第五章-转录机制(Mechanisms-of-Transcription)课件.ppt

1、Welcome to My Molecular Biology ClassYang Yang（杨洋（杨洋 教授）教授）Huazhong University of Science and Technology2Molecular Biology of the Gene,5/E -Watson et al.(2004)Part I:Chemistry and Genetics Part II:Maintenance of the Genome Part III:Expression of the GenomePart IV:RegulationPart V:MethodsThe revised

2、central dogmaRNA processingGene regulation基基因因组组的的保保持持基基因因组组的的表表达达4Ch 12:Mechanisms of transcription Ch 13:RNA splicingCh 14:TranslationCh 15:The genetic code1.RNA polymerase and the transcription cycle（RNA聚合聚合酶和转录周期）酶和转录周期）2.The transcription cycle in bacteria（细菌的转录周期）（细菌的转录周期）3.Transcription in eu

3、karyotes（真核生物的转录）（真核生物的转录）Outline7Transcription is chemically and enzymatically very similar to DNA replication.转录在化学和酶学上与转录在化学和酶学上与DNA的复的复制非常相似，都是通过酶的作用合制非常相似，都是通过酶的作用合成一条与成一条与DNA模板互补的核酸链模板互补的核酸链81.RNA is made of ribonucleotides（核糖核（核糖核苷酸）苷酸）2.RNA polymerase catalyzes the reaction,which does not re

4、quire a primer(de novo synthesis，从头合成，从头合成)3.The RNA product does not remain base-paired to the template DNA strand（RNA产物不与模板产物不与模板DNA链的碱基保存链的碱基保存互补状态，将正在延长的链从模板上置换下来）互补状态，将正在延长的链从模板上置换下来）4.Less accurate(error rate:10-4)，不如复，不如复制更为精确（制更为精确（error rate:10-7）-why?95.Transcription selectively copies onl

5、y certain parts of the genome and makes one to several hundred,or even thousand,copies of any given section of the genome.转录是有选择性地复制基因组的特定部分，并从转录是有选择性地复制基因组的特定部分，并从任何特定部分产生任何特定部分产生1个到几百个甚至上千个拷贝。个到几百个甚至上千个拷贝。转录区域的选择并不是随机的，每个转录区通常转录区域的选择并不是随机的，每个转录区通常包括一个或多个基因，而且在每个转录区域的首包括一个或多个基因，而且在每个转录区域的首端和尾端都存在特定

6、的端和尾端都存在特定的DNA序列指导转录的起始序列指导转录的起始和终止。和终止。复制：必须将整个基因组全部拷贝，并且在每次细胞分裂复制：必须将整个基因组全部拷贝，并且在每次细胞分裂时进行一次（只能一次）时进行一次（只能一次）10Fig 12-1 Transcription of DNA into RNATranscription bubble转录泡转录泡11Topic 1:RNA Polymerase and The Transcription Cycle12nRNA polymerases performs essentially the same reaction in all cells

7、n从细菌到哺乳动物细胞的从细菌到哺乳动物细胞的RNA聚合酶都聚合酶都是由多个亚基组成的是由多个亚基组成的nBacteria have only a single RNA polymerases while in eukaryotic cells there are three:RNA Pol I,II and III13nRNA Pol II is the focus of eukaryotic transcription,because it is the most studied polymerase,and is also responsible for transcribing mos

8、t genes-indeed,essentially all protein-encoding genes（RNA聚合酶聚合酶II复责转录所复责转录所有蛋白质编码基因）有蛋白质编码基因）nRNA Pol I transcribe the large ribosomal RNA precursor gene（聚合酶（聚合酶I复责转录大核糖体复责转录大核糖体RNA前体基因）前体基因）nRNA Pol III transcribe tRNA gene,some small nuclear RNA genes and the 5S rRNA genes（聚合酶（聚合酶III负责转录负责转录tRNA基基

9、因以及因以及5S rRNA 基因）基因）14Table 12-1:The subunits of RNA polymerases（RNA聚合酶的亚基）聚合酶的亚基）15The bacterial RNA polymeraseThe core enzyme alone synthesizes RNA细菌细菌RNA聚合酶的聚合酶的核心酶核心酶可以独立合成可以独立合成RNA（由由 亚基的两亚基的两个拷贝，个拷贝，亚基各一个拷贝组成）亚基各一个拷贝组成）16 RPB3RPB11RPB2RPB1RPB6Fig 12-2 RNAP ComparisonThe same color indicate the

