毒代动力学在新药临床前安全性评价中的应用课件.ppt

1、2022年10月20日星期四0毛煜毛煜 毒代动力学在新毒代动力学在新药临床前安全性评价中药临床前安全性评价中的应用的应用勇于开始，才能找到成功的路Non-clinical safety evaluation 急性毒性试验(acute toxicity)长期毒性试验(chronic toxicity)特殊毒性试验(genotoxicity、reproductive、carcinogenicity)其他毒性(Allergic、stimulate、hemolysis)TGN1412试药人注射新药后出现严重过敏反应Extrapolation？Species different in ADME at t

2、oxicity doseAbsorptionDistributionMetabolismExcretiontoxicokineticsDoseToxicity一、什么是毒代动力学？（概述）二、毒代动力学的试验设计三、伴随毒性试验的不同领域的毒代动力学四、TK研究的具体实例一、什么是毒代动力学？（概述）伴随（concomitant）毒代动力学Toxicokinetics=Toxikon+kinesis毒代动力学（毒代动力学（Toxicokinetics）的定义）的定义 毒代动力学是药代动力学在全身暴露评价中的延伸，为毒代动力学是药代动力学在全身暴露评价中的延伸，为非临床毒性研究的一个组成部分，或

3、为某一特殊设计的补充非临床毒性研究的一个组成部分，或为某一特殊设计的补充研究。研究结果可用于阐明毒理学发现及其与临床安全性的研究。研究结果可用于阐明毒理学发现及其与临床安全性的关系。关系。ICH Topic S 3 Toxicokinetics:A Guidance for Assessing Systemic Exposure in Toxicology Studies有关毒代动力学的指导性文件有关毒代动力学的指导性文件International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of

4、 Pharmaceuticals for Human Use我国我国SFDA（国家食品药品监督管理局药品评审中心）（国家食品药品监督管理局药品评审中心）有关毒代动力学的指导性文件有关毒代动力学的指导性文件研 究 目 的 描述在动物上造成的全身暴露全身暴露；暴露水平与毒理学结果暴露水平与毒理学结果之间的关系；支持动物种属、给药方案的选择；评价动物结果与临床安全性的相关性临床安全性的相关性药物药物系统循环中系统循环中的药物浓度的药物浓度吸收吸收药物在组织药物在组织中的分布中的分布作用部位的作用部位的药物浓度药物浓度药物的代谢药物的代谢或排泄或排泄分布分布消除消除药理活性药理活性临床疗效临床疗效药药

5、效效毒毒性性药物代谢动力学的研究药物代谢动力学的研究Pharmacokinetics Toxicokinetics Different goals PK-ADME properties TK-safety assessment Different dose1.1.药物溶解性：由于毒代动力学研究时采用的高给药药物溶解性：由于毒代动力学研究时采用的高给药剂量所导致的给药问题，更严重的情况：动物体液剂量所导致的给药问题，更严重的情况：动物体液或组织器官产生药物沉淀所导致的特殊毒性。或组织器官产生药物沉淀所导致的特殊毒性。药物稳定性：高剂量所导致的药物稳定性的改变以药物稳定性：高剂量所导致的药物稳定性

6、的改变以及可能的降解等问题。及可能的降解等问题。药物吸收：药物吸收在毒代动力学研究中的高剂量药物吸收：药物吸收在毒代动力学研究中的高剂量给药下可能出现药物在胃肠道的溶解度下降而影响给药下可能出现药物在胃肠道的溶解度下降而影响药物的吸收。药物的吸收。首过效应或系统前清除：机体的系统前清除是酶依首过效应或系统前清除：机体的系统前清除是酶依赖性的过程，因此，在高剂量下会出现饱和。赖性的过程，因此，在高剂量下会出现饱和。技术层面上的问题：4.4.血浆蛋白结合率：药物与血浆蛋白的结合是可逆的，血浆蛋白结合率：药物与血浆蛋白的结合是可逆的，且有饱和性，因此，在毒性剂量下，药物的分布和组且有饱和性，因此，在

