发酵工程第二章-工业发酵菌种选育课件.ppt

1、第二章第二章 工业发酵菌种选育工业发酵菌种选育工业发酵生产水平取决于工业发酵生产水平取决于生产菌种生产菌种发酵工艺发酵工艺提取工艺提取工艺第一节第一节 工业发酵生产菌种工业发酵生产菌种 一、微生物代谢产物的类型一、微生物代谢产物的类型1.初级代谢产物：初级代谢产物：微生物通过代谢活动所产生的、微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。如氨基酸、核苷酸、自身生长和繁殖所必需的物质。如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。多糖、脂类、维生素等。2.次级代谢产物：次级代谢产物：微生物生长到一定阶段才产生的微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，化学结构十

2、分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。如抗生或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。如抗生素、毒素、激素、色素等。素、毒素、激素、色素等。两者之间的关系：两者之间的关系：P12二：工业化菌种的要求q 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物q 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强q 遗传性能要相对稳定q 不易感染其它微生物或噬菌体q生产菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）q 生产特性要符合工艺要求三、三、工业上常用菌种工业上常用菌种 细菌（细菌（bacteriabacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、

3、）：常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。啤酒酵母啤酒酵母棒状杆菌棒状杆菌短杆菌短杆菌 棒状杆菌棒状杆菌yeasts短杆菌：短杆菌：GAGA、GlnGln、lyslys枯草芽孢杆菌：淀粉酶（枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658BF7658）、碱性蛋白酶等）、碱性蛋白酶等地衣芽孢杆菌：地衣芽孢杆菌：HASS(HASS(耐高温耐高温-淀粉酶淀粉酶)-)-AmylaseAmylase苏云金芽孢杆菌：苏云金芽孢杆菌：BTBT生物农药生物农药梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等的发酵梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等的发酵 酵母菌（酵母菌（yeastyeast）：属单细胞真核生物

4、，主）：属单细胞真核生物，主要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。霉菌（霉菌（mouldmould）：喜偏酸性环境。可用于生产多）：喜偏酸性环境。可用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。放线菌放线菌霉菌霉菌 放线菌（放线菌（actionmycetesactionmycetes）：原核微生物类群。）：原核微生物类群。在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较为广泛。在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较为广泛。主要用于生产多种抗生素。主要用于生产多种抗生素。真

5、菌（青霉素、头孢等）植物或动物来源放线菌（链霉素四环素；红霉素等）一些产芽孢的细菌 担子菌（担子菌（basidiomycetesbasidiomycetes）：主要用于多糖、）：主要用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。橡胶物质和抗癌药物的开发。藻类（藻类（algaalga）：许多国家已把它作为人类保健）：许多国家已把它作为人类保健食品和饲料。还可通过藻类将食品和饲料。还可通过藻类将CO2CO2转变为石油；转变为石油；国外还有从国外还有从“藻类农场藻类农场”获得氢能的报道。获得氢能的报道。硅藻硅藻担子菌担子菌微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种

6、特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：菌种选育菌种选育经验育种经验育种自然选育自然选育诱变育种诱变育种主要通过突变主要通过突变和筛选来育种和筛选来育种定向育种定向育种杂交育种杂交育种分子育种分子育种常规的杂交育种常规的杂交育种原生质体融合原生质体融合通过通过DNA重重组技术来育种组技术来育种第二节第二节 工业发酵生产菌种来源工业发酵生产菌种来源 从菌种保藏机构获得从菌种保藏机构获得 菌种选育菌种选育（一）从自然界分离菌种 方法、地点、时间和周

7、围环境记录方法、地点、时间和周围环境记录纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：1稀释分离法稀释分离法 2平板划线分离法平板划线分离法 涂菌涂菌：划线分离划线分离：分步划线法分步划线法；一次划线法：一次划线法：3组织分离法组织分离法 目的目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一株高产目的产物的微生物（）采样和采集方法）采样和采集方法 为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。

8、采样的注意事项采样的注意事项 1 1、采样时应尽可能保持相对无菌；、采样时应尽可能保持相对无菌；2 2、所采集的样本必须具有某种代表性；、所采集的样本必须具有某种代表性；3 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；正的原地菌群的出现可能是短暂的；5 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于于44下，但贮

9、存时间不宜过长。这是因为一旦采下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长之间就会出现消长土样采集方法土样采集方法 森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；层向上层顺序采集；水田等浸水土壤在不损土层结构的情况水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面可取离地面5 515cm15cm处的土。将采

10、集到处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根际土样时，一般方法是自在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约中浸渍约20min20min，洗去粘附在根上的土洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。土，这部分上却为根际土样。植物体采集方法植物体采集方法 在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，全刀片等，由几片新鲜叶片的

