第八章基因重组与分子生物学技术课件.ppt

1、 一、基因重组技术一、基因重组技术1基因重组技术的概念基因重组技术的概念2基因重组技术基本原理基因重组技术基本原理3基因重组技术与医学的关系基因重组技术与医学的关系二、分子生物学常用技术二、分子生物学常用技术 1.1.核酸分子杂交与探针技术核酸分子杂交与探针技术 2.2.分子印迹技术分子印迹技术 3.3.聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术 4.DNA 4.DNA序列分析技术序列分析技术 重组重组DNA技术又称为技术又称为（genetic engineering）或）或(molecular cloning)。(gene recombination):DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不片段在细胞内

2、、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。复制和表达的功能。(genetic engineering）:采用人工方法将不同来源的采用人工方法将不同来源的DNA进行重进行重组，并将重组后的组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。殖或表达的过程。相关实验：相关实验：1964 1964年年GurdonGurdon等进行的非洲爪蟾实验等进行的非洲爪蟾实验 1970 1970年年StewardSteward等用悬浮培养的胡萝卜单个等用悬浮培养的胡萝卜单个 细胞培养成可育的胡萝卜植株。细胞培养成

3、可育的胡萝卜植株。1997 1997年英国学者克隆出年英国学者克隆出“多莉多莉”羊羊 一、基因重组基本过程一、基因重组基本过程 载体和目的基因的载体和目的基因的离；离；载体和目的基因的载体和目的基因的断；断；载体和目的基因的重组载体和目的基因的重组()；重组重组DNA的的化和扩增；化和扩增；重组重组DNA的的选和鉴定。选和鉴定。Vector Target DNARecombinant plasmid/DNA Clone (一一)DNA)DNA重组技术中最常用的工具酶重组技术中最常用的工具酶酶类酶类主要用途主要用途限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别识别DNADNA特定序列，切断特定序列，切断D

4、NADNA链链DNADNA聚合酶聚合酶I I 缺口平移制作标记缺口平移制作标记DNADNA探针探针 合成合成cDNAcDNA的第二链的第二链填补双链填补双链DNA3DNA3 末端末端DNADNA序列分析序列分析 耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶（Taq DNApolTaq DNApol等）等）聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）DNADNA连接酶连接酶连接两个连接两个DNADNA分子或片段分子或片段 二、工具酶二、工具酶 产生产生5突出粘性末端突出粘性末端(cohesive end):以以EcoR I为例：为例：5GAATT C3 5G -pTTAAC33C TTAAG5 3 CTTAA

5、 p-OH G5 产生产生3突出的粘性末端：突出的粘性末端：以以Pst为例：为例：5CTGCAG3 5CTGCAOH-pG33GACGTC5 3Gp-OHACGTC5 产生平末端产生平末端(blunt end):Nru 为例：为例：5GTTAAC3 5GTTOH-pAAC33CAATTG5 3CAAp-OHTTG5限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)在重组DNA技术中有重要地位限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现近近1800多种，可根据它们对多种，可根据它们对DNA有不同的识有不同的识别序列和切割特征选用，从而为基因工程提

6、别序列和切割特征选用，从而为基因工程提供有力工具。供有力工具。配伍末端：配伍末端：识别序列不同，但切割识别序列不同，但切割DNA后产生相同后产生相同类型的粘性末端。类型的粘性末端。三、载体三、载体 基因工程中常用的载体基因工程中常用的载体(vector)主要包括主要包括(plasmid)、(phage)和和(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。标志基因、单一的限制酶切点等。是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染是存在于天然

7、细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的色体之外的双链环状双链环状DNA，具有，具有独立复制独立复制的的能力，通常带有细菌的能力，通常带有细菌的。最早使用的质粒最早使用的质粒DNA是人工构建的是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含抗氨苄青霉素基因，含EcoR，BamH，Hind等单一的限制酶切点。等单一的限制酶切点。质粒质粒pUC19的分子结构的分子结构2噬菌体噬菌体可 通 过 转 染 方 式 将 其可 通 过 转 染 方 式 将 其DNA送入细菌体内进行送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建增殖。常用的为人工构建的

