花卉分子生物学复习课课件.ppt

1、考试题型：考试题型：一、名词解释（每题一、名词解释（每题3分，共分，共24分）分）二、单项选择题（每题二、单项选择题（每题1.5分，共分，共15分）分）三、判断题（每题三、判断题（每题1分，共分，共10分）分）四、简答题（每题四、简答题（每题6分，共分，共36分）分）五、论述题五、论述题（每题（每题15分，共分，共15分）分）考试成绩考试成绩60%，平时成绩，平时成绩40%第一、二章第一、二章 遗传的物质基础遗传的物质基础n染色体的结构染色体的结构n遗传物质的本质及证明遗传物质的本质及证明n核酸的化学组成及理化性质核酸的化学组成及理化性质染色质的基本结构单元染色质的基本结构单元核小体核小体 n

2、uclesome8个组蛋白分子组成核小个组蛋白分子组成核小体的核心体的核心DNA在八聚体缠绕在八聚体缠绕1.75圈，大约圈，大约146bp组蛋白组蛋白H1结合在结合在DNA分分子的出口和入口处子的出口和入口处染色体的结构染色体的结构DNA是遗传物质的直接证据是遗传物质的直接证据1.肺炎双球菌感染实验肺炎双球菌感染实验（Griffith,1928）2.噬菌体感染实验噬菌体感染实验（Hershey and Chase，1952）3.烟草花叶病毒烟草花叶病毒(TMV)感染试验感染试验核酸的化学组成及理化性质核酸的化学组成及理化性质结构单位：核苷酸（五碳糖、碱基、磷酸）结构单位：核苷酸（五碳糖、碱基、

3、磷酸）DNA的二级结构的二级结构结构要点：结构要点：反向平行反向平行;碱基配对碱基配对;碱基距离为碱基距离为0.34nm;螺距为螺距为3.4nm。核酸的杂交核酸的杂交 核酸分子杂交：具有互补序列（或某一区段互补）的两条多核苷酸链，通过碱基互补配对形成稳定的双链分子的过程。Northern、Southern、Western第三章第三章 DNADNA的生物合成的生物合成u 复制体系复制体系u 复制的过程（起始、延伸、终止）复制的过程（起始、延伸、终止）u 体外复制体外复制PCRPCR技术简介技术简介复制体系复制体系 底物底物:dATP,dGTP,dCTP,dTTP:dATP,dGTP,dCTP,d

4、TTP 聚合酶聚合酶:依赖依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶 （DNA-polDNA-pol）模板模板:解开成单链的解开成单链的DNADNA母链母链 引物引物:提供提供3 3-OH-OH末端使末端使dNTPdNTP可以依次聚合可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子DNADNA连接酶连接酶螺旋酶螺旋酶DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶单链结合蛋白单链结合蛋白参与参与DNA复制的酶复制的酶与蛋白因与蛋白因子总览图子总览图n催化催化53方向合成多聚核苷酸方向合成多聚核苷酸 n 3 5核酸外切酶活性：使酶能从刚合成的核酸外切酶活性：使酶能从刚合成的链的链的3末端切下核苷酸末端切

5、下核苷酸校读校读n核酸外切酶活性：从合成的链中去除一部分核酸外切酶活性：从合成的链中去除一部分已经和模板结合的核苷酸，这一功能主要存已经和模板结合的核苷酸，这一功能主要存在于细菌在于细菌DNA复制后的滞后链过程中不连接复制后的滞后链过程中不连接DNA片段的连接过程中片段的连接过程中DNADNA聚合酶的聚合酶的三种活性：三种活性：DNA polymerase DNA polymerase 基本功能基本功能 聚合酶链反应简称聚合酶链反应简称PCR，是一项在短时，是一项在短时间内大量扩增特定的间内大量扩增特定的DNA片段的分子生物片段的分子生物学技术。学技术。基因的体外复制基因的体外复制PCRPCR