11、同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。并注意不要损伤周围边缘。选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。叶上的取样部位。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。土样一起保存。水样采集方法水样采集方法 用于细菌检测的水样应收集于用于细菌检测的水样应收集于100m1100m1干净、灭菌的广口塑干净、灭菌的广口塑料瓶中。料瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的

12、静水层中由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。采集水样。方法是：握住采样瓶底浸入水中方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm30-50cm处，然后瓶口朝处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h24h之之内迅速进行检测，或者内迅速进行检测，或者44下贮存。下贮存。富集的三种方案：q 定向培养:采用特定的有利于

13、目的微生物富集的 条件，进行培养。（二）增殖培养目的：富集目的微生物，让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。q 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，q 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法定向培养的富集方法1、养分2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。（）纯种分离（）纯种分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这在这步，

14、增殖培养的选择性控制条件还应进一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有的方法有划线分离法、稀释分离法划线分离法、稀释分离法。倾注平板接种和分离工具1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 挑菌落纯化（平板划线法）倒平板划线培养挑菌落纯种（纯培养）isolation plate 制备土壤稀释液制备土壤稀释液 菌落的选出q 从产物角度出发在在培养时以产物的形成有目的的设计培养基培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素利用简单、快速的

15、鉴定方法，如抗生素q 从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。上就可以初步识别。实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选采样（造纸厂）采样（造纸厂）80度度30分钟处理分钟处理文献文献:产生菌为中性牙孢杆菌，产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34天，选择有凹陷圈

16、的菌落天，选择有凹陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型（）生产性能的测定（）生产性能的测定 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。以求得适合于工业生产用菌种。这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株，以区别于用人工育种方法得到的变型菌株，以区别于用人工育种方法得到的变异菌株。异菌株。（5 5）毒性试验）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下自然界

17、的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、微生物中除啤酒酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。需通过两年以上的毒性试验。（二）诱变育种 以微生物的自然变异作为基础的生产选种以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率很低，一个基因的自然突变频率仅的机率很低，一个基因的自然突变频率

18、仅10-610-610-1010-10左右。左右。诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是国内外提高菌种产量、性能的主要手段。国内外提高菌种产量、性能的主要手段。诱变育种：诱变育种：用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。进行的筛选，称为诱变育种。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂诱变剂物理：紫外线，快中子，物理：紫外线，快中子，X射线，射线，射线，激光射线，激光化学：碱基类似物、与碱基反应的物质化学：碱基类似物、与碱基反应的物质 生物诱

19、变剂生物诱变剂l 出发菌株的选择出发菌株的选择1 1自然界新分离的自然界新分离的野生型菌株野生型菌株，对诱变，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。处理较敏感，容易达到好的效果。2 2在生产中的菌株因经多次诱变，应考在生产中的菌株因经多次诱变，应考虑新的诱变方法。虑新的诱变方法。3.3.要尽量选择单倍体细胞、单核或核少要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，的多细胞体来作出发诱变细胞，l 处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备 这一步骤的关键是制备单细胞和单这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的菌悬液，为此要进行合孢子状态的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，适培

20、养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。过滤。l 诱变处理诱变处理 根据前面有关诱变剂及诱变处理的根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。诱变处理方案。l分离和筛选分离和筛选 筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，到初步要求的分离菌落为目的，以量为主以量为主。复筛则是精选，复筛则是精选，以质为主以质为主，也就是以精确度为，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异主。因此在具体方法上就有差异.例如初筛可以在平皿上形成的例如初筛可以在平皿上形成的透明圈或抑菌圈透明圈或

21、抑菌圈的大小来挑取参加复筛者，而将的大小来挑取参加复筛者，而将90%90%的菌落淘汰。的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。的菌株，最后才能选得优秀菌株。紫外线的诱变育种紫外线的诱变育种 紫外线诱变一般采用紫外线诱变一般采用15W15W紫外线杀菌灯，波长为紫外线杀菌灯，波长为2537A2537A灯与处理物的距离为灯与处理物的距离为151530cm30cm，照射时照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡们常以细胞的死亡率表

22、示，希望照射的剂量死亡率控制在率控制在707080%80%为宜。为宜。例例 被照射的菌悬液细胞数，细菌为被照射的菌悬液细胞数，细菌为106106个个mlml左左右，霉菌孢子和酵母细胞为右，霉菌孢子和酵母细胞为106106107107个个mlml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约约0.50.51.0cm1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。和照射后的处理应在红灯下