8、的噬菌体载体噬菌体载体。噬菌体。噬菌体两端的片段对于其包装是两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体基因与噬菌体DNA进行进行重组时，可采用重组时，可采用插入重组插入重组方式方式，也可采用，也可采用置换重组置换重组方式方式。3病毒病毒常用的为常用的为SV40，通过感染方式将其，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。目送入哺乳动物细胞中进行增殖。目前应用相对较少。前应用相对较少。理想的基因工程载体一般至少有以下几点要

9、求：理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要 有较高的自主复制能力。有较高的自主复制能力。容易进入宿主细胞，而且进入效率越高容易进入宿主细胞，而且进入效率越高 越好。越好。容易插入外来核酸片段，插入后不影响容易插入外来核酸片段，插入后不影响 其进入宿主细胞和在细胞中的复制。其进入宿主细胞和在细胞中的复制。容易从宿主细胞中分离纯化出来。容易从宿主细胞中分离纯化出来。有容易被识别筛选的标志。有容易被识别筛选的标志。基因工程操作步骤基因工程操作步骤 一、目的基因的获得一、目的基因的获得目的基因的筛选和分离可采用以下方法进目的基因的

10、筛选和分离可采用以下方法进行：行：1直接从染色体直接从染色体DNA中分离：中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。2人工合成人工合成根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。合成。适应于编码小分子多肽的基因。3.从从 m R N A 合 成合 成cDNA采用一定的方法钓采用一定的方法钓取 特 定 基 因 的取 特 定 基 因 的mRNA，再通过逆，再通过逆转录酶催化合成其转录酶催化合成其互补互补DNA（cDNA），除去），除

11、去R N A 链 后，再 用链 后，再 用DNA聚合酶合成其聚合酶合成其互补互补DNA链，从而链，从而得到双链得到双链DNA。这。这一方法通常可得到一方法通常可得到可表达的完整基因。可表达的完整基因。4从基因文库中筛选从基因文库中筛选将某一种基因将某一种基因DNA用适当的限制酶切断用适当的限制酶切断后，与载体后，与载体DNA重组，再全部转化宿主重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组细胞，得到含全部基因组DNA的种群，的种群，称为称为G文库文库(genomic DNA library)。将某种细胞的全部将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部，然

12、后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为表达基因的种群，称为C-文库文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。文库具有组织细胞特异性。基因组文库的制作基因组文库的制作5利用利用PCR合成合成如已知目的基因两如已知目的基因两端的序列，则可采端的序列，则可采用 聚 合 酶 链 反 应用 聚 合 酶 链 反 应（po lym e r a s e chain reaction,PCR）技）技术，在体外合成目术，在体外合成目的基因。但此法可的基因。但此法可能会造成克隆的目能会造成克隆的目的基因碱基序列的的基因碱基序列的改变。改变。二、载体和目的基因的切断（切）二、载体和目的基因

13、的切断（切）通常采用通常采用限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。和目的基因进行切断，以便于重组。限制酶目前已经发现限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序多种，所识别的顺序往往为往往为4-8个碱基对，且有个碱基对，且有回文结构回文结构。由限制酶切断后的末端可形成由限制酶切断后的末端可形成平端、平端、3-突出突出粘性末端和粘性末端和5-突出粘性末端突出粘性末端三种情况。形成三种情况。形成粘性末端粘性末端(cohesive end)者较有利于载体者较有利于载体DN

14、A和目的基因的重组。和目的基因的重组。三、载体和目的基因的重组（接）三、载体和目的基因的重组（接）即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的起来，得到重新组合后的DNA分子。分子。（一）黏性末端连接法：（一）黏性末端连接法：当载体当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即连接酶，即

15、可封闭其缺口，得到重组体。可封闭其缺口，得到重组体。较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。接。载体载体DNA与目的基因的连接与目的基因的连接（二）人工接尾法（二）人工接尾法即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得黏性末端时，可采用此方法。黏性末端时，可采用此方法。此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于

16、载体或目的基因的苷酸添加于载体或目的基因的3-端，如载体端，如载体上添加一段上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一，则可在目的基因上添加一段段polyC，故二者即可通过碱基互补进行黏合，故二者即可通过碱基互补进行黏合，再由再由DNA连接酶连接。连接酶连接。（三）人工接头法（三）人工接头法将人工连接器（即一段含有多种限制酶将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的切点的DNA片段）连接到载体和目的基片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补体和目的基因进行切断，得到可以互补的黏性末端。的黏性末端。四、重组四、

