酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用培训课件.ppt

1、酶免疫分析技术在生酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用物药物分析中的应用一、一、GLP-1GLP-1活性检测活性检测Cyclic Adenosine Monophosphate(cAMP)ELISA Kit 2酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用GLP-1GLP-1 GLP-1是已发现的促胰岛素分泌作用最强的肠肽类激素，是已发现的促胰岛素分泌作用最强的肠肽类激素，它通过与它通过与GLP-1受体受体(GLP-1R)结合发挥作用结合发挥作用 1）GLP-1可通过刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃可通过刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃排空来降低血糖排空来降低血糖 2）GLP-1还有减缓还有

2、减缓细胞凋亡，促进其再生的独特作用细胞凋亡，促进其再生的独特作用 3）GLP-1还能减慢胃排空速度，通过作用下丘脑，抑制食欲还能减慢胃排空速度，通过作用下丘脑，抑制食欲。3酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用 GLP-1GLP-1结合结合GLP-1RGLP-1R后，激活细胞膜内环腺苷酸后，激活细胞膜内环腺苷酸(cAMP)(cAMP)和丝裂原和丝裂原激活蛋白激酶激活蛋白激酶(MAPK)(MAPK)通路通路 胰岛成熟胰岛成熟细胞的细胞的GLP-1GLP-1受体偶联受体偶联GsGs，活化腺苷酰环化酶，产，活化腺苷酰环化酶，产生生cAMPcAMP，后者与葡萄糖协同刺激胰岛素合成和分泌，刺激胰，后者与葡

3、萄糖协同刺激胰岛素合成和分泌，刺激胰岛素基因转录和胰岛素原生物合成，可降低胰高血糖素浓度岛素基因转录和胰岛素原生物合成，可降低胰高血糖素浓度并抑制胰高血糖素分泌，增强细胞对胰岛素的敏感性，刺激并抑制胰高血糖素分泌，增强细胞对胰岛素的敏感性，刺激胰岛素依赖性糖原合成，降低餐后血糖浓度。胰岛素依赖性糖原合成，降低餐后血糖浓度。4酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用3535LigandLigand sAC sGTPATPcAMP PKACa2+NFAT-PNFATCalcineurinCREB-PNFAT-RECREF-LuciferseR-LuciferseGLP-1 Receptor3535报告

4、基因检测原理5酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用试验原理试验原理 采用直接竞争采用直接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被方法，在酶标板微孔条上预包被cAMP特异性抗体，样品中特异性抗体，样品中cAMP将和标准将和标准HRP-cAMP竞争结合竞争结合微孔条上微孔条上cAMP特异性抗体，用特异性抗体，用TMB底物显色，吸光值与底物显色，吸光值与样品中样品中cAMP的含量成负相关。的含量成负相关。以吸光值为纵坐标，样品浓度为横坐标，按四参数法回归以吸光值为纵坐标，样品浓度为横坐标，按四参数法回归拟合对照品和供试品的量效曲线拟合对照品和供试品的量效曲线，得出半效量浓度，求得得出半效量浓度，求

5、得供试品相对生物活性。供试品相对生物活性。6酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用操作程序：操作程序：1、取微孔板条，加入取微孔板条，加入cAMP特异性抗体，特异性抗体，50ul/孔，室温孔，室温1 h;2、洗涤后，向不同孔中分别洗涤后，向不同孔中分别cAMP、对照或细胞裂解上清品（样、对照或细胞裂解上清品（样品），品），100ul/孔；孔；3、向孔中加入向孔中加入HRP-cAMP，50 ul/孔，室温作用孔，室温作用2h；4、洗涤后，向孔中加入洗涤后，向孔中加入TMB溶液，溶液，200 ul/孔，室温作用孔，室温作用30min；5、向孔中加入终止液，向孔中加入终止液，100 ul/孔，测定孔，

