生物大分子进化总结课件.ppt

1、第9章生物大分子进化生物大分子进化1234 56789.1 自然界的生物大分子进化达尔文达尔文(18091882)出生于英国西部一个世代为医的家庭。乘贝出生于英国西部一个世代为医的家庭。乘贝格尔号舰作了历时格尔号舰作了历时5 5年的环球航行，对动植物和年的环球航行，对动植物和地质结构等进行了大量的观察和采集。地质结构等进行了大量的观察和采集。物种进化的两个因素：物种进化的两个因素：优势基因频率增加优势基因频率增加进化进化 自然选择自然选择生物大分子的进化生物大分子的进化RNA世界假说世界假说 1981年度年度诺贝尔化学诺贝尔化学奖获得者吉尔伯特（奖获得者吉尔伯特（W.Gilbert）提出了）提

2、出了“RNA世界世界”的假说。的假说。指的是指的是“在生命起源的某个时期，生命体仅由在生命起源的某个时期，生命体仅由RNA组成。遗传信息的传递建立于组成。遗传信息的传递建立于RNA的复制，的复制，其复制机理与当今其复制机理与当今DNA复制机理相似，作为生物复制机理相似，作为生物催化的、由基因编码的蛋白质还不存在催化的、由基因编码的蛋白质还不存在”。l容易发生突变，因此在携带遗传信息的能力方容易发生突变，因此在携带遗传信息的能力方面，面，RNA不如不如DNA；lRNA又由于组成没有蛋白质复杂，不可能形成又由于组成没有蛋白质复杂，不可能形成如蛋白质那么多样的结构，因此在功能分子的如蛋白质那么多样的

3、结构，因此在功能分子的作用方面，作用方面，RNA又不如蛋白质又不如蛋白质。乔伊斯乔伊斯，Scripps Research Institute 所长所长 发现了一对短小但功能强大的发现了一对短小但功能强大的RNA序列，把序列，把它们和一堆结构更简单的它们和一堆结构更简单的RNA“原料原料”混在一起混在一起.RNA 又是怎么产生的？又是怎么产生的？分子库分子库9.3 生物大分子进化的基本概念和思路生物大分子进化的基本概念和思路目标分子目标分子自然界生物大分子自然界生物大分子放大放大文库分子文库分子筛选目标分子筛选目标分子9.4 分子多样性的建立分子多样性的建立l分子多样性的建立是生物大分子进化的基

4、础。分子多样性的建立是生物大分子进化的基础。DNA9.4.1 基因组的随机突变法基因组的随机突变法基因组的随机突变法缺点基因组的随机突变法缺点 不能实现对特定基因的突变不能实现对特定基因的突变关键关键 突变频率的选择突变频率的选择9.4.2 易错易错PCR l条件条件 具体方法具体方法如提高镁离子浓度、加入锰离子；如提高镁离子浓度、加入锰离子；改变体系中四种的改变体系中四种的dNTPsdNTPs浓度；浓度；运用低保真度运用低保真度DNADNA聚合酶等。聚合酶等。9.4.3 定点诱变定点诱变 在体外特异性地取代、插入或缺失在体外特异性地取代、插入或缺失DNA序序列中任何一个特定碱基的技术。列中任

5、何一个特定碱基的技术。分类：定点突变、盒式定点突变、分类：定点突变、盒式定点突变、PCR突变。突变。定点突变定点突变盒式定点诱变盒式定点诱变文库分子文库分子 定点突变定点突变 文库文库筛选筛选9.4.4 DNA改组改组DNA Shuffling 是运用随机突变技术，对某种感兴趣的蛋是运用随机突变技术，对某种感兴趣的蛋门质或核酸进行快速的改造，并定向选择所需门质或核酸进行快速的改造，并定向选择所需性质的生物分子。性质的生物分子。原理原理示意图示意图Family shufflingDNA改组成功与否取决于三个因素：改组成功与否取决于三个因素：优点优点人工理性设计人工理性设计随机性随机性 9.5 分

6、子库的放大分子库的放大 DNA：PCR RNA：RT-PCRPCRRT-PCRRNAcDNADNA9.6 标记和区分蛋白质分子标记和区分蛋白质分子 需要对其标记和区分需要对其标记和区分方法方法 具体具体方法方法 9.6.1 细胞展示细胞展示 ribosome display9.6.4 mRNA展示展示 mRNA展示技术展示技术 一种新兴的体外多肽筛选技术。可以运用一种新兴的体外多肽筛选技术。可以运用于生物分子配体的发现和相互作用的分析。于生物分子配体的发现和相互作用的分析。原原 理理 9.7 挑选和筛选挑选和筛选 分类：体内分类：体内 In vivo、体外、体外 In vitro挑选和筛选的比