10、 homologous of the two enzymesprokaryoticeukaryotic ，亚基与亚基与RPB1，RPB2同源同源 亚基与亚基与RPB3，RPB11同源同源 亚基与亚基与RPB6同源同源n细菌细菌RNA聚合酶的聚合酶的，亚基与亚基与RNA聚聚合酶合酶II的的RPB1，RPB2是同源的是同源的n细菌细菌RNA聚合酶的聚合酶的 亚基与亚基与RNA聚合酶聚合酶II的的RPB3，RPB11是同源的是同源的n细菌细菌RNA聚合酶的聚合酶的 亚基与亚基与RNA聚合酶聚合酶II的的RPB6是同源的是同源的18“Crab claw（蟹爪）（蟹爪）”shape of RNAP Ac

11、tive center cleft(活性中心裂隙）活性中心裂隙）n每一个酶的形状像一只蟹爪每一个酶的形状像一只蟹爪n蟹爪的两个钳子主要是由酶的两个最大亚蟹爪的两个钳子主要是由酶的两个最大亚基组成（细菌：基组成（细菌：，亚基，真核生物：亚基，真核生物：RPB1，RPB2亚基）亚基）n酶的活性位点是由这两个亚基的一些区域酶的活性位点是由这两个亚基的一些区域共同组成的，活性位点可以结合两个共同组成的，活性位点可以结合两个Mg2+20There are various channels allowing DNA,RNA and ribonucleotides(rNTPs)into and out of

12、 the enzymes active center cleft有多种通道允许有多种通道允许DNA，RNA,rNTP进出这些酶进出这些酶的活性中心裂隙的活性中心裂隙21nInitiationnElongationnTermination转录起始转录起始转录延伸转录延伸转录终止转录终止231.InitiationnPromoter（启动子）（启动子）:the DNA sequence that initially binds the RNA polymerase 启动子是最初结合启动子是最初结合RNA聚合酶的聚合酶的DNA序列序列nThe structure of promoter-polyme

13、rase complex undergoes structural changes to proceed transcription 启动子启动子-聚合酶复合体一旦形成就发生结构改变，以使转录过聚合酶复合体一旦形成就发生结构改变，以使转录过程继续进行程继续进行nDNA at the transcription site unwinds and a“bubble”forms DNA在转录将要开始的部位展开，碱基对断裂，产生一个单在转录将要开始的部位展开，碱基对断裂，产生一个单链链DNA的的“泡泡”nDirection of RNA synthesis occurs in a 5-3 direct

14、ion(3-end growing)转录总是从转录总是从5端向端向3端的方向进行的，但是只有一条链作为端的方向进行的，但是只有一条链作为模板来合成模板来合成RNA链链 启动子的选择决定了哪一段启动子的选择决定了哪一段DNA将转录，这也是对转录进行将转录，这也是对转录进行调控的主要步骤调控的主要步骤241.Forming closed complex（形成（形成闭合式复合体）闭合式复合体）2.Forming open complex（形成开（形成开放式复合体）放式复合体）3.Promoter escape:stable ternary complex（启动子逃离，形（启动子逃离，形成稳定的成稳定

15、的三重复合体三重复合体-酶，酶，DNA和和RNA，向延伸阶段的转变），向延伸阶段的转变）25Fig 12-3-initiationBinding(closed complex)Promoter“melting”(open complex)Initial transcription26 nThe initial binding of polymerase to a promoter nDNA remains double stranded（DNA保持双链状态）保持双链状态）nThe enzyme is bound to one face of the helix（聚合（聚合酶结合在酶结合在DNA

16、双螺旋的一个面上）双螺旋的一个面上）Closed complex（闭合式复合体）（闭合式复合体）27Open complex（开放式复合体）（开放式复合体）n闭合式复合体向开放式复合体的转变闭合式复合体向开放式复合体的转变nthe DNA strand separate over a distance of 14 bp(-11 to+3)around the start site(+1 site)DNA双链在转录起始位点周围大约双链在转录起始位点周围大约14bp的距离内分开以形成转录泡的距离内分开以形成转录泡ntranscription bubble（转录泡）（转录泡）forms nDNA的展