23、进行。(二二)操作步骤操作步骤 1 1将细菌培养液以将细菌培养液以3000r3000rminmin离心离心5min5min，倾去上清液，将倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。2 2将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达可达108108个个mlml左右，作为待处理菌悬液。左右，作为

24、待处理菌悬液。3 3取取2 24m14m1制备的菌液加到直径制备的菌液加到直径9cm9cm培养皿内，放入一无菌培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W15W紫外线下紫外线下30cm30cm处。处。在正式照射前，应先开紫外线在正式照射前，应先开紫外线10min10min，让紫外灯预热，然后，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射开启皿盖正式在搅拌下照射101050s50s。操作均应在红灯下进。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。行，或用黑纸包住，避免白炽光。4 4取未照射的制备菌液和照射菌液各取未照射的制备菌液和照射菌液各o.5m

25、lo.5ml进进行稀释分离，计数活菌细胞数。行稀释分离，计数活菌细胞数。5 5取照射菌液取照射菌液2ml2ml于液体培养基中于液体培养基中(300ml(300ml三角三角瓶内装瓶内装30ml30ml培养液培养液)，120r120rminmin振荡培养振荡培养4 46h6h。6 6取中间培养液稀释分离、培养。取中间培养液稀释分离、培养。7 7挑取菌落进行筛选。挑取菌落进行筛选。亚硝基胍诱变曲霉菌亚硝基胍诱变曲霉菌 亚硝基胍亚硝基胍(MNNG)MNNG)对真核或原核微对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是的作用机制尚不很清楚，据认为

26、是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的内的DNADNA复制系统，从而诱发了变异。复制系统，从而诱发了变异。例例 (二二)操作步骤操作步骤 1 1单孢子悬液制备单孢子悬液制备 取斜面，加入取斜面，加入6ml 0.1mol6ml 0.1molL pH6.oL pH6.o的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达浓度可达l0l06 6

27、个个mlml，此为待处理孢子悬液。此为待处理孢子悬液。2 2MNNGMNNG溶液的制备溶液的制备 用分析天平称取用分析天平称取2mg2mg，加加入入2ml 0.1mol2ml 0.1molL pH 6.0L pH 6.0磷酸缓冲液，于暗磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。处振荡溶解。3 3诱变处理诱变处理 吸取吸取MNNGMNNG溶液溶液lmllml，加入加入到到1m11m1孢子悬液中，孢子悬液中，3030振荡振荡30min30min，立立即稀释即稀释10001000倍停止作用，然后以倍停止作用，然后以1010-4-4稀释稀释度分离培养，度分离培养，30 330 3天后计数。天后计数。4 4挑取菌落进

28、行糖化酶及蛋白酶产量挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选筛选（三）杂交育种 指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离筛选具融合使遗传物质重新组合，再从中分离筛选具有新性状的菌株。有新性状的菌株。融合融合生长快、产量高生长快、产量高 菌菌B生长快，产量低生长快，产量低 菌菌A生长慢，产量高生长慢，产量高细胞壁细胞壁细胞壁细胞壁溶解酶溶解酶细胞膜细胞膜营养细胞营养细胞原生质体原生质体原生质体融合原生质体融合融合细胞融合细胞原生质体形成原生质体形成原生质体融合原生质体融合细胞壁细胞壁再生再生原生质体融合的基本过程原生质体融合的基

29、本过程（1）原生质体融合影响原生质体融合的主要因素 菌体的前处理菌体的前处理 菌体的培养时间菌体的培养时间 融合剂的浓度融合剂的浓度 融合剂作用的时间融合剂作用的时间 阳离子浓度阳离子浓度 融合的温度及体系的融合的温度及体系的pHpH值等值等影响原生质体再生的主要因素影响原生质体再生的主要因素 菌体自身的再生性能菌体自身的再生性能 原生质体制备的条件原生质体制备的条件 再生培养基成分再生培养基成分 再生培养条件等再生培养条件等（2）基因重组 把外源把外源DNADNA分子结合到任何病毒、质粒、或其它分子结合到任何病毒、质粒、或其它载体系统中，组成新的遗传物质，并转入宿主细载体系统中，组成新的遗传

30、物质，并转入宿主细胞内进行繁殖的过程。胞内进行繁殖的过程。可以从复杂的可以从复杂的DNADNA分子中分离出单独的分子中分离出单独的DNADNA片段。片段。可以大量生产高纯度的基因片段及其产物。可以大量生产高纯度的基因片段及其产物。可以在大肠杆菌中研究来自其它生物的基因。可以在大肠杆菌中研究来自其它生物的基因。在高等动植物中也可以发展和建立这种基因操作系在高等动植物中也可以发展和建立这种基因操作系统。统。基因重组过程基因重组过程目标目标DNA片段的获得片段的获得与载体与载体DNA分子的连接分子的连接重组重组DNA分子引入宿主细胞分子引入宿主细胞筛选含有所需重组筛选含有所需重组DNA分子的宿主细胞