7、毒性剂量下，药物的分布和组织通透性会受到影响，产生不同于药代剂量下的血浆织通透性会受到影响，产生不同于药代剂量下的血浆浓度浓度-药效相关性的情况。药效相关性的情况。代谢：由于代谢是依赖酶的反应，它与底物的浓度相代谢：由于代谢是依赖酶的反应，它与底物的浓度相关。因此，在毒性剂量下，药物的体内代谢途径和代关。因此，在毒性剂量下，药物的体内代谢途径和代谢活性可能发生改变。谢活性可能发生改变。肾清除：肾清除既有饱和又有非饱和的作用机制的参肾清除：肾清除既有饱和又有非饱和的作用机制的参与，且受循环药物浓度的影响大，毒性剂量可能影响与，且受循环药物浓度的影响大，毒性剂量可能影响肾脏清除药物的能力，特别是仅

8、从肾脏排泄，且有主肾脏清除药物的能力，特别是仅从肾脏排泄，且有主动排泄机制的药物。动排泄机制的药物。TK须遵循须遵循GLP原则原则在开展毒代动力学研究时应遵循以下原则：在开展毒代动力学研究时应遵循以下原则：遵照遵照GLPGLP的要求开展毒代动力学研究的要求开展毒代动力学研究 所用的分析方法可靠所用的分析方法可靠 实验设计合理实验设计合理 应结合毒理学和药动学研究结果对毒代动力学研究结应结合毒理学和药动学研究结果对毒代动力学研究结果进行综合分析和评价，同时应注意具体问题具体分析果进行综合分析和评价，同时应注意具体问题具体分析毒代动力学研究规范 实验要求在GLP规范下进行受试物给药样品样品处理LC

9、-MS/MS分析二、毒代动力学的试验设计要点1.分析方法 药物浓度测定方法的技术要求与药代动力学研究相同(专属性好灵敏度高专属性好灵敏度高)Method validationRobust and reliable methodReproducibilityAccuracySpecificitySensitivitySpecificitySensitivityAccuracySpecificitySensitivityReproducibilityAccuracySensitivityReproducibilityAccuracySpecificitySensitivityReproducibi

10、lityAccuracy 气相色谱法（不常用，用于挥发性好、耐热的化合物检测）气相色谱法（不常用，用于挥发性好、耐热的化合物检测）高效液相色谱法（连接紫外或荧光检测器，具有经济、简单高效液相色谱法（连接紫外或荧光检测器，具有经济、简单的特点，但专属性较差）的特点，但专属性较差）液相液相-单级质谱联用检测单级质谱联用检测 液相液相-串联质谱联用检测（灵敏度高，特异性好，能同时获得串联质谱联用检测（灵敏度高，特异性好，能同时获得可靠的定性定量结果）可靠的定性定量结果）毛细管电泳法（适用于蛋白质等的定量分析）毛细管电泳法（适用于蛋白质等的定量分析）毒代生物样品的分析方法毒代生物样品的分析方法 毒代动

11、力学与药代动力学一样，要求建立灵敏度高、特异毒代动力学与药代动力学一样，要求建立灵敏度高、特异性好的血药浓度测定方法，测定方法的建立和确证应按照药代性好的血药浓度测定方法，测定方法的建立和确证应按照药代动力学有关技术要求进行。动力学有关技术要求进行。方法学验证方法学验证稳定性（稳定性（stability）考察）考察 了解待测药物和内标物在不同了解待测药物和内标物在不同pHpH、光照、溶剂、温、光照、溶剂、温度条件下稳定性。度条件下稳定性。生物样品中药物的稳定性包括室温、冷藏（生物样品中药物的稳定性包括室温、冷藏（2 288）、冻融、冷冻（）、冻融、冷冻（-20-20-70-70）、进样盘中放置

12、）、进样盘中放置的考察，可参考药代动力学的实验结果。的考察，可参考药代动力学的实验结果。灵敏度：最低定量下限（灵敏度：最低定量下限（LLOQ）应满足日内准确度和精密度应满足日内准确度和精密度20%20%。根据药物体内药物浓度确定根据药物体内药物浓度确定,一般为一般为3 35 5个半衰期个半衰期或或 峰浓度的峰浓度的1/101/101/201/20。生物样品基质干扰（生物样品基质干扰（matrix effect）的考察）的考察 应考察生物样品基质对待测物检测的干扰程度。如应考察生物样品基质对待测物检测的干扰程度。如全血、血浆或血清等常用生物样品的内源性干扰。全血、血浆或血清等常用生物样品的内源性

