脊灰病毒实验室监测课件.ppt

1、脊灰病毒实验室监测脊灰病毒病原学特征属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属。病毒为直径30nm的小圆球型颗粒，无包膜。有三个血清型，为I型、II型和III型，每个型别的脊灰都可致病。各型之间缺少交叉保护作用，三个血清型相对稳定，分别可用对应型的免疫血清做中和试验定型。相对耐热、耐酸，也能抵抗许多普通的清洁剂和消毒剂，但在干燥、紫外线、高热、甲醛和游离氯作用下很易灭活。病毒在4下能存活数周，常温下能存活几天，-70可存活数年。脊灰病毒的传播主要通过粪-口途径传播，近99%为隐性感染，但脊灰病毒通常持续2-4周随着感染者的粪便排出体外，而且可在外环境中存活较长时间。人是脊灰病毒的唯一天然宿主。由于OPV常

2、规免疫，疫苗相似株病例可在全国免疫日期间聚集发生。脊灰病毒的致病性主要侵犯人体脊髓灰质前角的灰、白质部分，对灰质造成永久损害，使这些神经支配的肌肉无力，出现肢体弛缓性麻痹。好发婴幼儿，故又称小儿麻痹症。本病可防难治，一旦引起肢体麻痹易成为终生残疾，甚至危及生命。中国在2000年通过了世界卫生组织西太区的无脊灰认证。河南省在1992年4月19日，发现最后一例脊髓灰质炎野病毒病例。实验室检测的重要性 实验室在确保达到消灭脊灰中的作用是至关重要的。除了脊灰病毒以外，还有其它因素也能引起急性弛缓性麻痹，因此所有疑似病例的标本都必须经过病毒学检测。因为只有0.1%1%的感染者会出现临床症状，所以从每例确

3、诊的AFP病例中采集到的粪便标本都必须按规定的程序进行认真检测，以防漏检脊灰野病毒，漏掉1例就意味着漏掉1000例脊灰病毒感染者。实验室检测内容实验室检测内容细胞培养脊灰病毒便标本的接收和处理及分离脊灰病毒定型的中和试验细胞培养细胞培养两种细胞系 细胞培养需要的试剂和材料细胞培养的操作方法两种细胞1L20B细胞，来源于转基因小鼠肺细胞，通过基因工程体外表达的方法使其表达人脊髓灰质炎病毒受体。该细胞对脊髓灰质炎病毒敏感，感染后产生特征性的肠道病毒致细胞病变（CPE）。2RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤，该细胞对脊灰病毒、许多ECHO病毒和一些其它肠道病毒高度敏感，感染后产生特征性的肠道病毒CPE。注

4、意如果RD细胞出现阳性结果而14天后L20B细胞仍然阴性，要在L20B细胞上续种一代，并且再观察7天以排除脊灰病毒存在的可能性。除了肠道病毒外，含有一些其他病毒的粪便标本接种到L20B细胞上也会产生CPE（例如呼肠孤病毒和腺病毒）此时需如实记录CPE。一些非脊灰肠道病毒可以在肺细胞上产生CPE，因此也可以在L20B细胞上产生(但这些病毒产生的CPE通常与脊灰病毒产生的CPE明显不同）。这些标本也应该进行脊灰病毒定型实验以排除这些标本含有脊灰病毒的可能性。L20B negativeRD-A negative细胞培养细胞培养两种细胞系 细胞培养需要的试剂和材料细胞培养的操作方法试剂和材料生长液不含

5、钙离子和镁离子的PBS.PBS(-)长成单层的 RD 或 L20B 细胞胰蛋白酶/EDTA PBS(-)稀释的 0.1%w/v 台盼兰细胞计数板和盖玻片细胞培养管和细胞培养瓶吸管&吸尖细胞培养细胞培养两种细胞系 细胞培养需要的试剂和材料细胞培养的操作方法操作方法检查细胞的质量用 PBS(-)洗两次用胰蛋白酶/EDTA消化细胞在 36培养箱孵育 5 分钟用生长液悬浮细胞并且计数计算 传代至新的培养瓶 有关粪便标本注意事项采集时间和采集份数保存条件运输条件个案调查表的填写采集时间和采集份数麻痹14天内采集双份粪便标本，两份标本采集时间间隔24-48小时。采集的粪便每份至少5-10克。样品容器最好使