17、开使模板链得以释放。头两个核糖的展开使模板链得以释放。头两个核糖核苷酸被带入活性位点，排列在模板链上，核苷酸被带入活性位点，排列在模板链上，并彼此结合并彼此结合n然后聚合酶开始沿着模板链移动，解开聚合然后聚合酶开始沿着模板链移动，解开聚合反应位点前方的反应位点前方的DNA双螺旋并允许其在后面双螺旋并允许其在后面重新闭合重新闭合n最初大约最初大约10个左右的核糖核苷酸的结合是一个左右的核糖核苷酸的结合是一个效率相当低的过程，在这一阶段聚合酶常个效率相当低的过程，在这一阶段聚合酶常释放出很短的转录物（每一个都短于释放出很短的转录物（每一个都短于10个左个左右的核苷酸），然后重新开始合成右的核苷酸）

18、，然后重新开始合成n一旦超过一旦超过10个个bp,聚合酶就可以逃离启动子聚合酶就可以逃离启动子29Stable ternary complexnThe enzyme escapes from the promoternThe transition to the elongation phase（起始阶段向延伸阶段的转变）（起始阶段向延伸阶段的转变）nStable ternary complex（稳定的三（稳定的三重复合体）重复合体）=DNA+RNA+enzyme（RNA聚聚合酶）合酶）302.ElongationnOnce the RNA polymerase has synthesized

19、a short stretch of RNA(10 nt),transcription shifts into the elongation phasenThis transition requires further conformational change in polymerase that leads it to grip the template more firmly.需要聚合酶构象的进一步改变，以使其能够需要聚合酶构象的进一步改变，以使其能够更牢固地与模板结合更牢固地与模板结合n延伸阶段延伸阶段RNA聚合酶的功能聚合酶的功能:nsynthesis RNA（催化（催化RNA合成）

20、合成）nunwinds the DNA in front,re-anneals it behind（解开前方的（解开前方的DNA，又使后方的，又使后方的DNA重新复性）重新复性）ndissociates the growing RNA chain （在移动的同时，逐步分开正在延长的（在移动的同时，逐步分开正在延长的RNA链与链与模板的配对）模板的配对）n执行校对功能执行校对功能323.TerminationnAfter the polymerase transcribes the length of the gene(or genes),it will stop and release the

21、 RNA transcript （一旦完成转录，必须释放（一旦完成转录，必须释放RNA产物）产物）nIn some cells,termination occurs at the specific and well-defined DNA sequences called terminators（终止序列）（终止序列）.Some cells lack such termination sequencesFig 12-3-Elongation and terminationTerminationElongation34Topic 2The transcription cycle in bacte

22、ria（细菌的转录周期）（细菌的转录周期）35n原则上，细菌的核心原则上，细菌的核心RNA聚合酶可以在聚合酶可以在DNA上任何一点开始转录上任何一点开始转录n但是在细胞内，聚合酶只在启动子处起始但是在细胞内，聚合酶只在启动子处起始转录转录why?n一个称为一个称为s s因子因子的添加，使得核心酶转变为的添加，使得核心酶转变为只在启动子处开始转录的形式只在启动子处开始转录的形式-RNA聚合聚合酶全酶（酶全酶（36Figure 12-4,In cell,RNA polymerase initiates transcription only at promoters.Who confers the

23、polymerase binding specificity?-factor factor37 nThe predominant s s factor in E.coli is s s70(大肠杆菌中最常见的大肠杆菌中最常见的s s因子因子-s-s70）nPromoter recognized by s s70 contains two conserved sequences(-35 and 10 regions/elements)separated by a non-specific stretch of 17-19 nt -35区，区，-10区区nPosition+1 is the tra

24、nscription start site（转录起始位点转录起始位点定义为定义为+1）Promoters recognized by E.coli s s factor38Fig 12-5a:bacterial promoterThe distance is conserved1.1.s s70 promoters contain recognizable 35 and 10 regions,but the sequences are not identical2.Comparison of many different promoters derives the consensus sequ