7、较挑选和筛选的比较体内体内体外体外筛选筛选比较样品的颜色、荧比较样品的颜色、荧光等物理化学性质光等物理化学性质让细胞产生各种颜色、让细胞产生各种颜色、荧光或具有放射性等荧光或具有放射性等挑选挑选如共价或非共价结合如共价或非共价结合在某固定相表面在某固定相表面只表达了特异蛋白的细只表达了特异蛋白的细胞才能存活胞才能存活10文库大小文库大小筛选：筛选：10挑选：挑选：10 10 515 筛选筛选 挑选挑选优点优点 简单简单 快速快速缺点缺点 耗时耗时 需建立体系需建立体系突变突变 Gene/genes coding for enzymes of interesting 突变突变 Pool of m

8、utant genes 转化宿主菌转化宿主菌筛选单一突变基因的克隆筛选单一突变基因的克隆9.8 生物大分子进化应用实例生物大分子进化应用实例9.8.1 自然改进型分子进化自然改进型分子进化 （1）绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白 2008年诺贝尔奖年诺贝尔奖下村修 1994年，开始改造年，开始改造GFP，有多项发现。世界，有多项发现。世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的黄色、蓝色，有的可激活、有的荧光更强，有的黄色、蓝色，有的可激活、可变色。可变色。DNA改改 组组 DNA文库文库 转化细胞转化细胞细胞展示细胞展示 体外筛选体外筛选 改

9、进后效果改进后效果内含肽内含肽1:Synechocystis sp DnaB intein 内含肽内含肽2:Mycobacterium xenopi GyrA intein 23 pH 7.0GFPmut3*DTT上柱上柱 剪切剪切洗脱洗脱15+IPTG 4剪切剪切含含cGFPmut3*表达的表达的E.coli 激光共聚焦照片激光共聚焦照片明场明场荧光荧光叠加叠加 优化的诱导表达温度：优化的诱导表达温度：15含含GFPmut3*内含肽融合前体表达的内含肽融合前体表达的E.coli 激光共聚焦照片激光共聚焦照片明场明场荧光荧光叠加叠加 亲和纯化得到的亲和纯化得到的GFPmut3*SDS-PAGE

10、电泳图电泳图Lane 1:蛋白蛋白Marker Lane 4:Lane3 上清液通过几丁质柱液后的溶液上清液通过几丁质柱液后的溶液 Lane 2:诱导前的细胞粗提液诱导前的细胞粗提液 Lane 5:柱上洗脱的目的蛋白柱上洗脱的目的蛋白Lane 3:IPTG诱导后的细胞破碎诱导后的细胞破碎 Yield：2.41 mg L Purity：95%纯化的纯化的GFPmut3*的光谱学特性的光谱学特性 GFPmut3*的荧光光谱的荧光光谱Ex=502nm Em=511nmGFPmut3*的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱GFP的结构示意图的结构示意图 GFPmut3*的圆二色性光谱的圆二色性光谱用途用途（2）

11、非天然氨基酸的定点插入）非天然氨基酸的定点插入l定向进化定向进化tRNA和氨酰和氨酰tRNA合成酶合成酶只能识别只能识别20种氨基酸种氨基酸识别非天然氨基酸识别非天然氨基酸非天然氨基酸定点插入非天然氨基酸定点插入具体步骤具体步骤1.确定目标确定目标tRNA2.建立氨酰建立氨酰tRNA合成酶文库合成酶文库3.转入细胞转入细胞4.利用利用TAG作为非天然氨基酸的插入位点作为非天然氨基酸的插入位点5.挑选挑选非天然氨基酸优点非天然氨基酸优点9.8.2 新功能分子进化新功能分子进化(1)生长激素的重塑生长激素的重塑 腺垂体细胞分泌的蛋白质，促进细胞生长腺垂体细胞分泌的蛋白质，促进细胞生长和分化的重要因子。和分化的重要因子。激激 素素生物大分子进化重塑生长激素和受体的相互作用生物大分子进化重塑生长激素和受体的相互作用 受体的受体的Ser Ala进化进化 突变方法构建分子库突变方法构建分子库导入噬菌体导入噬菌体噬菌体展示放大噬菌体展示放大 体外挑选体外挑选富富 集含目标的噬菌体集含目标的噬菌体。过程：过程：先合成先合成L型水解酶，建立多肽文库；型水解酶，建立多肽文库；进化得到目标多肽；进化得到目标多肽；与与D型水解酶作用，验证效果。型水解酶作用，验证效果。9.8.3 核酸适配体的应用核酸适配体的应用酸酸 谢谢谢谢!