6、技术技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR(polymerase chain reaction,PCR）模板模板引物引物dNTP Mg2+Taq DNA聚合酶聚合酶变性变性延伸延伸退火退火第四章第四章 转录转录 转录：转录：以以DNA为模板，在为模板，在RNA聚合酶的作用下合成聚合酶的作用下合成mRNA，将遗传信息从，将遗传信息从DNA分子上转移到分子上转移到mRNA分子上，分子上，这一过程称为转录。这一过程称为转录。参与转录的物质参与转录的物质原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶其他蛋白质因子RN

7、A合成方向合成方向：53二、参与转录起始的关键酶与元件二、参与转录起始的关键酶与元件（一）RNA聚合酶原核生物RNA聚合酶（大肠杆菌为例）（二）（二）启动子启动子(promoter)启动子定义：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。41-44bp原核生物启动子原核生物启动子保守序列保守序列 n转录起点转录起点n-1010区（区（PribnowPribnow框）框）T80A95T45A60a50T96n-3535区（区（SextamaSextama框）框）T84T84G78A65C54a456bpCATTATAATTTGACA1520bp-10元件元件-35元件元件-1+1

8、+30（一）转录起始复合物三、转录的基本过程：起始、延伸、终止 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。核心酶核心酶 DNA RNA（二）转录延伸 终止子（terminator，t）强终止子内部终止子 弱终止子 需要因子（rho factor）又称为依赖性终止子 （Rho-dependent terminator）不依赖Rho()因子的转录终止依赖Rho()因子的转录终止（三）转录终止四、转录后加工mRNA转录后加工原核生物原核生物mRNAmRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行转录后一般不需要加工，转

9、录的同时即进行翻译。亦有少数多顺反子的翻译。亦有少数多顺反子的mRNAmRNA需要核酸酶切成小单位，需要核酸酶切成小单位，然后再翻译。然后再翻译。真核生物真核生物mRNAmRNA原初转录物很大，在加工过程中形原初转录物很大，在加工过程中形成许多分子大小不等的中间物，称为核内不均一成许多分子大小不等的中间物，称为核内不均一RNARNA（hnRNA)hnRNA)，需要进一步进行加工修饰转化为，需要进一步进行加工修饰转化为mRNAmRNA。加工包括：加工包括：（1 1）hnRNAhnRNA被剪接，剪掉内含子被剪接，剪掉内含子（DNADNA上非编码序列）上非编码序列）转录序列，拼接外显子转录序列，拼接

10、外显子（DNADNA上的编码序列）上的编码序列）转录序列。转录序列。（2 2）33端添加端添加polyA“polyA“尾巴尾巴”；（3 3）55端连接端连接“帽子帽子”结构（结构（m m7 7G G5 5 pppppp5 5 NmpNp-NmpNp-）五、原核生物与真核生物五、原核生物与真核生物mRNAmRNA的特征比较的特征比较1、原核生物mRNA的特征 半衰期短 多以多顺反子的形式存在 多顺反子mRNA：编码多个蛋白质的mRNA。单顺反子mRNA：只编码一个蛋白质的mRNA。5 端无“帽子”结构，3 端没有或只有较短的poly（A）结构。SD序列：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。2

11、、真核生物mRNA的特征l 5 端存在“帽子”结构l 多数mRNA 3 端具有poly（A）尾巴（组蛋白除外）l 以单顺反子的形式存在 反转录反转录PCR：是将：是将RNA的反转录（的反转录（RT）和和cDNA的聚合酶链扩增（的聚合酶链扩增（PCR）相结合的）相结合的技术。主要用于基因表达的检测。技术。主要用于基因表达的检测。mRNA简并性简并性通用性通用性连续性连续性摇摆性摇摆性 每每3个核苷酸为一组，对应一个氨基个核苷酸为一组，对应一个氨基酸，叫做一个密码子（酸，叫做一个密码子（codon)。起始密码子：起始密码子：AUG GUG;终止密码子终止密码子:UAA UAG UGA一、一、DNA

12、与遗传密码与遗传密码（一）（一）mRNAmRNA是蛋白质生物合成的模板是蛋白质生物合成的模板起始密码子：起始密码子：AUGAUG终止密码子：终止密码子：UAA,UGA,UAGUAA,UGA,UAG编码区编码区非编码区非编码区开放读框（开放读框（open reading frame,ORFopen reading frame,ORF）二、二、3种种RNA分子分子（二）（二）tRNAtRNA转运氨基酸转运氨基酸（二）（二）tRNAtRNA转运氨基酸转运氨基酸通过密码子与反密码子的相互作用通过密码子与反密码子的相互作用 碱基互补碱基互补 配对原则配对原则 tRNA tRNA的功能的功能真核生物：游离