25、ences（共有序列）（共有序列）reflecting preferred 10 and 35 regions 通过对许多不同启动子的比较，可以得到一个共有序通过对许多不同启动子的比较，可以得到一个共有序列，列，共有序列共有序列反映了首选的反映了首选的-10和和-35区域，被最适宜区域，被最适宜 的长度（的长度（17bp)所分隔所分隔39BOX 12-1 Figure 1Consensus sequence of the-35 and-10 regionTTGACATATAATn-35 element(-35 box):TTGACAn-10 element(-10 box):TATAAT413

26、.Promoters with sequences closer to the consensus are generally“stronger”than those match less well.(What does“stronger”mean?)（具有与共有序列更近似的序列的启动子要比那些匹（具有与共有序列更近似的序列的启动子要比那些匹配较差的启动子配较差的启动子“更强更强”）4.The strength of the promoter describes how many transcripts it initiates in a given time.（启动子强度启动子强度指一个启动

27、子在一定时间内可以起始多指一个启动子在一定时间内可以起始多少个转录物）少个转录物）5.决定启动子强度因素：决定启动子强度因素：启动子最初与聚合酶的结合程度启动子最初与聚合酶的结合程度 对异构化作用的支持效率对异构化作用的支持效率 聚合酶逃离启动子的难易程度聚合酶逃离启动子的难易程度42Fig 12-5b bacterial promoterConfers additional specificityUP-element（UP元件）元件）is an additional DNA elements that increases polymerase binding by providing the

28、 additional interaction site for RNA polymerase在较强启动子中（如指导在较强启动子中（如指导rRNA基因表达的启动子）存在基因表达的启动子）存在一种额外的与一种额外的与RNA聚合酶结合的聚合酶结合的DNA元件元件-UP元件元件UP元件可以通过提供额外的相互作用位点来增强元件可以通过提供额外的相互作用位点来增强RNA聚聚合酶与合酶与DNA的结合的结合43Fig 12-5c bacterial promoterAnother class of s s70 promoter lacks a 35 region and has an“extended 10

29、 element”（延长的（延长的-10元件）元件）compensating for the absence of 35 region结合自己博士阶段的研究工作讲解启动子的结构与功能结合自己博士阶段的研究工作讲解启动子的结构与功能n本人博士阶段课题：本人博士阶段课题：来源于嗜盐古生菌的来源于嗜盐古生菌的RM07 DNA片段在三域模式生物中的启动子片段在三域模式生物中的启动子功能研究功能研究n导师：沈萍教授（武汉大学）导师：沈萍教授（武汉大学）2022-10-2446Woese三域(Domain)分类系统n三域生物的系统发育树：Woese首先提出了生命的第三种形式-古生菌（Archaea），并将

30、地球上的生物划分为三域（domain）：真细菌（Bacteria）、古生菌(Archaea)和真核生物(Eukarya)古生菌域可分为三界：古生古菌界（古生菌域可分为三界：古生古菌界（Korarchaeota）、泉古生菌）、泉古生菌界（界（Crenarchaeota）、广古生菌界（）、广古生菌界（Euryarchaeota）一般生活在其它生物难以存活的极端环境中，如高温（一般生活在其它生物难以存活的极端环境中，如高温（100以以上）、高酸（上）、高酸（pH14）、高碱（）、高碱（pH1012）、高盐（）、高盐（2.55.2M）以及厌氧环境等，极端环境微生物以及厌氧环境等，极端环境微生物古生菌的

31、分类古生菌的分类(一）一）类似于真细菌的特征：类似于真细菌的特征：原核生物，细胞内无定型细胞核，细胞形态和大原核生物，细胞内无定型细胞核，细胞形态和大小类似于真细菌小类似于真细菌双链闭合环状染色体结构，许多功能上相关的基双链闭合环状染色体结构，许多功能上相关的基因组成一个共转录的操纵元结构因组成一个共转录的操纵元结构基因组大小一般在基因组大小一般在1.5-4.0106 bp范围内，大小和范围内，大小和组织结构类似于真细菌组织结构类似于真细菌二分分裂的方式进行繁殖二分分裂的方式进行繁殖代谢途径类似于真细菌代谢途径类似于真细菌古生菌奇妙的融合生命特征古生菌奇妙的融合生命特征（二）类似于真核生物的特