6、用省级统一下发的采便盒，粪便盒上注明样品信息。有关粪便标本注意事项采集时间和采集份数保存条件运输条件个案调查表的填写保存条件粪便标本采集后短时间可以4C保存（冷藏包），长时间需要-20C保存（冰箱/冰柜）。有关粪便标本注意事项采集时间和采集份数保存条件运输条件个案调查表的填写运输条件粪便标本应有专业技术人员送往省级实验室。粪便标本应放置在冷藏包/冷藏箱，要有足够的冰块保证储存温度。尽量在工作时间把样品送至省级实验室。有关粪便标本注意事项采集时间和采集份数保存条件运输条件个案调查表的填写个案调查表和送检表样品送往省级实验室同时要求附有个案调查表和送检表调查表信息确保真实完整脊灰病毒便标本的处理脊

7、灰病毒便标本的处理粪便标本的处理必须在Class II生物安全柜(BSC)中进行。2022-10-16National Laboratory for Poliomyelitis262022-10-16National Laboratory for Poliomyelitis26脊灰病毒分离检测流程脊灰病毒分离检测流程接种 L20B&RDL20B+L20B&RD+脊灰病毒血清型鉴定L20B,RD-报告阴性RD分离物转种到 L20B细胞上型内鉴定粪便标本L20B 报告 NPEVCytopathic effect on L20B and RD cellsCytopathic effect on L2

8、0B and RD cells 除了肠道病毒外，含有一些其他病毒的粪便标本接种到L20B细胞上也会产生CPE（例如呼肠孤病毒和腺病毒）此时需如实记录CPE。一些非脊灰肠道病毒可以在肺细胞上产生CPE，因此也可以在L20B细胞上产生(但这些病毒产生的CPE通常与脊灰病毒产生的CPE明显不同）。这些标本也应该进行脊灰病毒定型实验以排除这些标本含有脊灰病毒的可能性。非脊灰病毒病变照片L20B非脊灰病毒病变照片RD-A脊灰病毒定型的中和试验 原 理 血清/病毒混合物在36孵育2小时使得抗体与病毒结合。然后，将细胞悬液加入到微孔板中，逐日观察CPE。能够阻止产生CPE的抗血清意味着可以识别病毒。脊灰实验

9、室认证合格标准实验结果28天内报告及时率80。每年至少检测150份标本。脊灰病毒分离株与地区参比实验室检测结果一致率90。AFP脊灰病毒分离株7天内送出进行型内鉴别及时率80。最近一次WHO认可的职能考核（PT）成绩不低于80分。至少每季度进行一次内部质量控制。历年标本检测情况疫苗衍生脊灰病毒疫苗衍生脊灰病毒(VDPVs)与原始Sabin株比，VP1区序列同源性小于99%，这种基因突变表明经过了长期的复制。（每年1%-2%的核苷酸发生变异）疫苗衍生脊灰病毒疫苗衍生脊灰病毒(VDPVs)VDPVs还可以分为3类：niVDPVsw分离于患有免疫缺损的慢性排毒者；w如果发生重组的话,经常与其它Sabin株病毒基因组发生重组；w非常少见;w与 OPV免疫覆盖率无关。ncVDPVsw引起循环的VDPVsw通常发现于OPV免疫覆盖率比较低的地区w许多报导称，其经常与C组肠道病毒发生重组w正在循环的脊灰病毒都将和同种的肠道病毒重组n其它VDPV 单一的从无免疫缺损者中分离到的毒株或从环境中分离 到,无证据在人群中广泛循环.VDPVs与脊灰野病毒很类似的特性能够导致人与人之间的传播；感染后，有很高的残留麻痹率；减毒的关键位点回复突变或由于重组而失掉；在转基因小鼠模型中表现出很高的神经毒力；抗原特性表现为“非疫苗类似株”；在时可以复制；在循环时易与NPEVs 发生重组