13、核糖体或与内质网结合真核生物：游离核糖体或与内质网结合原核生物：游离核糖体或与原核生物：游离核糖体或与mRNAmRNA结合结合成串状的多核糖体成串状的多核糖体（三）核糖体（三）核糖体(rRNA)(rRNA)蛋白质合成场所蛋白质合成场所l三种三种RNA：mRNA、tRNA、rRNAl原料：原料：20种种aal需要酶及众多蛋白因子、需要酶及众多蛋白因子、ATP、GTP等等l蛋白质合成方向：蛋白质合成方向：N端端C端端lmRNA的翻译方向：的翻译方向：53（一）蛋白质合成的一般特征（一）蛋白质合成的一般特征（二）蛋白质生物合成的过程（二）蛋白质生物合成的过程两个前提：两个前提：氨基酸活化氨基酸活化核

14、糖体解离核糖体解离l进位进位l成肽成肽l转位转位（三）肽链的延伸（三）肽链的延伸1950年，发现玉米粒的颜色经常发生变化认为：一种控制基因在玉米基因组中移动的结果移动基因移动基因(movable genens)(movable genens)指可在DNA分子间进行转移的DNA片段。也叫跳跃基因(jumping genes)。DNA-RNA方式转座子方式转座子DNA-DNA方式转座子方式转座子基因家族基因家族l基因家族（基因家族（multigene family）指）指DNA序列具有较高的同源序列具有较高的同源性（通常大于性（通常大于50%），并且其编码产物具有相同或相似生理），并且其编码产物具

15、有相同或相似生理功能的一组结构基因。功能的一组结构基因。l 直系同源（直系同源（orthology）是指不同物种内的同源序列，它们）是指不同物种内的同源序列，它们来源于物种形成时的共同祖先基因。来源于物种形成时的共同祖先基因。l 旁系同源（旁系同源（paralogy）基因是指同一基因组（或同一物种的）基因是指同一基因组（或同一物种的基因组）中，由于始祖基因的加倍而横向基因组）中，由于始祖基因的加倍而横向/水平方向水平方向（horizontal）产生的几个同源基因。）产生的几个同源基因。RNAmRNA外显子1外显子2外显子3内含子1内含子2DNA剪切断裂基因断裂基因 指基因的编码序列在DNA分子

16、上是不连续排列的，而是被不编码的序列所隔开。真核生物基因组真核生物基因组真核生物的基因组l定义：一个物种的单倍体的染色体数目称为该物种的基因组。l基因组的大小（C值）：一个基因组含有的碱基总数。l表达序列、重复序列和非编码序列。高等生物具有比低等生物更复杂的生命活动，所以，理论上应该是它们的C值也应该更高。但是事实上C值没有体现出与物种进化程度相关的趋势。高等生物的C值不一定就意味着它的C值高于比它低等的生物。这种生物学上的DNA总量的比较和矛盾，称为C值悖论。1.1.真核生物基因组都是由大分子双链线状真核生物基因组都是由大分子双链线状DNADNA构成。染色体通常成对出现（双倍体）。构成。染色

17、体通常成对出现（双倍体）。2.2.基因组非常庞大，结构非常复杂，有多个复基因组非常庞大，结构非常复杂，有多个复制起始位点。制起始位点。3.3.基因组中存在大量的重复序列以及非编码序基因组中存在大量的重复序列以及非编码序列。在一定程度上也是生物进化的标尺。列。在一定程度上也是生物进化的标尺。4.4.真核生物基因组中也存在一些可移动的真核生物基因组中也存在一些可移动的DNADNA序列（转座元件）。序列（转座元件）。真核生物基因组的特点真核生物基因组的特点微卫星微卫星DNA（satellite DNA）l其重复单位为其重复单位为25 bp，存在于常染色体，常见，存在于常染色体，常见于内含子中。于内含