6、测定OD450nm/570nm7酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用数据与结果数据与结果 1.标准曲线的绘制：标准曲线的绘制：（1）测定各浓度梯度下各孔对照品和供试品相应的吸光值，并分）测定各浓度梯度下各孔对照品和供试品相应的吸光值，并分别计算平均值；别计算平均值；（2）以吸光值为纵坐标，样品浓度为横坐标，按四参数法回归拟）以吸光值为纵坐标，样品浓度为横坐标，按四参数法回归拟合对照品和供试品的量效曲线，得出半效量浓度；合对照品和供试品的量效曲线，得出半效量浓度；对照品对照品EC50；测试样；测试样EC502.数据处理：数据处理：供试品相对生物活性（供试品相对生物活性（%）=对照品对照品EC50

7、/供试品供试品EC50 100%其中：对照品和供试品的其中：对照品和供试品的EC50分别表示对照品和测试样的半效分别表示对照品和测试样的半效量的浓度。四参数方程中的量的浓度。四参数方程中的C值即相当于半效量的浓度值即相当于半效量的浓度(EC50)。8酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用典型的测定结果及回归曲线典型的测定结果及回归曲线x axis0.11101001000100005000150002500035000Graph#1y=(A-D)/(1+(x/C)B)+D:ABCDR2Plot#1(STd:Concentration vs MeanValue)39559.981.07816.00

8、26571.4050.999Plot#2(100%:Concentration vs MeanValue)38463.371.3115.5647742.070.999Plot#3(50%:Concentration vs MeanValue)38642.451.5431.6327942.7390.999Plot#4(150%:Concentration vs MeanValue)38171.11.34312.6557056.6770.9969酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用10酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用二、宿主蛋白（二、宿主蛋白（HCPHCP）残留检测）残留检测Cygnus F5

9、50 CHO HCP ELISA Kit11酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用宿主细胞蛋白污染物宿主细胞蛋白污染物 CHO宿主蛋白残留宿主蛋白残留 E-coli宿主蛋白残留宿主蛋白残留 酵母菌宿主蛋白残留酵母菌宿主蛋白残留 HEK293宿主蛋白残留宿主蛋白残留12酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用 2D2D分离分离CHOCHO、酵母、大肠杆菌等细胞系的全蛋白谱、酵母、大肠杆菌等细胞系的全蛋白谱 将将2D Gel2D Gel上的全蛋白转移至膜上，用多克隆抗体孵育上的全蛋白转移至膜上，用多克隆抗体孵育后进行后进行Western BlotWestern Blot化学发光检测，以确认多克隆抗化学发

10、光检测，以确认多克隆抗体能够与哪些宿主细胞蛋白结合体能够与哪些宿主细胞蛋白结合 通过通过Western BlotWestern Blot检测结果（多抗能检测到的检测结果（多抗能检测到的HCPHCP数量数量）与）与2D2D膜上检测结果（总膜上检测结果（总HCPHCP数量）的比较，得出用于数量）的比较，得出用于评价检测的多克隆抗体特异性及适用性的评价检测的多克隆抗体特异性及适用性的Match RateMatch Rate评估评估HCPHCP定量定量用用多克隆抗体的特异性多克隆抗体的特异性13酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用14酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用试验原理试验原理 采用双位点酶联

11、免疫检测法，在酶标板微孔条上采用双位点酶联免疫检测法，在酶标板微孔条上预包被抗预包被抗CHO CHP多抗，免疫反应构成为夹层式多抗，免疫反应构成为夹层式结构：固相抗体结构：固相抗体-HCP-酶标记抗体。反应结束后酶标记抗体。反应结束后清洗酶标板去除未结合反应物，添加清洗酶标板去除未结合反应物，添加TMB底物显底物显色，吸光值与样品中色，吸光值与样品中CHO宿主蛋白的含量成正相宿主蛋白的含量成正相关。关。15酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用检测步骤：检测步骤：（1）于每个反应孔中，加入）于每个反应孔中，加入100 L抗抗CHO HCP多抗多抗-HRP；（2）从标准蛋白液、对照和样品中吸取）从