17、重组DNA的转化和扩增（转）的转化和扩增（转）重组重组DNA需导入宿主细胞才能进行增需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。重组质粒可通过殖或表达。重组质粒可通过转化转化（transformation）方式导入宿主）方式导入宿主细胞，即将大肠杆菌用细胞，即将大肠杆菌用CaCl2处理，处理，增加细菌细胞壁的通透性，再与重组增加细菌细胞壁的通透性，再与重组质粒质粒DNA短暂温育，质粒短暂温育，质粒DNA即可导即可导入宿主细胞。入宿主细胞。如果是用如果是用噬菌体作为载体的重组体，则噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，使之成为具需要用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能力的噬菌体，再通 过有感

18、染能力的噬菌体，再通 过 转 染转 染(transfection)方式将重组噬菌体方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。导入大肠杆菌等宿主细胞。重组重组DNA导入宿主细胞后，即可在适当导入宿主细胞后，即可在适当的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。对于质粒对于质粒DNA，还可通过在培养基中加，还可通过在培养基中加入氯霉素，抑制细菌蛋白质合成及染色入氯霉素，抑制细菌蛋白质合成及染色体体DNA的复制，以单独扩增细胞中的质的复制，以单独扩增细胞中的质粒粒DNA。五、重组五、重组DNA的筛选和鉴定（筛）的筛选和鉴定（筛）由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因

19、此由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。可采用以下方法进行：可采用以下方法进行：（一）根据重组体的表型进行筛选（一）根据重组体的表型进行筛选：对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭插入灭活法活法进行筛选。如进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉

20、素的培养耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。长的细菌即为带重组体的细菌。插入灭活法筛选重组体插入灭活法筛选重组体（二）根据标志互补进行筛选（二）根据标志互补进行筛选当宿主细胞存在某种基因及其表达产物当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。达产物，则说明

21、该细胞中带有重组体。（三）根据（三）根据DNA限制酶谱进行分析限制酶谱进行分析经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。泳带即证明重组体中带有目的基因。（四）用核酸杂交法进行分析鉴定（四）用核酸杂交法进行

22、分析鉴定为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。的基因。获得带目的基因的细菌后，可将其不断获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目的基因片进行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游段用于分析研究。如在目的基因的上游带有启动子顺序，则目的基因还可转录带有启动子顺序，

23、则目的基因还可转录表达合成蛋白质。表达合成蛋白质。1.什么是基因重组技术？它包含那些内容？2.列举常用的基因工程工具酶的特性和用途。3.叙述常用的基因工程载体的种类、特点和用途。4.怎样获得目的基因或核酸序列的克隆？有那些 方法？要经过那些基本步骤？5.怎样能在大肠杆菌中获得真核基因的表达产物？第三节第三节 分子生物学常用技术分子生物学常用技术 一、分子杂交与探针技术一、分子杂交与探针技术（一）分子杂交（一）分子杂交不同来源的单链核酸（不同来源的单链核酸（DNA或或RNA），只要），只要它们具有大致相同的碱基序列，经过退火处理，它们具有大致相同的碱基序列，经过退火处理，就能重新形成杂种双螺旋，

24、这一现象称为就能重新形成杂种双螺旋，这一现象称为分子分子杂交杂交（molecular hybridization）。）。利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组组DNA分子中的同源基因或同源序列。分子中的同源基因或同源序列。（二）探针技术（二）探针技术将已知序列的核酸片段用放射性同位素、将已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记，然后用于生物素或荧光染料进行标记，然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，

25、使杂交区带显现出光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。来。二、分子印迹二、分子印迹技术技术印迹技术的原理首先由印迹技术的原理首先由Edwen Southern在在1975年提出。其基本操作过程是：将年提出。其基本操作过程是：将DNA片片段在琼脂糖凝胶中电泳分离后，置段在琼脂糖凝胶中电泳分离后，置NaOH液中液中浸泡，从而将凝胶中的浸泡，从而将凝胶中的DNA变性为单链；然后变性为单链；然后将一张硝酸纤维素膜铺在凝胶上，上面放上大将一张硝酸纤维素膜铺在凝胶上，上面放上大量吸水纸巾，利用吸水纸巾的毛细作用，将单量吸水纸巾，利用吸水纸巾的毛细作用，将单链链DNA从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，再将从凝胶