13、干扰。选择性（选择性（selectivity）的考察）的考察 内源性物质、药物的代谢物、可能的合并用药及中内源性物质、药物的代谢物、可能的合并用药及中药药 中其他组分不干扰分析。中其他组分不干扰分析。提供对照品、空白生物样品、空白生物样品加对照提供对照品、空白生物样品、空白生物样品加对照品品 及用药后的生物样品色谱图。及用药后的生物样品色谱图。A 空白血浆样品空白血浆样品B 空白血浆样品中加入内标化合物空白血浆样品中加入内标化合物C 空白血浆样品中添加标准品空白血浆样品中添加标准品D 毒代血浆样品毒代血浆样品标准曲线（标准曲线（standard curve）及线性关系）及线性关系 应分别制备药

14、物在不同生物样品（如血浆、全血、应分别制备药物在不同生物样品（如血浆、全血、尿、组织匀浆）中的标准曲线。尿、组织匀浆）中的标准曲线。每条标准曲线一般需每条标准曲线一般需6 67 7个浓度点，每个浓度点个浓度点，每个浓度点2 23 3 个平行样。个平行样。线性范围应覆盖整个生物样品的浓度范围，浓度超线性范围应覆盖整个生物样品的浓度范围，浓度超 过最高检测上限（过最高检测上限（ULOQULOQ）的样品应进行适当的稀释。）的样品应进行适当的稀释。标准曲线的相关系数应大于标准曲线的相关系数应大于0.990.99。y=0.0076+0.0109X,r=0.9999,n=7(duplicate for e

15、ach point),weighing factor:1/xLC-02 concentration in plasma,ng/mLPeak area ratio方法精密度与准确度方法精密度与准确度 精密度包括日内精密度和日间精密度，一般要求应精密度包括日内精密度和日间精密度，一般要求应选取工作曲线低、中、高三个浓度进行考察，每个选取工作曲线低、中、高三个浓度进行考察，每个浓度需浓度需45个平行样。日内和日间的精密度应满足个平行样。日内和日间的精密度应满足相对标准误（相对标准误（relative standard deviation，RSD%）15%,在在LLOQ浓度点附近应满足浓度点附近应满足

16、RSD%20%.准确度一般用相对回收率（准确度一般用相对回收率（recovery，%）表示，选）表示，选取低、中、高三个浓度点进行考察，每个浓度需取低、中、高三个浓度点进行考察，每个浓度需45个平行样。日内和日间的准确度应满足个平行样。日内和日间的准确度应满足15%,在在LLOQ浓度点附近应满足浓度点附近应满足20%.样品稀释倍数（样品稀释倍数（dilution factor）的准确度考察）的准确度考察 超出标准曲线浓度范围的生物样品须经稀释后重超出标准曲线浓度范围的生物样品须经稀释后重新进样分析。样品稀释的倍数需经过验证后方能应用。新进样分析。样品稀释的倍数需经过验证后方能应用。进样残留（进

17、样残留（carryover）的考察）的考察 在分析完标准曲线最高检测上限在分析完标准曲线最高检测上限（ULOQ）样品后样品后立即设定运行一个空白样品来考察方法的进样残留。立即设定运行一个空白样品来考察方法的进样残留。进样残留应尽可能小。进样残留应尽可能小。2、TK 研究的参数 药时曲线下面积 AUC(area under concentration-time curve)吸收程度，暴露吸收程度，暴露 Cmax（血药达峰浓度）Tmax（达峰时间）吸收速度，暴露吸收速度，暴露 t1/2 （血浆消除半衰期）吸收速度不同-毒性不同血血药药浓浓度度最小中毒浓度最小中毒浓度(MTL)最小有效浓度最小有效浓

18、度(MEL)时间时间 其他参数F:BioavailabilityCss：Cl:Vd:时间血药浓度AUC非静脉 AUC静脉 毒代动力学研究的评价毒代动力学研究的评价蓄积：蓄积：化学物或化学物或/和代谢产物在体内进行性增加。蓄积受给药时和代谢产物在体内进行性增加。蓄积受给药时间间隔和该化学物半衰期的影响。间间隔和该化学物半衰期的影响。线性动力学（线性动力学（linear pharmacokinetics）：药物在体内的转运和：药物在体内的转运和消除速率常数呈现为剂量或浓度非依赖性，表现为血药浓度或消除速率常数呈现为剂量或浓度非依赖性，表现为血药浓度或血药浓度血药浓度-时间曲线下面积与剂量呈正比。时

