第二章-生物制药工艺技术基础课件.ppt

1、第二章第二章 生物制药工艺技术基础生物制药工艺技术基础Basis of biopharmaceutical technology基因工程制药技术基础细胞工程制药技术基础酶工程制药技术基础发酵工程制药技术基础基因工程制药技术基础基因工程制药技术基础back 基因工程基因工程(genetic engineering)：外源DNA，通过具有复制能力的载体分子形成重组DNA分子，导入受体细胞，进行持久稳定的复制和表达，使受体细胞产生外源DNA或蛋白质。基因工程操作过程：（1）获得目的基因；（2）构建DNA重组体；（3）将重组体导入宿主细胞；（4）工程菌的克隆与鉴定；（5）目的基因扩增与蛋白表达。P72

2、基因工程技术的应用特点基因工程技术的应用特点：为癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病的为癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病的预防、治疗和诊断提供新型疫苗、药物和诊断试剂。预防、治疗和诊断提供新型疫苗、药物和诊断试剂。基因工程技术的最大好处在于它能从极端复杂的机基因工程技术的最大好处在于它能从极端复杂的机体细胞内取出所需要的基因，将其在体外进行剪切拼体细胞内取出所需要的基因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白质。生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白质。基因工程技术生产药

3、品的优点：基因工程技术生产药品的优点：u 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床使用可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床使用提供有效的保障；提供有效的保障；u 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；u 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；u 内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通内源性生理活性物质在作为药物使用时存在

4、的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；过基因工程和蛋白质工程进行改造；u 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。获得目的基因获得目的基因构建构建DNA重组体重组体将重组体导入宿将重组体导入宿主细胞主细胞鉴定筛选阳性鉴定筛选阳性克隆克隆基因工程药物制造过程基因工程药物制造过程上游阶上游阶段段P72培养工程菌培养工程菌分离纯化表分离纯化表达产物达产物除菌过滤除菌过滤半成品检定半成品检定制剂制剂成品检定成品检定包装包装基因工程药物制造过程基因工程药物制造过程下游阶下游阶段段P72一一 目的基因的制备目的基因的制备（一）构建

5、cDNA 文库，筛选目的cDNA（二）PCR技术（三）化学合成法：较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。目的基因的获取途径：目的基因的获取途径：P74 克隆蛋白质药物基因的一个主要目的是为了高效的表达该基因，从而大量地生产原本难以获得的药物。基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系

6、，是基因表达设计的关键。三三 基因表达系统基因表达系统宿主细胞的基本要求宿主细胞的基本要求：容易获得较高浓度的细胞；容易获得较高浓度的细胞；能利用易得廉价原料；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；不致病、不产生内毒素；发热量低，需氧低；发热量低，需氧低；容易进行代谢调控；容易进行代谢调控；容易进行容易进行DNA技术操作；技术操作；产物的产量高，且易提取纯化。产物的产量高，且易提取纯化。（一）宿主细胞的选择（一）宿主细胞的选择u原核细胞：原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；u真核细胞：真核细胞：酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。酵母、丝状真菌、哺乳动物

7、细胞。宿主细胞的分类：宿主细胞的分类：P83（1）大肠杆菌）大肠杆菌 Escherichia coli优点优点：遗传背景清楚、技术操作简单，所需的成本相对遗传背景清楚、技术操作简单，所需的成本相对 较低和高表达量。较低和高表达量。缺点：缺点：u目的蛋白常以包涵体目的蛋白常以包涵体(inclusion body)形式表达，纯化形式表达，纯化提取困难。提取困难。1、原核细胞、原核细胞P83（2）芽孢杆菌）芽孢杆菌Bacillus：分泌能力强，分泌能力强，不形成包含体。有很强的胞外蛋白酶，不形成包含体。有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解。会对产物进行不同程度的降解。（3）链霉菌）链霉菌S

8、treptomyces：可将表达可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力。化能力。（1）酵母）酵母：表达产物能可进行折叠和翻表达产物能可进行折叠和翻译后修饰与糖基化，表达量高，产物易纯译后修饰与糖基化，表达量高，产物易纯化。化。（2）丝状真菌：）丝状真菌：很强的分泌能力；有成很强的分泌能力；有成熟的发酵和后处理工艺。熟的发酵和后处理工艺。2、真核细胞、真核细胞P86（3）哺乳动物细胞：）哺乳动物细胞：中国仓鼠卵巢细胞（中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和）和猴肾细胞（猴肾细胞（COS）。）。特点：产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。特点：产物是糖基化的，接近或类

