第6章目的基因的分离克隆(植物基因工程)课件.ppt

1、.基基因因工工程程的的步步骤骤.分为六个阶段：分为六个阶段：阶段阶段1：mRNA反转录酶催化合成反转录酶催化合成cDNA第一链第一链阶段阶段2：cDNA第二链的合成第二链的合成阶段阶段3：cDNA的甲基化的甲基化阶段阶段4：接头或衔接子的连接：接头或衔接子的连接阶段阶段5：纯化：纯化cDNA阶段阶段6：cDNA与与噬菌体臂的连接噬菌体臂的连接cDNA文库的构建步骤文库的构建步骤.以以mRNA为模板，经反为模板，经反转录酶合成互补转录酶合成互补DNA(cDNA)，构建的基因库。，构建的基因库。绝大多数真核生物绝大多数真核生物mRNA的的3端具有一段多端具有一段多聚聚A(poly-A)尾端序列。在

2、尾端序列。在反转录酶作用下，用反转录酶作用下，用poly-T引物引物(primer)，引导合成，引导合成一条互补一条互补DNA，即第一条，即第一条DNA链，形成链，形成RNA-DNA杂合双链。然后合成第杂合双链。然后合成第2条链。条链。lcDNA文库仅包含正在表达的基因文库仅包含正在表达的基因l不同物种、不同组织的不同物种、不同组织的cDNA文库不相同文库不相同l基因总量少，易筛选基因总量少，易筛选.n差别显示技术差别显示技术.n根据生物大分子间的相互作用分离根据生物大分子间的相互作用分离目的目的cDNAcDNA克隆克隆酵母双杂合系统酵母双杂合系统真核生物的位点特异转录激活因子：真核生物的位点

3、特异转录激活因子：BD ADBD AD.PCNA.将所有的遗传物质克隆到细菌中将所有的遗传物质克隆到细菌中-DNA文库文库基因组文库基因组文库(gene library)：将某种生物的基因组：将某种生物的基因组DNA切割成切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。通常的方法是，尽量提取通常的方法是，尽量提取大分子量的核大分子量的核DNA，用限制

4、，用限制性酶酶切后，分离选择具有性酶酶切后，分离选择具有一定长度一定长度(大于大于15kb)的的DNA片段，与适宜的载体连接构片段，与适宜的载体连接构成重组成重组DNA分子分子,选择相应选择相应的宿主细胞用于克隆。载体的宿主细胞用于克隆。载体可以是质粒，噬菌体，可以是质粒，噬菌体，BAC或或YAC等等.文库构建流程文库构建流程抽提基因组抽提基因组DNADNA鸟枪法制备鸟枪法制备DNADNA片段片段DNADNA片段与载体重组片段与载体重组转化宿主菌转化宿主菌筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）.理想的核基因库应当能包括全部的基因组序理想的核基因库应当能包括

5、全部的基因组序列。如果每一个克隆包括的列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总片段大，则总克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：例例:人类基因组人类基因组3.0 x106kb,以以EMBL作载体，作载体，插入片段的平均长度为插入片段的平均长度为17 kb，p为为99%时时,基因基因库应有库应有8.1x105 个个 重组噬菌体。重组噬菌体。.菌落杂交技术寻找目标菌落杂交技术寻找目标DNA克隆克隆.T-DNA 载体构建载体构建转化植物（转化植物（T1，T-DNA杂合子杂合子)

6、收获收获T2种子种子筛选筛选T2，获突变子，应为，获突变子，应为3:1分离分离确定确定T-DNA与突变型共分离的个体与突变型共分离的个体产生纯合后代产生纯合后代克隆克隆T-DNA两侧的植物两侧的植物DNA利用侧翼利用侧翼DNA序列作探针从该植物的序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因文库中钓取基因基因功能的验证基因功能的验证.图位克隆图位克隆又叫又叫 (或候选基因克隆或候选基因克隆),),是根据目的基因的位置特性而非是根据目的基因的位置特性而非其编码产物来克隆。成功分离目的基因须具备三个必要条其编码产物来克隆。成功分离目的基因须具备三个必要条件：件：分子标记分子标记高密度遗传图谱高密度遗传

7、图谱染色体步移法分离目的基因染色体步移法分离目的基因 .n基于基于PCR的的DNA克隆与基于载体的克隆克隆与基于载体的克隆技术相比具有一定优越性。技术相比具有一定优越性。PCR反应速度很快，可以在几个小时内反应速度很快，可以在几个小时内完成，而载体克隆需要几周时间完成，而载体克隆需要几周时间。PCR反应非常灵敏，可以用来扩增痕量反应非常灵敏，可以用来扩增痕量样品的样品的DNA。对于部分降解、甚至污染，用载体克隆无对于部分降解、甚至污染，用载体克隆无法进行的法进行的DNA样品，样品，PCR扩增仍可获得目扩增仍可获得目的基因克隆的基因克隆.（1）套式）套式PCR（2）反向）反向PCR（3）不对称）

8、不对称PCR（4）锚定）锚定PCR（5）长程）长程PCR（6）反转录）反转录PCR（7）锅柄）锅柄PCR.F-2k：5 ATG ATA AGA AAG GGA GGA AGA 3R-2k：5 TTA ATT CAC TGG AAT AAA TTC 3质粒提取基因扩增.5、人工合成基因人工合成基因 根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。很快地人工合成基因。磷酸二酯法磷酸二酯法亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法寡核苷酸连接法寡核苷酸连接法.5、人工合成基因人

9、工合成基因 例如，首先化学合成多个含有例如，首先化学合成多个含有80-100个核苷酸的寡个核苷酸的寡核苷酸核苷酸，每个寡核苷酸之间具有，每个寡核苷酸之间具有19-24个核苷酸的重个核苷酸的重叠序列叠序列，再将各个寡核苷酸等量混合，在，再将各个寡核苷酸等量混合，在DNA聚合聚合酶酶(或或Taq酶酶)作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链，再用两个链，使单链部分补齐成为双链，再用两个PCR引物，引物，经经PCR扩增出扩增出DNA片段。若将两个片段。若将两个DNA片段放在一片段放在一起，起，经经SOE-PCR(sequence overlapped extension，SOE)扩增出完整的基因片段。扩增出完整的基因片段。.限制化学法合成基因的因素 已知序列且有应用价值的基因很少，而植物来源 的基因更少；化学合成的寡核苷酸片段长度有限，经基因组装 才能合成较大的目的基因，而这往往使基因制备 难度加大；化学基因合成相比之下比较昂贵。.培养基培养基卡那霉素卡那霉素.