12、标准蛋白液、对照和样品中吸取50 L 上清加入到上清加入到已标记已标记好的反应孔中；好的反应孔中；180rpm下室温、振荡培养下室温、振荡培养2h；（3）弃去孔内溶液，每孔加）弃去孔内溶液，每孔加350 L 洗涤液，重复洗涤洗涤液，重复洗涤4次；次；（4）于每个反应孔中，加入于每个反应孔中，加入100 L TMB底物溶液，于室温孵育底物溶液，于室温孵育30min；（5）于每个反应孔中，加入）于每个反应孔中，加入100 L终止液；依序读取终止液；依序读取OD450/650 nm吸收值吸收值(空白对照孔调零空白对照孔调零)。（6）数据处理：根据测定每孔标准液吸光值绘制四参数逻辑曲线）数据处理：根据

13、测定每孔标准液吸光值绘制四参数逻辑曲线，然后根据样品吸光值计算出样品中，然后根据样品吸光值计算出样品中HCP浓度。浓度。16酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用17酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用18酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用19酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用20酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用21酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用ELISAELISA法研究药物作用靶点（法研究药物作用靶点（GPGPb/b/a a受受体）体）实验原理实验原理 根据根据ELISA实验原理，先在实验原理，先在96孔板上包被纤维蛋白原，然孔板上包被纤维蛋白原，然后同时加入后同时加入GPIIb

14、/IIIa受体和待测样品，再加酶标抗体与受体和待测样品，再加酶标抗体与GPIIb/IIIa受体结合，最后加入底物，酶作用于底物显色受体结合，最后加入底物，酶作用于底物显色，在，在405nm测得测得OD值，值，OD值与值与GPIIb/IIIa受体量成正比受体量成正比。如果样品与。如果样品与GPIIb/IIIa 受体结合，就会降低纤维蛋白原受体结合，就会降低纤维蛋白原与受体的结合，导致所测的与受体的结合，导致所测的OD值降低。值降低。22酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用 实验步骤：实验步骤：首先将纤维蛋白原（首先将纤维蛋白原（10 g/ml）用）用buffer A（0.1 M Na2CO3,P

15、H 9.5）包被于）包被于96孔板上（孔板上（100 l/well）（空白对照）（空白对照:不包被纤维蛋白原）不包被纤维蛋白原），4C孵育过夜；孵育过夜；TACTS（0.02M Tris-HCl,PH 7.5，0.15M NaCl，1mM CaCl2,0.02%NaN3,0.05%Tween 20）冲洗一次，每孔）冲洗一次，每孔200l，3min；用含；用含1%BSA 的的TACTS 在在37C封闭封闭1h（200 l/well）,TACTS洗三次；洗三次；整合素整合素IIb3（20 g/ml、50 L/well）加一定浓度的待测样品）加一定浓度的待测样品50 l作为样品组；加孵育液做阴性对照

16、组；作为样品组；加孵育液做阴性对照组；37C下孵育下孵育2h；TACTS 洗三次；加一抗（鼠抗人洗三次；加一抗（鼠抗人CD61抗体，含抗体，含0.5%BSA,TACTS稀释，稀释，1:2000(体积比体积比)，100L/孔）孔）37C下孵育下孵育1h；23酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用TACTS 洗三次；加二抗（碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠洗三次；加二抗（碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG，含，含0.5%BSA,TACTS稀释，稀释，1:1000，100L/孔），孔），37C下孵育下孵育1h；TACTS洗三次，加底物（对硝基苯磷酸二钠溶液洗三次，加底物（对硝基苯磷酸二钠溶液(PNPP)1mg/m

17、l，用，用buffer B溶解，溶解，200L/well），），37下孵育下孵育30min；加入；加入50L 3M NaOH(称称0.6g加加5ml蒸馏水蒸馏水)终止反应；终止反应；5min内内405nm波长下检测吸光度。波长下检测吸光度。24酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用数据处理数据处理通过以下公式计算抑制率：通过以下公式计算抑制率：(XY)/(X-Z)100%。X代表代表生理盐水组生理盐水组OD值；值；Y代表样品组代表样品组OD值；值；Z代表空白对照组代表空白对照组OD值。实验结果都用均数值。实验结果都用均数标准差（标准差（s）表示，采用）表示，采用t检验进行单因素方差分析。检验进行