19、间曲线下面积与剂量呈正比。非线性动力学（非线性动力学（linear pharmacokinetics）：由于药物代谢和肾：由于药物代谢和肾排泄所涉及的酶和载体具有可饱和性，药物在体内的转运和消排泄所涉及的酶和载体具有可饱和性，药物在体内的转运和消除速率常数呈现为剂量或浓度依赖性，此时药物的消除呈现非除速率常数呈现为剂量或浓度依赖性，此时药物的消除呈现非一级过程，药物半衰期、清除率等不为常数，一级过程，药物半衰期、清除率等不为常数，AUCAUC、C Cmaxmax等不与等不与剂量成正比变化。剂量成正比变化。3 3、动物、动物 避免单独的毒代研究 动物种属的选择Case study-动物选择不当5

20、6种属代谢差异的考虑Compound D M1M2(active)Enzyme1Enzyme2 毒代动力学研究中药物代谢产物的测定毒代动力学研究中药物代谢产物的测定 当药物为前药，体内产生药效的是其代谢产物。当药物为前药，体内产生药效的是其代谢产物。当药物在体内转化成具有药效或毒性的代谢产物。当药物在体内转化成具有药效或毒性的代谢产物。当药物在体内被广泛代谢，在血浆或组织中只能通过测当药物在体内被广泛代谢，在血浆或组织中只能通过测定其代谢产物来反映给药后体内的暴露水平。定其代谢产物来反映给药后体内的暴露水平。4、给药剂量的设计低剂量低剂量：无毒性反应剂量,应超过药效学剂量下的暴露量。中剂量中剂

21、量：低剂量暴露的合适倍数和高剂量暴露的合适分数。高剂量高剂量：主要通过毒性反应来判断,如吸收饱和则不再增加剂量。Dose(毒性剂量)-Exposure(剂量暴露)关系Lack of dose-AUC proportionality-剂量设计Transporters 对药物ADME的影响uptakeexcretioneffluxexcretionreabsorptionabsorption肝肝肾肾胃肠道胃肠道5、给药方案 Antiviral agent:3 equally divide dose（tid）1 dose（qd）1-month study in monkey三、伴随毒性试验的不同领域

22、的毒代动力学主要毒性试验内容 急性毒性试验 长期毒性试验 遗传毒性试验 生殖毒性试验 致癌试验 组织分布试验不同领域毒代动力学（1）急性毒性试验 毒性研究早期进行 由暴露速度和暴露程度预测毒性 提供长期毒性实验方案设计的依据 剂型不同领域毒代动力学（2）长期毒性实验 动物选择符合药效要求 多剂量设计 毒性研究与毒代研究同步设计并实施 第一天暴露量与最后一次暴露量的比较 稳态浓度与AUC长期给药后AUC的变化-降低010203040AUC540200剂量（mg/kg）第1天010203040AUC540200剂量（mg/kg）第1天第30天长期给药后AUC的变化-降低010203040AUC54

23、0200剂量（mg/kg）第1天第30天第90天u Induction of CYP enzyme u Transporters长期给药后AUC的变化-降低长期给药后AUC的变化-升高uLong half-lifeuInhibition of CYPuTransporter不同领域毒代动力学（3）组织分布实验 （ICH原则）单剂量分布实验为临床前药物安全评价的基础实验 多剂量分布实验必要 器官组织蓄积 稳态浓度高 靶器官毒性明显或特异分布 开发靶向释放药物example Bumetanide(高效利尿药）20mg/kg(rat):ineffective 0.015mg/kg(human):pr

24、oducing diuresis 3%of drug excreted in urine for rat,66%in urine for human 不同领域毒代动力学（5）遗传毒性的毒代研究 遗传毒性阴性的药物 测定组织浓度 测定骨髓浓度 测定血药浓度不同领域毒代动力学（6）生殖毒性中的 毒代研究 注意动物在妊娠期和授乳期与正常动物的差异 重点研究胚胎毒性和对子代的影响 采集母体、胎子和新生子，测定浓度和暴露量不同领域毒代动力学（7）致癌实验中的 毒代研究 用药3 个月的药物必须进行致癌实验 （JAPAN）用药6 个月的药物必须进行致癌实验（USA，EEC，ICH）不同领域毒代动力学（9）生