32、征：（二）类似于真核生物的特征：DNA复制、复制、转录和翻译等遗传信息传递系统转录和翻译等遗传信息传递系统DNA复制装置类似于真核生物，许多参与复制复制装置类似于真核生物，许多参与复制的蛋白质都与真核生物的同功能蛋白质具有同的蛋白质都与真核生物的同功能蛋白质具有同源性和相似性源性和相似性基本转录装置（包括基本转录装置（包括RNA聚合酶、基本转录因聚合酶、基本转录因子、子、启动子元件等）也与真核生物非常类似启动子元件等）也与真核生物非常类似翻译起始蛋白质因子与真核生物的相关蛋白质翻译起始蛋白质因子与真核生物的相关蛋白质具有同源性，氨酰具有同源性，氨酰tRNA合成酶也更接近于真核合成酶也更接近于真

33、核生物生物随着越来越多的古生菌全基因组序列的测随着越来越多的古生菌全基因组序列的测定和体外转录系统的建立，人们在分子水定和体外转录系统的建立，人们在分子水平上对于古生菌的转录机制及其调控有了平上对于古生菌的转录机制及其调控有了更加全面深入的认识更加全面深入的认识古生菌实际上既具有类似于真核生物的基古生菌实际上既具有类似于真核生物的基本转录装置，又具有类似于真细菌的转录本转录装置，又具有类似于真细菌的转录调控机制（调控机制（Bell et al.,2001)。古生菌转录系统的融合特征古生菌转录系统的融合特征启动子（启动子（promoter)三域生物的启动子结构比较三域生物的启动子结构比较来源于嗜

34、盐古生菌基因组的来源于嗜盐古生菌基因组的492bp RM07 492bp RM07 片段的片段的DNA DNA 序列及其序列及其结构特征。结构特征。含有典型的真细菌启动子含有典型的真细菌启动子-35-35和和-10-10区特征序列和区特征序列和3 3个串联排列个串联排列的嗜盐古生菌启动子特征序列的嗜盐古生菌启动子特征序列DPEDPE（distal promoter distal promoter elementelement）。）。RM07RM07片段在真细菌（大肠杆菌）中的启动子功能研究片段在真细菌（大肠杆菌）中的启动子功能研究（一）（一）RM07RM07片段以正反两个方向插入片段以正反两个

35、方向插入pKK232-8pKK232-8上携带的上携带的 氯霉素抗性基因（氯霉素抗性基因（cat）上游的质粒的构建）上游的质粒的构建大肠杆菌启动子探针载体大肠杆菌启动子探针载体pKK232-8pKK232-8（三）三种转化子菌株中（三）三种转化子菌株中氯霉素抗性基因（氯霉素抗性基因（catcat）的表达检测）的表达检测I 氯霉素抗性检测氯霉素抗性检测Cm:0g/mlCm:25g/mlCm:250g/ml三种转化子菌株：三种转化子菌株：HB101/pKK232-8、HB101/pKK232-07-1(+)和和HB101/pKK232-07-1(-)的氯霉素抗性检测。的氯霉素抗性检测。Cm:氯霉素

36、。氯霉素。1：HB101/pKK232-07-1(+)2：HB101/pKK232-83：HB101/pKK232-07-1(-)II 氯霉素抗性基因（氯霉素抗性基因（cat）所编码的氯霉素乙酰转移酶）所编码的氯霉素乙酰转移酶 （CAT）酶蛋白浓度的测定）酶蛋白浓度的测定 HB101/pKK232-8、HB101/pKK232-07-1(-)菌株中均未能检测到菌株中均未能检测到CAT酶蛋白酶蛋白 HB101/pKK232-07-1(+)菌株产生的菌株产生的CAT酶蛋白浓度为酶蛋白浓度为 2.55 ng/ml总总RNARNA提取。提取。A:Total RNA not digested by DN