9、似于天然产物。但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。用高，培养液浓度较稀。P87工程菌的培养过程：工程菌的培养过程：摇瓶操作（温度、摇瓶操作（温度、pH、培养基组、培养基组分、碳氮比）；分、碳氮比）；培养罐操作（确定培养参数、控制方培养罐操作（确定培养参数、控制方案、顺序）案、顺序）（一）、一）、基因工程菌的培养方式：基因工程菌的培养方式：1、分批培养（、分批培养（batch culture）2、补料分批培养（、补料分批培养（fed-batch culture）3、连续培养（、连续培养（continuous cul

10、ture）4、透析培养（、透析培养（dialysis culture）四四 基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵P88-90（二）基因工程菌的发酵工艺（二）基因工程菌的发酵工艺 基因工程菌的发酵工艺基因工程菌的发酵工艺 传统微生物发酵工艺传统微生物发酵工艺材料材料带外源基因重组载体的微生物带外源基因重组载体的微生物不含外源基因的微生物不含外源基因的微生物目的目的使外源基因高效表达，尽量减使外源基因高效表达，尽量减少宿主本身蛋白的污染少宿主本身蛋白的污染 自身基因表达所产生的自身基因表达所产生的 初级或次级代谢产物初级或次级代谢产物1、培养基的影响、培养基的影响 2、接种量的影响、接种量的影响3、温

11、度的影响、温度的影响4、溶解氧的影响、溶解氧的影响5、诱导时机的影响、诱导时机的影响6、pH的影响的影响 基因工程药物分离纯化的一般流程基因工程药物分离纯化的一般流程发酵液发酵液细胞分离细胞分离胞内产物胞内产物胞外产物胞外产物细胞破碎细胞破碎固液分离固液分离包含体包含体细胞碎片分离细胞碎片分离变变 性性复复 性性浓浓 缩缩初步分离初步分离制制 剂剂产产 品品高度纯化高度纯化五五 基因工程药物的分离纯化基因工程药物的分离纯化 六六 基因工程药物的质量控制基因工程药物的质量控制（一）原材料的质量控制（一）原材料的质量控制 确保确保编码药品的编码药品的DNA序列的正确性序列的正确性，重组微生物来自，

12、重组微生物来自单单一克隆一克隆，所用，所用质粒纯而稳定质粒纯而稳定，以保证产品质量的，以保证产品质量的安全性和一安全性和一致性。致性。（二）培养过程的质量控制（二）培养过程的质量控制 在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。（三）纯化工艺中的质量控制（三）纯化工艺中的质量控制 1、产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分、

13、产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA都控制在规定限度以都控制在规定限度以下。下。2、在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病、在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。法。（四）目标产品的质量控制（四）目标产品的质量控制 1、产品的鉴定、产品的鉴定 2、纯度分析、纯度分析 3、生物化学测定、生物化学测定 4、稳定性考察、稳定性考察 5、产品一致性的保证、产品一致性的保证 基因工程药物应用实例基

14、因工程药物应用实例u治疗糖尿病的胰岛素，是一种 51 个氨基酸残基组成的蛋白质。u1982 年美国 EliLilly 公司推出基因工程制造的人胰岛素，商品名为(Humulin)。u干扰素用于治疗肝炎等病毒感染性疾病，有良好疗效。u1 升发酵液中所得的干扰素相当于过去从 1000 升人血中所得。生产成本也大为降低。u目前用基因工程生产的蛋白质药物已达数十种，许多以前原本不可能大量生产的生长因子，凝血因子等蛋白质药物，现在用基因工程办法可大量生产。1.基因工程用于生产蛋白质类药物基因工程用于生产蛋白质类药物2.基因工程用于疫苗生产基因工程用于疫苗生产 常用的制备疫苗的方法，一种是减毒活疫苗，一种是