26、中转移到硝酸纤维素膜上，再将膜置膜置80烘干并使单链烘干并使单链DNA分子固定在膜上，分子固定在膜上，再用于分子杂交分析。因此，用于再用于分子杂交分析。因此，用于DNA印迹的印迹的技术又称为技术又称为Southern Blotting或或Southern 杂交。杂交。分子印迹技术的种类分子印迹技术的种类（一）（一）DNA印迹技术：印迹技术：又称为又称为Southern杂交，即杂交，即DNA-DNA杂交分析。杂交分析。（二）（二）RNA印迹技术：印迹技术：又称为又称为Northern杂交，即杂交，即RNA-DNA杂交分析。杂交分析。（三）蛋白质印迹技术：（三）蛋白质印迹技术：又称为又称为West

27、ern杂交，或免疫印迹技术，即利用杂交，或免疫印迹技术，即利用抗原抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。异性蛋白质。Southern Blotting三、三、PCR技术技术（一）（一）PCR的概念的概念PCR(polymerase chain reaction)即即聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术，是指利用耐热，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性聚合酶的反复作用，通过变性-延伸延伸-复复性的循环操作，在体外迅速将性的循环操作，在体外迅速将DNA模板模板扩增数百万倍的一种操作技术。扩增数百万倍的一种操作技术。理论上可在理论上可在2

28、小时内将一个小时内将一个DNA分子扩分子扩增到增到106109倍，从而大大提高了对其倍，从而大大提高了对其进行分析研究的速度。进行分析研究的速度。（二）（二）PCR反应系统的组成反应系统的组成 PCR反应系统应包括：反应系统应包括：1耐热耐热DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）酶）这是由耐热细菌这是由耐热细菌体内提取的一种体内提取的一种DNA聚合酶，可保证在聚合酶，可保证在950C，30分钟以上不会变性失活。分钟以上不会变性失活。2模板模板DNA 即待分析的目的即待分析的目的DNA，其长度不，其长度不宜大于宜大于10kb。3两种引物两种引物 为了保证为了保证DNA聚合酶能够对两条聚合酶能够对两条互

29、补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补模板于两条互补模板DNA链的链的3-端。端。4四种脱氧核糖核苷酸四种脱氧核糖核苷酸 用作底物的用作底物的dNTPS。5缓冲溶液缓冲溶液 保证保证DNA聚合酶催化时所聚合酶催化时所需的适当的溶液需的适当的溶液pH值。值。（三）（三）PCR的反应原理的反应原理 PCR反应时，一般采用反应时，一般采用变性变性-复性复性-延伸延伸三三步循环，也可采用步循环，也可采用变性变性-延伸延伸两步循环。两步循环。1变性变性 通常采用加热变性，即将模板通常采用加热变性，即将模板DNA或延伸后的双链或延伸后的双链DNA加热到加热

30、到95，使双螺旋使双螺旋DNA解开成为单链。解开成为单链。2复性复性 通过降低反应温度至通过降低反应温度至55，使两，使两种引物能与两条解开的种引物能与两条解开的DNA互补链的互补链的3端黏合，以提供端黏合，以提供DNA聚合酶催化聚合所聚合酶催化聚合所需的需的3-OH。3延伸延伸 将反应温度提高到约将反应温度提高到约70，在耐，在耐热热DNA聚合酶的催化下，根据模板聚合酶的催化下，根据模板DNA提供的碱基顺序，合成两条互补链，从提供的碱基顺序，合成两条互补链，从而使模板而使模板DNA扩增一倍。扩增一倍。按照上述步骤重复操作约按照上述步骤重复操作约30次，即可将次，即可将模板模板DNA扩增数百万

31、倍。扩增数百万倍。PCR的反应原理的反应原理（四）（四）PCR的主要用途的主要用途 1.目的基因的克隆目的基因的克隆 PCR技术是迅速获得一定量的目的基因以技术是迅速获得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有：利用特异性引物以法有：利用特异性引物以cDNA或基因组或基因组DNA为模板，获得已知的目的基因；利用简为模板，获得已知的目的基因；利用简并引物从并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有文库或基因组文库中获得具有同源性的同源性的DNA片段；利用随机引物从片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机获得目的基因。文库或基