37、ase；B,C:Total RNA digested by DNase。23S rRNA16S rRNA5S rRNAABCIII III 利用利用RT-PCRRT-PCR技术检测转化子菌株中技术检测转化子菌株中catcat基因的转录基因的转录RT-PCRRT-PCR检测大肠杆菌转化子菌株中检测大肠杆菌转化子菌株中catcat基因的转录。基因的转录。结果表明结果表明RM07片片段在大肠杆菌中具有启动子活性，能够启动段在大肠杆菌中具有启动子活性，能够启动cat基因的转录。基因的转录。泳道泳道a a：DL2000 DNA markerDL2000 DNA marker泳道泳道b:HB101/pKK

38、232-07-1b:HB101/pKK232-07-1（+）泳道泳道c:HB101/pKK232-8c:HB101/pKK232-8（阴性对照）（阴性对照）III III 利用利用RT-PCRRT-PCR技术检测转化子菌株中技术检测转化子菌株中catcat基因的转录基因的转录RM07RM07片段的缺失突变分析片段的缺失突变分析来源于嗜盐古生菌基因组的来源于嗜盐古生菌基因组的492bp RM07 492bp RM07 片段的片段的DNA DNA 序列及其序列及其结构特征。结构特征。含有典型的真细菌启动子含有典型的真细菌启动子-35-35和和-10-10区特征序列和区特征序列和3 3个串联排列个串

39、联排列的嗜盐古生菌启动子特征序列的嗜盐古生菌启动子特征序列DPEDPE（distal promoter distal promoter elementelement）。）。（一）（一）RM07RM07片段在大肠杆菌（真细菌）中的缺失突变分析片段在大肠杆菌（真细菌）中的缺失突变分析 RM07RM07不同缺失片段插入不同缺失片段插入catcat基因上游的质粒的构建基因上游的质粒的构建PCRPCR反应得到一系列含有反应得到一系列含有RM07RM07片段不同区域的缺失片段片段不同区域的缺失片段1bp355bp395bp492bp492bp RM07 fragmentE.coli plasmid165b

40、pCm resistance level(g ml-1)pKK232-07-1250 50 DPE II-10 boxpKK232-07-4200 4pKK232-07-34DPE IDPE IIICm:Cm:氯霉素氯霉素pKK232-07-5-35 boxpKK232-07-2缺失分析结果小结缺失分析结果小结含有含有-35-35区和区和-10-10区特征序列的区特征序列的40 bp40 bp区段区段(355 bp-395 bp)(355 bp-395 bp)是是RM07RM07片段在大片段在大 肠杆菌中具有基础启动子活性的重要功能区。肠杆菌中具有基础启动子活性的重要功能区。RM07RM07片

41、段的定点诱变分析片段的定点诱变分析pKK232-07-350 pKK232-07-35-225pKK232-07-35-4600TTGTCATAGGGT355bp395bp492bp-35 box-10 boxTGGTCATAGGGT355bp395bp492bpTTGACATAGGGT355bp395bp492bpPlasmid355bp-492bp RM07 fragmentCm resistance (g/ml)RM07RM07片段中片段中-35-35区序列的定点诱变区序列的定点诱变.Cm:.Cm:氯霉素。氯霉素。100 pKK232-07-110pKK232-07-10-2TTGTCA

42、TAGGGT355bp395bp492bp-35 box-10 box1bpTTGTCATCGGGT355bp395bp492bp1bpPlasmid492bp RM07 fragmentCm resistance (g/ml)RM07RM07片段中片段中-10-10区序列的定点诱变区序列的定点诱变.Cm:.Cm:氯霉素。氯霉素。Sarkar G,Sommer S S.The megaprimer method of site Directed mutagenesis.Biotechniques,1990,8(4):404 407.Cm resistance (g/ml)TTGTCATAGGG

43、T355bp-35 box-10 box1bppKK232-07-6TTGTCATAGGGT355bp 403bp 1bppKK232-07-PMSTARTPlasmid1bp-404bp RM07 DNA fragment 403bp GT393bp-35 box-10 box300 50404bpRM07RM07启动子可能的转录起始位点的定点诱变启动子可能的转录起始位点的定点诱变.Cm:.Cm:氯霉素。氯霉素。n利用定点诱变技术对利用定点诱变技术对RM07RM07片段中的不同碱基进行了突变，检测了片段中的不同碱基进行了突变，检测了不同碱基突变对不同碱基突变对RM07RM07片段在大肠杆菌中