18、单因素方差分析。p1mg/ml时较稳定。时较稳定。27酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用 20152015年版药典凡例十六：（年版药典凡例十六：（3 3）生产过程中，应尽可）生产过程中，应尽可能避免使用抗生素，必须使用时，应选择安全性风险能避免使用抗生素，必须使用时，应选择安全性风险相对较低抗生素，使用抗生素种类不得超过相对较低抗生素，使用抗生素种类不得超过1 1种，且种，且产品后继工艺应保证可有效去除制品中抗生素，去除产品后继工艺应保证可有效去除制品中抗生素，去除工艺应该验证。工艺应该验证。（4 4）生产过程中使用抗生素时，成品鉴定中应检测）生产过程中使用抗生素时，成品鉴定中应检测抗生素残

19、留量，并规定残留量限制。上述的生产过程抗生素残留量，并规定残留量限制。上述的生产过程包括种子培养活化，发酵，纯化等所有的步骤，所以包括种子培养活化，发酵，纯化等所有的步骤，所以种子活化阶段是算在生产过程中的。种子活化阶段是算在生产过程中的。29酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用试验原理试验原理 采用间接竞争采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的卡那霉素将和微孔包被偶联抗原，样本中残留的卡那霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗卡那霉素抗体，加条上预包被的偶联抗原竞争抗卡那霉素抗体，加入酶标二抗后，用入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本

20、吸光值与底物显色，样本吸光值与残留物卡那霉素的含量成负相关，与标准曲线比残留物卡那霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中卡较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中卡那霉素的含量。那霉素的含量。30酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用操作步骤操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20-25)平衡平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于于2-8。3、洗涤工

21、作液在使用前也需回温。、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。31酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用5、加标准品、加标准品/样本：加入标准品样本：加入标准品/样本样本20ml 到对应的微孔中，加到对应的微孔中，加入酶标二抗入酶标二抗50ml/孔，再加入抗体工作液孔，再加入抗体工作液80ml/孔，轻轻振荡孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置混匀，用盖板膜盖板后置25避光环境中反应避光环境中反应40min。6、

22、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250ml/孔，充分洗涤孔，充分洗涤45次，每次间隔次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。，用吸水纸拍干。7、显色：加入底物液、显色：加入底物液A液液50ml/孔，再加底物液孔，再加底物液B液液50ml/孔，轻孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25避光环境中避光反应避光环境中避光反应15min。8、测定：加入终止液、测定：加入终止液50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长处（建议用双波长450/630nm检测，在检

23、测，在5min内读完数内读完数据），测定每孔据），测定每孔OD值。值。32酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用定量分析定量分析（1）百分吸光率的计算）百分吸光率的计算 标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，标准）的吸光度值，再乘以再乘以100%，即，即 百分吸光度值（百分吸光度值（%）B/B0100%B标准溶液或样本溶液的平均吸光度值标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B00ppb标准溶液的平均吸光度值标准溶液的平均吸光度值（2）标准曲线的绘制

24、与计算）标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标，以卡那霉素标准品浓度（以标准品百分吸光率为纵坐标，以卡那霉素标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中卡那霉素实际残留量。其对应的稀释倍数即为样本中卡那霉素实际残留量。33酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用卡那霉素测定方法验证卡那霉素测定方法验证 检测方法和标准曲线检测方法和标准曲线竞争ELISA法测定药盒卡那霉素标准品

25、34酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用卡那霉素在样品溶液中的回收率卡那霉素在样品溶液中的回收率试验浓度(ppb)回收率(%)Mean(%)CV(%)20.097.55 95.11 98.71 99.15 101.84 97.69 98.34 2.25 5.095.79 82.90 88.29 103.64 98.72 88.42 92.96 8.31 1.088.52 89.67 89.41 89.41 92.40 86.14 89.26 2.26 卡那霉素在样品稀释液中的回收率(n=6)35酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用精密度试验精密度试验试验浓度（ppb）20.05.01.0实测值

26、准确度(%)实测值准确度(%)实测值准确度(%)板内25.55102.204.9298.350.9999.2124.8599.415.12102.381.07107.0725.76103.064.9398.620.8989.4225.37101.504.6192.280.8787.0924.7198.865.34106.730.9898.3925.80103.204.9799.310.8888.19Mean25.34101.374.9899.610.9594.89CV(%)1.814.818.36板内24.9499.765.60112.050.9089.5424.6198.455.51110.