31、分子的宿主细胞对外源基因的表达及稳定性的鉴定对外源基因的表达及稳定性的鉴定点击此处观看DNA重组技术与基本操作第三节第三节 菌种的保藏与复壮菌种的保藏与复壮 微生物菌种的衰退微生物菌种的衰退 菌种的复壮菌种的复壮 菌种的保藏菌种的保藏一、菌种的衰退一、菌种的衰退微生物个体特征微生物个体特征微生物群体特征微生物群体特征各方面各方面发生变化发生变化营养物质代谢和营养物质代谢和生长繁殖能力下生长繁殖能力下降降发酵周发酵周期延长期延长抗不良环抗不良环境的性能境的性能减弱减弱目的产物的目的产物的产量下降产量下降1 1、菌种退化的原因：菌种退化的原因：基因突变；基因突变；变异菌株性状分离；变异菌株性状分离

32、；诱变的单菌落是由诱变的单菌落是由个以上孢子或细胞形成个以上孢子或细胞形成 菌落由菌落由个孢子或单个细胞形成，但它是多核细胞个孢子或单个细胞形成，但它是多核细胞 单核孢子发生突变时，双链单核孢子发生突变时，双链DNADNA上仅上仅条链上某个条链上某个位点发生变化位点发生变化 连续传代连续传代 其它因素其它因素 菌种保藏不当菌种保藏不当 生长条件不满足（培养基组成、培养条件）生长条件不满足（培养基组成、培养条件）2、防止衰退的措施防止衰退的措施1）减少传代次数；减少传代次数；2）创造良好的培养条件；）创造良好的培养条件；3）利用单核体传代）利用单核体传代4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指）经

33、常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；标进行检查；5）采用有效的菌种保藏方法；）采用有效的菌种保藏方法；二、菌种的复壮二、菌种的复壮 1 1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。重新获得具有原有典型性状的菌种。a a）纯种分离纯种分离；b b）通过寄主体进行复壮；通过寄主体进行复壮；c c）淘汰已衰退的个体；）淘汰已衰退的个体；2 2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变正变”个体。个体。(一)菌种的提纯

34、即从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将即从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以恢复和建立尚未退化的个体分离出来，以恢复和建立具有原来生产性状的群体，继续供科研及具有原来生产性状的群体，继续供科研及生产使用。生产使用。菌种提纯：要求达到菌落纯化的水平，通菌种提纯：要求达到菌落纯化的水平，通过稀释平板法、划线法等。过稀释平板法、划线法等。如柠檬酸生产菌在平皿上分离，挑如柠檬酸生产菌在平皿上分离，挑最小菌最小菌落落，不断纯化分离。，不断纯化分离。(二)通过寄主体进行复壮 对于寄对于寄 生性微生物如苏云金杆菌、白生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体病毒等，由于长期使用，僵菌、多角

35、体病毒等，由于长期使用，其毒力会下降，导致杀虫效率降低待衰其毒力会下降，导致杀虫效率降低待衰退现象。这时可以用菌种却感染菜青虫退现象。这时可以用菌种却感染菜青虫幼虫等，然后从致死的虫体上重新分离，幼虫等，然后从致死的虫体上重新分离，经过几次重复感染与分离，就可以逐步经过几次重复感染与分离，就可以逐步恢复和提高毒力。恢复和提高毒力。(三)淘汰已衰退的个体 通过物理、化学的方法处理菌体通过物理、化学的方法处理菌体(或或孢子孢子)，使大部分死亡，使大部分死亡(80%(80%以上以上)，存活的菌多为生长健壮者，可从中存活的菌多为生长健壮者，可从中选出优良菌种来。选出优良菌种来。三、菌种保藏三、菌种保藏

36、目的目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用。以供研究、生产、交换之用。基本原则基本原则：1 1、挑选典型菌种的优良纯种、挑选典型菌种的优良纯种 2 2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体 3 3、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温）低温）4 4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株较重要的微生物菌株低温保藏法低温保藏法方法：菌种管置方法：菌种管置44冰箱保藏，定时传代冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度

37、明显下降原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。石蜡油低温保藏法：石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。干燥保藏法干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。保藏，保藏时间几至几十年。真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。时间长，是目前最好的保藏方法。液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（温冰箱中（-196-196）。）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。EndThanks!