18、子中。l人类基因组人类基因组DNA中平均每中平均每610kb就有一个就有一个STR位点位点。不同个体之间在一个同源。不同个体之间在一个同源STR位点位点的重复次数不同。的重复次数不同。由于重复单位及重复次数不由于重复单位及重复次数不同，使其在不同种族，不同人群之间的分布具同，使其在不同种族，不同人群之间的分布具有很大差异性，构成了有很大差异性，构成了STR遗传多态性。遗传多态性。(CA)n和(TG)n：核心序列结构相同，重复单位数目10-60个第七章第七章 真核生物基因表达真核生物基因表达的调控的调控DNA水平上的调控水平上的调控染色质水平上的调控染色质水平上的调控转录水平的调控转录水平的调控

19、转录后调控转录后调控翻译后调控翻译后调控真核基因表达调控的顺式作用元件真核基因表达调控的顺式作用元件l 顺式作用元件顺式作用元件(cis-acting element)是指是指DNA分子分子上对基因表达有调节活性的特定核苷酸序列。上对基因表达有调节活性的特定核苷酸序列。l 顺式作用元件多位于基因上游或内含子中，只顺式作用元件多位于基因上游或内含子中，只影响同一影响同一DNA分子上的基因。分子上的基因。l 真核基因的顺式作用元件按其功能可以分为：真核基因的顺式作用元件按其功能可以分为：启动子启动子,增强子增强子,静止子静止子1.1.转录水平的调控转录水平的调控 l组成型启动子组成型启动子 组成型

20、启动子在所有组织中都能启动基因的表达。l组织特异型启动子组织特异型启动子l诱导型启动子诱导型启动子 所谓诱导型启动子就是在某些特定的物理或化学的刺激下，此种启动子可以大幅度地提高基因的转录水平，因此，亦称为诱导型调节序列或诱导型增强子启动子类型及应用研究启动子类型及应用研究反式作用因子反式作用因子 反式作用因子（反式作用因子（trans-acting factor）指一）指一些与基因表达调控有关的蛋白质因子。真核些与基因表达调控有关的蛋白质因子。真核生 物 反 式 作 用 因 子 通 常 指 转 录 因 子生 物 反 式 作 用 因 子 通 常 指 转 录 因 子（transcription

21、factor，TF）。反式作用因子）。反式作用因子与顺式作用元件之间的共同作用，才能够达与顺式作用元件之间的共同作用，才能够达到对特定基因进行调控的目的。到对特定基因进行调控的目的。特异转录因子(special transcription factors)能够选择性调控某种或某些基因转录表达的蛋白质因子称为特异性转录因子.为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。一般转录因子特殊转录因子转录调节因子结构DNA结合域转录激活域TF蛋白质-蛋白质结合域二聚化结构域与RNA聚合酶结合与顺式元件识别、结合2.DNA水平的调控水平的调控 DNA水平上的调控是通过改变基因水平上的调控是通过改

22、变基因组中有关基因的数量和结构顺序而控制组中有关基因的数量和结构顺序而控制基因的表达。基因的表达。l 基因扩增基因扩增l 基因重排基因重排l DNA的甲基化的甲基化DNA的甲基化的甲基化 指在 DNA 甲基转移酶(DNMTs)的作用下，以 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基添加在 DNA分子中的碱基上。l DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率从而引起基因的失活。l 活跃表达的基因都是甲基化不足的基因。表达活性与甲基化程度呈负相关。甲基化可以调控基因表达3.染色质水平的调控 组蛋白质修饰 组蛋白的乙酰化和基因

23、表达的状态相关。被组蛋白覆盖的基因如果要表达，首先要改变组蛋白的修饰状态，使其与DNA的结合由紧变松，这样靶基因才能与转录复合物相互作用。因此，组蛋白是重要的染色体结构维持单元和基因表达的负控制因子。4.转录后调控转录后调控l mRNA剪接剪接l RNA干扰干扰l microRNA(1)mRNA的剪接的剪接l 大多数真核生物基因是不连续的，外显子与大多数真核生物基因是不连续的，外显子与内含子相间排列内含子相间排列l 而转录的时候外显子和内含子是一起转录的而转录的时候外显子和内含子是一起转录的l 转录以后必须降内含子切除，才能形成成熟转录以后必须降内含子切除，才能形成成熟的的mRNA分子分子l

