第二十三章重组和转座课件.ppt

1、第二十三章第二十三章 重组和转座重组和转座（1）同源重组同源重组(homologous recombination)或 普遍性重组普遍性重组（generalized recombination）A.交互重组交互重组 B.单向重组单向重组（2）位点特异性重组位点特异性重组(site-specific recombination)（3）转座重组转座重组（4）模板选择模板选择（copy choce）（5）特殊重组特殊重组。（6）同源特异重组同源特异重组 表 23-2 各种重组的类型 类型 事件 同源性 蛋白和酶 特异位点 重组机制 行为和结果 复制 真核 减数分裂 完全同源 内切酶、外切酶 Holl

2、iday 模型和Meselson-Radding 模型 交互交换 修复性复制 转化 完全同源 RecA,B,C,D 单向取代 修复性复制 接合 完全同源 RuvABC 单向取代 修复性复制 同 源重组 原核 广泛性 转导 完全同源 DNAPol Chi位 点（8bp）Holliday 模型 单向取代 修复性复制 IS-两端有 IR，只编码转座酶类转座因子-结构同 IS，但不能独立存在，仅作为复合转座子的两端组件复合转座子-两端由 IS 或类 IS 构成，可编码抗抗菌素物质原核TnA 转座子家族-两端为 IR，可编码转座酶、解离酶和抗性物质AC-Ds-植物（玉米）中的激活-解离因子转座子P 因子

3、-果蝇中父本因子，在 MP中导致杂种不育反转录病毒、RNA DNA整合宿主靶 DNATyCopia病毒超家族LINSL1（1）有长末端重复序列（2）编码反转录酶或整合酶（3）可含内含子SINSB1/Alu（1）无重复序列（2）不编码转座子产物（3）无内含子转座因子真核反转录转座子非病毒超家族假基因整合区域同源Int,IHFattp 核心酶（15bp）交错切割连接 Holliday连接整合无复制沙门氏菌相转变区域同源Hin倒位无复制Mu 的 G 片段倒位区域同源Gin倒位无复制P1 的 C 片段倒位区域同源Cin和tnpR同源IR(34bp)和 Tn3 解离相似倒位无复制转座子之间或两端DR、I

4、R 重组区域同源DR,IRDR 切离 和 缺失IR 倒位无复制位点特异重组反转录病毒整合区域同源整合酶靶整 合 酶 在LTR 的 3端 产 生 2b缺口在靶上交错切割连接填补缺口整合修复性复制同 源 特异重组酵 母 交 配型转变完 全同源Rid 52,HO特 异Y/Z交界交 错 切 割、配对、降解修复产生 Chi 结构单向取代修 复 性复制复制型无转座酶单向插入修 复 性复制非复制型无解离酶单向插入修 复 性复制保守型无DNA Pol转座子两端 IR及 靶 的 交 错 切割、连接、修复性复制和解离单向插入修 复 性复制转座重组I 类内含子归巢无内 切 酶、外 切酶、DNA Pol、连接酶、解离

5、酶靶仅靶位点的交错切割与重组修复相似单向插入修 复 性复制反 转 录 转座子反转录酶、内切酶靶单向插入修 复 性复制模板转换 类 内 含子归巢反转录酶、内切酶靶RNA 介导模 板转换、交错切割单向插入修 复 性复制特殊重组免 疫 球 蛋白 的 VJC连接区 域同源RAG 1,2特 异 位 点（编码端）平切切单链形成 3凸端补平加入碱基剪切体细胞重组修 复 性复制第一节第一节 重组机制重组机制 u一一.交叉理论交叉理论（chiasmatatype hypothesis）u 1909年Janssens并提出了交叉型理论u二二.断裂和重接模型断裂和重接模型 1937年Darlington提出u三.模

6、板选择学说（copy choice）u Belling J.首先提出的，1933年他又撤回了 这一假设。u四.1948年Hershey提出模板选择学说 1 2.断裂重接模型 3.4.1 2.模板选择复制 模型 3.4.图 23-3 断裂重接模型和模板选择复制模型的比较 断裂重接模型和模板选择复制模型的否定断裂重接模型不能解释基因转变和极化子现象模板选择复制模型存在的问题：(1)违背了半保留复制；(2)DNA复制应在S期，重组应在偶线期，不应同时发生。(3)不能解释3线和4线交换。否定模板选择复制模型的试验 c mi 轻亲代 +重亲代 c +图 23-4 轻、重标记噬菌体的重组实验 第二节第二节

