶液是PVS1、PVS2和和PVS3。文献记载使用玻璃化。文献记载使用玻璃化法成功超低温保存的植物有法成功超低温保存的植物有130余种，绝大多数都是使用余种，绝大多数都是使用PVS2。包埋玻璃化法包埋玻璃化法是先把材料包埋成海藻酸钙的小珠，然后按玻璃化法的程序处理。到目前是先把材料包埋成海藻酸钙的小珠，然后按玻璃化

21、法的程序处理。到目前已有已有10多种植物材料用该方法成功实现了超低温保存，其中山葵的顶端分生组织是最多种植物材料用该方法成功实现了超低温保存，其中山葵的顶端分生组织是最先使用这一方法的例子先使用这一方法的例子微滴玻璃化法微滴玻璃化法是结合了玻璃化法和微滴法的技术，待保存材料先用玻璃化溶液处理，然是结合了玻璃化法和微滴法的技术，待保存材料先用玻璃化溶液处理，然后单个放到铝箔片上的玻璃化溶液微滴中，投入液氮快速冷冻，因为表面张力的作用，后单个放到铝箔片上的玻璃化溶液微滴中，投入液氮快速冷冻，因为表面张力的作用，操作过程中微滴并不会从铝箔条上滑落。操作过程中微滴并不会从铝箔条上滑落。该方法是近些年创

22、造出来的，目前用该法保存的植物材料也有该方法是近些年创造出来的，目前用该法保存的植物材料也有10多种多种四 离体无性系冷冻保存意义1 长期保持种质的遗传稳定性长期保持种质的遗传稳定性2 长期保存去病毒的物种长期保存去病毒的物种3 保护稀有珍贵植物及濒危植物的种植资源保护稀有珍贵植物及濒危植物的种植资源4 保持不稳定性的培养物，如单倍体保持不稳定性的培养物，如单倍体5 保持培养物如悬浮细胞、愈伤组织的形态发生和再生保持培养物如悬浮细胞、愈伤组织的形态发生和再生能力能力6 便于国际间交流便于国际间交流7 冷冻和解冻过程中可以起到离体筛选所用，是筛选抗冷冻和解冻过程中可以起到离体筛选所用，是筛选抗逆特别是抗寒作物的一个潜在途径逆特别是抗寒作物的一个潜在途径 作业1 冷冻保存的程序中主要包括几个步骤？冷冻保存的程序中主要包括几个步骤？2离体无性系冷冻保存意义？