44、的启动子活性的影响。片段在大肠杆菌中的启动子活性的影响。n进一步确证了根据序列分析所推断的进一步确证了根据序列分析所推断的-35区和区和-10区序列是负责区序列是负责RM07片段在大肠杆菌中启动子活性的重要功能区。片段在大肠杆菌中启动子活性的重要功能区。n初步鉴定了可能的转录起始位点。初步鉴定了可能的转录起始位点。总结总结73s s因子介导聚合酶与启动子的结合）因子介导聚合酶与启动子的结合）nThe s s70 factor comprises four regions called s s region 1 to s s region 474Fig 12-6:regions of s sRe

45、gion 4 recognizes-35 element Region 2 recognizes-10 elementRegion 3 recognizes the extended 10 element区域区域2.3复责复责DNA的解旋的解旋n区域区域4内的两个螺旋形成一个常见的内的两个螺旋形成一个常见的DNA结合基结合基序（序（motif)-螺旋螺旋-转角转角-螺旋（螺旋（helix-turn-helix motif）n其中一个螺旋插入到其中一个螺旋插入到-35区域的大沟（区域的大沟（major groove)并与该区的碱基相互作用；另一个螺旋并与该区的碱基相互作用；另一个螺旋则从大沟的顶

46、部横过，与则从大沟的顶部横过，与DNA骨架接触骨架接触n-35区域仅是提供能量以确保聚合酶和启动子结合区域仅是提供能量以确保聚合酶和启动子结合。但是。但是-10区域在转录起始过程中有更为精细的任区域在转录起始过程中有更为精细的任务务n-10区域处在闭合复合体向开放复合体转变时区域处在闭合复合体向开放复合体转变时DNA解旋区。因此与解旋区。因此与-10区域相互作用的区域相互作用的因子因子还参与其它功能。例如：参与识别还参与其它功能。例如：参与识别-10区域的区域的 螺螺旋可以和非模板链上的碱基相互作用，以维持解旋可以和非模板链上的碱基相互作用，以维持解旋旋DNA的稳定性的稳定性76Binding

47、 of 35 Two helices within region 4 form a common DNA-binding motif,called a helix-turn-helix motifFig 5-20*Helix-turn-helix DNA-binding motifOne helix inserts into the DNA major groove interacting with the bases at the 35 region.The other helix lies across the top of the groove,contacting the DNA ba

48、ckbone77Interaction with 10 is more elaborate(精细精细)and less understood nThe-10 region is within DNA melting regionnThe helix recognizing 10 can interacts with bases on the non-template strand to stabilize the melted DNA.78UP-element is recognized by a carboxyl terminal domain of the -subunit(CTD),bu

49、t not by s s factor与启动子内的其它元件不同，与启动子内的其它元件不同，UP元件并不被元件并不被s s因子识别，因子识别，而是由而是由聚合酶聚合酶 亚基的羧基末端域（亚基的羧基末端域（CTD)来识别来识别Fig 12-7 s s and subunits recruit RNA pol core enzyme to the promoter（s s 和和 亚基将亚基将RNA聚合酶核心酶募集到启动子上）聚合酶核心酶募集到启动子上）n如何证明如何证明UP元件元件由聚合酶由聚合酶 亚基的羧亚基的羧基末端域（基末端域（CTD)来识别的？来识别的？n研究思路？学习和借鉴！研究思路？学习

50、和借鉴！研究论文（原始研究工作）的学习研究论文（原始研究工作）的学习nA third recognition element in bacterial promoters:DNA binding by the alpha subunit of RNA polymerase Science，1993，262：1407-1413 强启动子：强启动子：rrnB P1基因启动子，克隆到质粒上基因启动子，克隆到质粒上88：-88到到+1位之间的野生型序列（包含位之间的野生型序列（包含UP）SUB：在：在-59到到-41位之间含有取代位之间含有取代UP元件的无关序列元件的无关序列41：缺失：缺失-41位的