7、 Holliday 模型模型u1930年Winkler把真菌中不规则分离现象解释为基因基因转变转变（conversion）uLindegren,C.C（1949）报道了酵母有规律的异离常分离现象：交配型Aa的杂交中，有些子囊所含的孢子为（3A+1a），也称为基因转变。u50年代中期Mitchell,M.B.异常分离不是由于整个染色体的异常行为，而是由于特定位点的“基因转变”所致，即属于基因内重组。uOlive,E1-Ani和Kitani等在粪壳菌（Sodaria fimicola）中也发现了异常分离。认为这种异常分离是有丝分裂的产物，称为减数后分离减数后分离（postmeiotic segre

8、ation）A g+A g+a g+A g+全部校正 4:4 a g+6:2 a g 正常分离 正常分离 a g A g+未校正 A g+A g+a g A g+a g 部分 a g+校正 a g a g+a g+5:3 A g+A g+异常 a g+4:4 分离 A g+异常分离 A g A g a g a g A g a g a g a g 图 23-7 基因转变和减数后分离u极化子极化子（polaron）同一基因内部的各个突变位点的转变频率常从基因的一端向另一端逐步递减，具有这种现象的一段DNA称为，一个极化子相当于一个基因（Rizet等1961）。u基因重组的模型都必须解释异源双链的形

9、成以及基因转变往往伴随着两侧基因重组这一现象。1964年美国学者Robin Holliday提出了著名的Holiday模型模型（图23-8）u极化子极化子是由于交换产生的错配只发生在异源双链部分，而此部分只发生在Hollidy 结构的断裂和分枝点之间，离断裂点越远的基因座位离分枝点可能越远，而不在异源双链的部分。(1)5 A B 3 (8)A 3 5 B3 55 a b 3 两臂旋转 联会 (2)5 A B 3 b 3 5 a3 55 a b 3 (9)A 酶切 B (3)5 A B 33 5 b 3 5 a5 a b 3 游离端移动联会 (4)5 A B 3 (10)A A 3 5 B B

10、3 55 a b 3 游离端交叉连接 b b(5)5 A B 3 a a3 53 5 (11)A B A b5 a b 3 形成单链交叉 a b a B(6)5 A B 33 5 3 5 A B A b 5 a b 3 分支点移动(7)A a b a B B a b 图 238 Holiday 重组模型。第三节 双链断裂起始重组联会复合体酵母中重组的分子事件和细胞学事件的相关性双链断裂 消失特异位点 出现分子连接 持续分子重组轴向分子 形成SC解离SC形成细线期偶线期粗线期双线期双链断裂模型Spo11共价连接到双链断裂的5端第四节 重组和酶u在原核同源重组中u存在8个碱基组成的Chi位点;uR

11、ecA.B.C.D.参与重组。uRecBCD复合体具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性。在Chi位点产生单链3游离未端.uRecA可促进分枝移动。uRuvA和RuvB可促进异源双链的形成。uRuvC是一种内切酶,可释放重组中间体。RecBCD 结合在双链断裂处 chi B C D 5 3 RecBCD 解链并作为外切酶降解 DNA chi RecBCD 停留在 chi 处，内切酶切开单链 RecD 在 chi 顺序解离 RecBC 继续作为解链酶 图 23-15 RecBCD 核酸酶从一侧接近 chi 顺序，当它前进 时降解 DNA。在 chi 位点它作为内切酶剪切单链，释放 RecD,仅保留

12、了解链酶活性。细菌中重组分子事件的程序(1)由断裂分子产生的单链与非姊妹染色单体的双链相互作用；(2)配对区的延伸；(3)外切酶解离配对的双链。chi 位点5 GCTGGTGG 3 3 CGACCACC 5 在E.coli中每隔约510 kb有一个拷贝，但其它遗传因子中无此拷贝 RecBCD介导的解旋和剪切产生3游离末端，用来起始异源双链的连接。游离单链起始交换 被释放的单链与互补链配对 单链交换完成 图 23-18 RecA 介导部分双链和完整双链之间的链的交换单链取代(single-strand uptake)u可发生在各种形状的DNA分子之间，但要具备3个条件：u(1)其中一个DNA 分