24、这个过程成为内含子的剪接（这个过程成为内含子的剪接（splicing）可变剪接可变剪接l同一初级转录产物同一初级转录产物通过不同的剪接方通过不同的剪接方式，形成不同的成式，形成不同的成熟熟mRNA分子。分子。选择性剪接的不同形式深蓝：均保留的exon;浅蓝：仅在一个mRNA 中 保留的exon;黄色：intron;红线：被剪切去的区域。（2）RNA干扰干扰 一些小的双链一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体可以高效、特异地阻断体内特定基因表达，促使内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型现出特定基因缺失的表型,称为称为RNA干扰干扰(RNA inte

25、rference,RNAi，也译作，也译作RNA干预或者干涉或干预或者干涉或者沉默者沉默)。（3）microRNAlmiRNA是广泛存在于真核生物中的一组短小的、是广泛存在于真核生物中的一组短小的、不编码蛋白质的不编码蛋白质的RNA家族，它们是由家族，它们是由19-25个核苷个核苷酸组成的单链酸组成的单链RNA；l类似于类似于siRNA的分子，由高等真核生物基因组编的分子，由高等真核生物基因组编码，码，miRNA通过和靶基因通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉碱基配对引导沉默复合体（默复合体（RISC）降解）降解mRNA或阻碍其翻译。或阻碍其翻译。5.翻译后调控翻译后调控 直接来自核糖体的线状多

26、肽链是没有直接来自核糖体的线状多肽链是没有功能的，必须经过加工、蛋白质折叠才具功能的，必须经过加工、蛋白质折叠才具有活性。有活性。将外源将外源DNA片段运送进宿主细胞进行片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具称为载体。扩增或表达的运载工具称为载体。植物基因工程载体植物基因工程载体l 克隆载体：分离和扩增目的基因使用的载体。克隆载体：分离和扩增目的基因使用的载体。l 转化载体：转化载体：将目的片断导入受体细胞并使之表达将目的片断导入受体细胞并使之表达的载体。的载体。植物基因工程中常用的选择标记和报植物基因工程中常用的选择标记和报告基因告基因一、同源克隆一、同源克隆 根据植物同一类基因存在保守

27、序列的特点，利根据植物同一类基因存在保守序列的特点，利用同源序列分离克隆基因，可以是同种植物也可以用同源序列分离克隆基因，可以是同种植物也可以是不同种植物；或者是根据某种植物中克隆的基因是不同种植物；或者是根据某种植物中克隆的基因序列，分离克隆其它植物同种基因的方法。序列，分离克隆其它植物同种基因的方法。二、基于基因加标签的基因克隆方法：主要是在二、基于基因加标签的基因克隆方法：主要是在生物基因组中插入外源的一段生物基因组中插入外源的一段DNADNA，使生物体产，使生物体产生某种突变表型，然后反过来利用这段外源已知生某种突变表型，然后反过来利用这段外源已知的的DNADNA片段来克隆基因的方法。

28、片段来克隆基因的方法。三、转录组测序（三、转录组测序（Illumina/SolexaIllumina/Solexa测序技术测序技术）四、图位克隆（四、图位克隆（QTLQTL）：）：通过分析目的基因与已通过分析目的基因与已知分子标记的连锁关系来确定目的基因在染色体知分子标记的连锁关系来确定目的基因在染色体上的位置。上的位置。农杆菌参与的植物转化法农杆菌参与的植物转化法鉴定步骤：鉴定步骤：l报告基因鉴定（利用质粒上的报告基因）报告基因鉴定（利用质粒上的报告基因）l遗传鉴定遗传鉴定l生长试验生长试验 DNA鉴定鉴定-southern RNA鉴定鉴定-northern蛋白质鉴定蛋白质鉴定-western谢谢各位同学对谢谢各位同学对花卉分子生物学花卉分子生物学课课程的大力支持！程的大力支持！祝大家毕业季一切顺利、新年快乐！祝大家毕业季一切顺利、新年快乐！