25、物技术药物的 毒代研究 一般化学药物的毒代研究程序不适用与生物技术药物 免疫的介入影响药代和毒代过程 动物选择应考虑免疫的介入 放射性标记物对结果的误导Exposure and Dosage ratiosRatDogReproductive ToxicologyNOAEL(mg/kg/day)100mg/kg/day50 mg/kg/day30 mg/kg/dayExposure ratio(AUC animals/AUC humans)*1.11.50.3Dosage ratio*(mg/m2)4.16.81.2Dosage ratio*(mg/kg)2012.57.5*Human dose

26、 of 200 mg;AUC 10.2 gh/mL 剂量比值 AUC比值 MTD人/LD10小鼠 MTD人/LD10小鼠 阿扎胞苷 6.0 1.1阿霉素 5.0 0.8安丫啶 0.8 1.3塞替派 0.4 1.0顺铂 2.2 1.3氟达拉宾 0.1 0.1双氢阿扎胞苷 0.2 0.3example Antipsoriatic agent Two formulations:0.1%,1%cream 10-fold margin of safety 0.1%cream:141 ng eq.hr/ml 33%absorption 1%cream:838 ng eq.hr/ml 19%absorpti

27、on 0.1%cream,5g/day 四、四、TK的应用实例的应用实例种属间异速增长尺度律种属间异速增长尺度律Species Allometric Scaling具体实例具体实例Almost too good to be true mouse-to-elephant 曲线 Max Kleiber(1932).Body size and metabolism.Hilgardia 6:315351.1、TK支持临床支持临床I期剂量选择期剂量选择具体实例具体实例Anti-viral compound：AZT5mg/kg/day:810%increase of RBC,AUC:6g.hr/ml to

28、x-endpointEquations:AUC(monkey)=F(m)D(m)/CL(m)AUC(human)=F(h)D(h)/CL(h)Allometry approachActual exposure in human Dose(huamn)=5mg/kg0.3L/hr/kg/0.9L/hr/kg=1.7mg/kg/day2.Sophocarpine（SC）的）的Beagle犬毒代动力学研究犬毒代动力学研究LC-MS/MS法定量分析法定量分析SC（内标法）（内标法）具体实例具体实例LC-MS/MS色谱图色谱图标准品标准品空白犬血浆空白犬血浆空白犬血浆空白犬血浆添加标准品添加标准品毒代血

29、毒代血浆样品浆样品血浆样品前处理血浆样品前处理-不同提取不同提取溶剂提取效率的比较溶剂提取效率的比较Liquid-liquid extraction具体实例具体实例基质效应的考察基质效应的考察92.8%94.4%84.8%87.9%1.考察了不同提取溶剂考察了不同提取溶剂对基质效应的影响。对基质效应的影响。2.考察了内标化合物对考察了内标化合物对待测化合物受基质影待测化合物受基质影响的随动性。响的随动性。具体实例具体实例稀释倍数的考察稀释倍数的考察准确性和精密度的考察准确性和精密度的考察具体实例具体实例SC毒代研究毒代研究-90天长期毒性试验犬体内暴露情况天长期毒性试验犬体内暴露情况具体实例具

30、体实例SC毒代研究毒代研究-90天长期毒性试验毒代参数天长期毒性试验毒代参数1.采血时间点的频度足以评价采血时间点的频度足以评价SC在犬体内的暴露水平。在犬体内的暴露水平。2.雌雄无明显差别。雌雄无明显差别。3.在考察的剂量范围内呈现线性药动学特征。提示无明显的药物消除的饱和或药在考察的剂量范围内呈现线性药动学特征。提示无明显的药物消除的饱和或药物代谢酶的诱导和抑制现象出现。物代谢酶的诱导和抑制现象出现。具体实例具体实例 3.Toxicokinetics appilication in the development of PNU-101017Toxicokinetics in Drug De

31、velopment:An Overview of ToxicokineticApplication in the Development of PNU-101017,an Anxiolytic DrugCandidate具体实例具体实例several questions were asked What is the mechanism of death?Is the toxicity of PNU-101017 mediated by the drug effects on the central nervous system?Will the target organ exposure,su