13、子要有单链区；u(2)其中一个DNA 分子要有游离的3末端；u(3)单链区和3末端可和另一DNA分子互补。uRecA可催化单链取代。uRecBCD的活性：(1)强的核酸酶；(2)解旋酶；(3)ATPase。RecBCD 提供带有游离末端的单链区uRceA有两个完全不同类型的活性：u（1）在SOS反应中它能具有蛋白酶活性u（2）能启动DNA单链和与之互补的双链分 子进行碱基配对。u RuvA可识别 Holidy的连接结构u RuvB是ATPase,可发动迁移反应u RecG是解旋酶 u RuvC,它编码内切酶可特异识别Hollidy分枝，它在体外可切这个连接体，解离重组中间体。重组修复的分子机制

14、第五节第五节 位点特异性重组位点特异性重组一在在aat位点的整合位点的整合二倒位重组二倒位重组 沙门氏细菌（沙门氏细菌（Salmonella）的相转变）的相转变 Mu噬菌体噬菌体G片段的倒位片段的倒位三三.酵母交配型转变的同源特异重组酵母交配型转变的同源特异重组(1)需要特殊蛋白需要特殊蛋白H0；(2)需长同源序列；需长同源序列；(3)位点是特异的，仅在位点是特异的，仅在Y区重组；区重组；(4)重组时产生重组时产生Chi结构；结构；(5)H0识别特殊位点并交错切割；识别特殊位点并交错切割；(6)复制过程中涉及修复性复制。复制过程中涉及修复性复制。噬菌体 P O P 包装 感染宿主 P O P

15、B O B Int Int IHF IHF Xis B O P P O B 图 23-21噬菌体的整合和切离 第六节第六节 原核生物的转座因子原核生物的转座因子 1951年McClintock提出转座（Transposition）和跳跃基因(jumping gene)的新概念(1)原核生物中的转座因子的发现和检出：1 9 6 7 年 S h a p i r o 才 在 E.c o l i 中 发 现 了 转 座 因 子（transposable element）。他在半乳糖操纵子(gal K,T,E）中发现了一种极性突变。它有以下的特点：(1)能回复突变；(2)用诱变剂对其处理并不能提高回复突

16、变率;他们想到galE-的突变可能也是部分DNA的插入（突变）和切离（回复突变）所致。证实转座因子的实验：(1)密度梯度离心实验 (2)分子杂交实验 dgl+/dglm杂合双链DNA的电镜照片。出现了棒糖状结构二原核转座因子的类型二原核转座因子的类型 (一一)插入序列插入序列(IS)(二二)类插入序列（类插入序列（IS-like elements）(三三)复合转座子。复合转座子。(四四)TnA家族家族 表 23-4 IS 的结构和功能DR(bp)IR(bp)中心区域(bp)靶的选择拷贝数IS 1923768随机58IS25411327热点5(在 F因子上为1)IS41113181428AAN2

17、0TTT1 或 2IS54161195热点？IS10R9221329NGCTNAGCNIS50R991531热点IS9039181057随机 表 23-5 复合转座子的结构和功能转 座因子长 度(bp)遗 传标记末 端 组件方向二组件的关系组件的功能Tn9033100KanRIS903反向相同二者皆有功能Tn92500CamRIS 1正向推测相同预计有功能Tn109300TetRIS 10R有功能IS 10L反向有 2.5%的差异无功能Tn55700KanRIS 50R有功能IS 50L反向1 bp 的改变无功能 IS 组件相同，方向相反 camR ISL ISR IS 组件 IS 组件 中的

18、 IR 中的 IR 图 23-31 复合转座子结构的(Tn9)转录单位 IR res IR tnpA tnpR ampR 38 3066 19 558 861 38tnpA GUA AUG tnpR -58 0 +105 mRNA mRNA 图 23-34 TnA 的结构和转录 三转座机制三转座机制类型 (1)复制型转座复制型转座 （replicative transposition）(2)非复制型转座非复制型转座 （nonreplicative transposition）(3)保守转座保守转座 （conservative tranposition）abc复制起点靶位点aabbdddddaabbcccc剪切转座子末端和靶位点并将被切的末端连接到靶位点形成转移复合体，以此起始转座Mu噬菌体的转座酶(MuA)使Mu的末端联会并反式剪切其末端DNA，然后和靶位点DNA反式连接 Tn 从 3 末端复制 产生共合体 靶 单链交错切割 共合体 重组 转座子被切开的 末端和靶被切开 的末端连接 交叉结构(单链转移复合 图 2341 转座模型。Mu 转座产生交换结构，此结构通过复制产生共合体，共合体中的转座子之间发生交换产生 2 个重组子。四转座的四转座的共同中间体共同中间体 五转座的五转座的机制机制 夏皮罗模型