32、因组文库中随机获得目的基因。2.基因的体外突变基因的体外突变 采用随意设计的引物，在体外对基因进采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。行嵌合、缺失、点突变等改造。3.DNA的微量分析的微量分析由于由于PCR技术具有高度敏感性，故可用技术具有高度敏感性，故可用于微量于微量DNA的分析检测。的分析检测。四、四、DNA序列分析技术序列分析技术 DNA碱基序列测定即碱基序列测定即DNA一级结构的测一级结构的测定，目前常用的方法为定，目前常用的方法为Maxam-Gilbert建立的建立的化学裂解法化学裂解法和和Sanger建立的建立的双脱双脱氧末端终止法氧末端终止法。双脱氧末端终

33、止法的主要操作步骤有：双脱氧末端终止法的主要操作步骤有：1获得待测获得待测DNA片段的单链模板片段的单链模板 一般采用基因工程的方法以获取一定数一般采用基因工程的方法以获取一定数量的单链待测量的单链待测DNA模板。可将待测模板。可将待测DNA片段与噬菌体片段与噬菌体M13DNA进行重组，然后进行重组，然后将其导入大肠杆菌进行增殖，将其导入大肠杆菌进行增殖，M13噬菌体噬菌体一般以单链一般以单链DNA形式透出细胞再感染新形式透出细胞再感染新的细菌，故此可获得单链的细菌，故此可获得单链DNA模板。模板。2合成寡核苷酸引物合成寡核苷酸引物 在待测在待测DNA片段的片段的3-端合成一段互补的端合成一段

34、互补的寡核苷酸引物，其顺序可为待测寡核苷酸引物，其顺序可为待测DNA片片段段3-端的一段已知顺序，也可为一段端的一段已知顺序，也可为一段M13噬菌体的顺序。可利用噬菌体的顺序。可利用DNA合成仪合成仪自动合成。自动合成。3模板模板-引物杂交引物杂交 将待测单链将待测单链DNA模板与寡核苷酸引物混模板与寡核苷酸引物混合，并在适当温度条件下进行保温处理，合，并在适当温度条件下进行保温处理，使引物与使引物与DNA单链模板的单链模板的3-端进行杂交。端进行杂交。4互补链的延长和终止互补链的延长和终止 将上述杂交混合液分为四份，每份混合液中均将上述杂交混合液分为四份，每份混合液中均加入加入DNA聚合酶，

35、四种聚合酶，四种dNTPS，一种带放射，一种带放射性同位素标记的脱氧核糖核酸（如性同位素标记的脱氧核糖核酸（如-32P-dATP）。此外还需分别加入一种双脱氧核糖）。此外还需分别加入一种双脱氧核糖核酸（核酸（ddATP，ddGTP，ddCTP或或ddTTP）。）。然后在适当温度条件下延伸互补链，就可得到然后在适当温度条件下延伸互补链，就可得到四组分别以四组分别以A、G、C、T、终止的长短不一的、终止的长短不一的互补链的混合物。因在互补链合成时，如掺入互补链的混合物。因在互补链合成时，如掺入的是双脱氧核糖核酸，由于缺乏的是双脱氧核糖核酸，由于缺乏3-和和2-OH，故可导致互补链合成终止。，故可导

36、致互补链合成终止。5电泳分离电泳分离 将四组含有长短不等的反应混合物在同将四组含有长短不等的反应混合物在同一聚丙烯酰胺凝胶板上进行电泳，即可一聚丙烯酰胺凝胶板上进行电泳，即可将只相差一个核苷酸的寡核苷酸链分离将只相差一个核苷酸的寡核苷酸链分离开。开。6放射自显影放射自显影 将电泳凝胶与将电泳凝胶与X光胶片压在一起，于低温光胶片压在一起，于低温下自显影数天，即可得到放射自显图谱，下自显影数天，即可得到放射自显图谱，通过该图谱即可直接读出核苷酸的排列通过该图谱即可直接读出核苷酸的排列顺序。顺序。第四节第四节 分子生物学技术进展（略）分子生物学技术进展（略）第五节第五节 基因工程与医学的关系基因工程与医学的关系 一、疾病基因的发现与克隆一、疾病基因的发现与克隆二、生物制药二、生物制药三、基因诊断三、基因诊断四、基因治疗四、基因治疗五、遗传病的预防五、遗传病的预防