32、ch as brain,be more relevant to the toxicity than the systemic circulation?Will the species differences in protein binding lead to the difference in lethal serum concentrations between dogs and rats?Is there marked species difference in sensitivity to the toxic effects in addition to species differe

33、nces in exposure?Comparison of PNU-101017 serum concentration-time profiles in the dog following 40 mg/kg/day oral administration()and continuous iv infusion at a rate of 360 mg/min/kg(21 mg/h/kg)()of PNU-101017.Dog：死亡时血药浓度 7-11gPNU-101017 serum concentrations-time profiles(left)or CSF concentration

34、-time profiles(right)in the dog()and monkey()following a continuous intravenous infusion(n=3).Dogs were infused at 360 mg/min/kg for 2 to 3 hours and monkeys were infused at 310 mg/ml for 4 hours followed by 410 mg/min/kg for 5hserumCSFPNU-101017 Serum,Brain and CSF Concentrations at Lethality in th

35、e Dog and Monkey following Continuous Intravenous Infusion of PNU-101017*Relationship of PNU-101017 CSF/Serum concentrations ratio versus time in Beagle dogs()and Cynomolgus monkeys()following continuous intravenous infusion(n=3).Relationship of Clinical Signs and PNU-101017 Concentrations in Serum

36、and in CSFSteep dose responseSerum concentration-time profiles of PNU-101017()and PNU-172256()in the dog(n=4)following intravenous infusion of a PNU-101017 solution at 360 mg/min/kg for 4 h with supportive respiration via a ventilator using pure oxygen.Blood samples were collected up to 72 h after t

37、he initiation of infusion.Comparison of Pharmacokinetics of PNU-101017 in mdr 1a(-/-)-and mdr 1a(+/+)Mice*Blood Brain BarrierCONCLUSIONS The toxic effects of PNU-101017 developed rapidly,showing a steep dose response curve,which precludes the use of the early clinical signs as premonitory signs in c

38、linical trials to give adequate protection to human subjects.The clinical dose regimen will be greatly limited due to safety issues,which will likely lead to the failure in efficacy.PNU-101017 development was terminated.Although the outcome was negative,the toxicokinetic studies with differing desig

39、n help toxicologist in understanding the mechanism leading to the toxicity.1.TK的局限性动物/人体生理系统很复杂，其内在不一致性可能使结果的推导复杂化：靶点亚型等靶器官浓度高不一定就有毒性；有些药物血液浓度与局部浓度相关性差；2.对ICH S3A中CASE BY CASE 的认识不一定在各类毒理研究中都进行TK，不必要在所有试验中进行TK，具体药物的TK设计要综合考虑；理解：（1）ICH指导原则是针对所有毒理研究的共同考虑；（2）TK的目的是评价毒性剂量下和给药时间过程中的暴露量，如果其他可比毒理研究中已获得了这些数

40、据，不需要每一个毒性试验都做TK，我们可能需要更多考虑不同类型毒性试验TK结果间的可替代性。几个几个需要考虑的需要考虑的问题问题(1)(1)几个需要考虑的问题几个需要考虑的问题(2)(2)3.生物样本的选择 全血、血浆、尿液、组织4.与蛋白结合的问题 游离药物浓度 or 总浓度5.手性药物的问题 外消旋体 or 单一对映体.6.代谢产物/组织浓度测定代谢产物：当代谢产物对药物活性和毒性有重要贡献时（前体药物、主要代谢产物、广泛代谢）时；靶组织浓度：当血药浓度与靶组织反应评价间存在明显不一致时；7.实施面临的困难（研究和审评）TK研究需要投入更多资金、动物和工作量需要专业间的协作需要探讨合理的新药TK研究策略（哪些试验做TK、何时做、具体如何设计）如何把握TK评价的艺术目前没有TK技术指导原则几个几个需要考虑的需要考虑的问题问题(3)(3)毒代动力学是毒代动力学是药物毒性反应的物质基础药物毒性反应的物质基础毒理研究的基本组成部分毒理研究的基本组成部分 提高非临床安全性评价价值的重要手段提高非临床安全性评价价值的重要手段新药风险性评估不可或缺的内容新药风险性评估不可或缺的内容应该具体品种具体分析应该具体品种具体分析 五、结五、结 语语