27、260.9494.3825.42101.675.15103.091.0099.6225.42101.674.7494.721.06106.3924.3397.314.7294.300.9998.8923.7795.065.05101.010.8888.37Mean24.7598.995.13102.570.9696.20CV%2.617.327.08板间CV(%)2.476.117.43卡那霉素稀释样本竞争ELISA法分析精密度试验结果(n=6)36酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用四、人胰岛素原残留检测四、人胰岛素原残留检测Mercodia Proinsulin ELISA kit 37酶

28、免疫分析技术在生物药物分析中的应用 目前重组人胰岛素生产主要以目前重组人胰岛素生产主要以E.coli表达人胰岛素原表达人胰岛素原，初步纯化后变复性，经胰蛋白酶，初步纯化后变复性，经胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶和羧肽酶B(carboxypeptidase B)协同酶切，去掉前导肽和协同酶切，去掉前导肽和C-肽肽，形成有活性的胰岛素，并进一步纯化精制而成。，形成有活性的胰岛素，并进一步纯化精制而成。上述工艺制备所得人胰岛素产品中可能残留人胰岛素上述工艺制备所得人胰岛素产品中可能残留人胰岛素原、原、C-肽等人胰岛素相关杂质，其残留的存在可能影肽等人胰岛素相关杂质，其残留的存在可能影响人胰岛素的

29、药效。响人胰岛素的药效。38酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用 Insulin conversion formation process and structure diagram39酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用试验原理试验原理 采用双单抗夹心采用双单抗夹心ELISA法法，在酶标板微孔条上预在酶标板微孔条上预包被抗胰岛素原包被抗胰岛素原C-肽特异性抗体，样品中胰岛素肽特异性抗体，样品中胰岛素原结合微孔条上的特异性抗体，然后加入原结合微孔条上的特异性抗体，然后加入HRP标标记的抗胰岛素特异性抗体，用记的抗胰岛素特异性抗体，用TMB底物显色，吸底物显色，吸光值与样品中胰岛素原的含量成正相

30、关。光值与样品中胰岛素原的含量成正相关。40酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用操作步骤操作步骤1、加样：加待检样品，、加样：加待检样品，100 l/孔，孔，37 2 h，同上洗，同上洗涤；涤；2、加酶标抗体：酶标抗体稀释液稀释、加酶标抗体：酶标抗体稀释液稀释HRP-13A4至工至工作浓度，作浓度，100 l/孔，孔，37 1h，同上洗涤；，同上洗涤；3、显色和中止反应：加新鲜配制的底物、显色和中止反应：加新鲜配制的底物100l/孔，孔，37避光作用避光作用20 min；加中止液；加中止液50l/孔终止反应，孔终止反应，测定每孔测定每孔OD450/630nm值。值。4、数据处理：以标准品浓度的

31、对数、数据处理：以标准品浓度的对数log(c)对吸光值对吸光值 log(y)回归，回归，可求得样品中人胰岛素原的残留量可求得样品中人胰岛素原的残留量。41酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用 Standard curve for rhPI in PBS was determined by the immunocapture assay(n=5).42酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用思考题思考题1.1.抗原与抗体的属性，抗原与抗体反应的特点以及衡抗原与抗体的属性，抗原与抗体反应的特点以及衡量抗体质量的指标？量抗体质量的指标？2.2.酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）的基本原理及技术要）的基本原理及技术要点、主要方法类型及其反应原理和适用范围点、主要方法类型及其反应原理和适用范围?3.3.过碘酸盐氧化法与戊二醛偶联法制备酶偶联物的原过碘酸盐氧化法与戊二醛偶联法制备酶偶联物的原理及各自优缺点理及各自优缺点?4.4.试述宿主蛋白（试述宿主蛋白（HCPHCP）残留检测基本指导思想和试）残留检测基本指导思想和试验原理？验原理？43酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用