15、灭活疫苗。两种疫苗各有自身的弱点。减毒活疫苗隐含着感染的危险性。灭活疫苗免疫活性不高，需加大注射量或多次接种。利用基因工程制备重组DNA疫苗，可以克服上述缺点，重组DNA疫苗就是利用基因工程的方法将编码蛋白质的基因重组到载体上，再导入细胞中大量生产，表达免疫原性较强、无感染毒性的多肽制成的疫苗。乙型肝炎基因工程疫苗就是由编码HBsAg的基因插入到酿酒酵母基因组中表达的产物。3.基因工程用于基因治疗基因工程用于基因治疗 基因治疗：将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。n复合免疫缺陷综合征n黑色素瘤n血友病 细胞工程制药技术基础细胞工程制药技

16、术基础back动物细胞工程制药技术基础动物细胞工程制药技术基础（一）动物细胞的获得（一）动物细胞的获得1、原代细胞：直接取自动物组织器官2、二倍体细胞：原代细胞经过转化、筛选、克隆3、转化细胞系：失去正常细胞特点，而获得无限增 殖能力。（二）（二）P92-93（三）动物细胞大规模培养技术（三）动物细胞大规模培养技术1、悬浮培养（suspension culture）让细胞自由的悬浮于培养液中培养（操作简便、但细胞小不适合灌流培养）2、贴壁培养（anchorage culture）让细胞附在某种基质上生长繁殖（应用广、可灌流培养、但需大面积，传质差）3、微载体培养（microcarrier cu

17、lture）微载体培养是细胞附着和生长在微载体表面。P94-95细胞细胞A细胞细胞B杂种细胞杂种细胞灭活的病毒灭活的病毒物理法物理法化学法化学法仙台病毒仙台病毒疱疹病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒新城鸡瘟病毒细胞融合(cell fusion)是指在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细胞核细胞核u蛙血细胞有多核现象，为什么？u精子和卵子结合是细胞融合吗？u是否只有近缘或同种生物能够进行细胞融合？u1958年岗田善雄用高浓度的水仙病毒和小鼠艾氏腹水瘤细胞得以融合，这一发现，打破了

18、细胞融合只能在同种生物间进行的枷锁。杂交瘤细胞和单克隆抗体1975年从事免疫学研究的Kohlor和Milstein利用仙台病毒诱导经过免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，并最终获得了能分泌单一抗体的杂种细胞，该杂种细胞具有大量繁殖的能力，以及能长期分泌单克隆抗体。使免疫学领域出现了一场革命性的转机。为此两人获得1984年的诺贝尔医学奖。P97 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交细胞杂交细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生 特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体

19、外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体P97植物细胞工程制药技术基础植物细胞工程制药技术基础细胞全能性（totipotency）：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性。一、植物组织培养一、植物组织培养1.概念q 科学研究表明，处于离体状态的植物活细科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是过程，就是植物组织培养植物组织培养。离体的植物离体的

20、植物器官、组织器官、组织或细胞或细胞愈愈伤伤组组织织根根芽芽植植物物体体脱分化脱分化再分化再分化由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细胞的再分化。胞的再分化。一、植物组织培养一、植物组织培养2.植物组织培养过程含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的pH、适时光照等。一、植物组织培养一、植物组织培养离体植离体

21、植物细胞物细胞愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体根芽根芽植物体植物体脱分化脱分化再分化再分化一、植物组织培养 植物组织培养应用举例（一）胚状体（somatic embryo）：指由培养细胞诱导分化出的胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。紫草紫草紫草素紫草素 愈伤组织愈伤组织一、植物组织培养 植物组织培养应用举例（二）胚胚 状状 体体人工种皮人工种皮人工胚乳人工胚乳一、植物组织培养 植物组织培养应用举例（三）定义：指通过组织培养技术，把植物组织的细胞培养成在形态及生理上与天然种子胚相似的胚状体，然后将它包埋于有一定营养成分和保护功能的介质中，在适宜的条件下发芽出苗。二、植物体细胞杂交（Som

22、atic hybridization）二、植物体细胞杂交二、植物体细胞杂交3.过程：过程：(1)(1)(2)(3)(4)(5)二、植物体细胞杂交二、植物体细胞杂交过程示意图二、植物体细胞杂交二、植物体细胞杂交4.植物体细胞杂交应用细胞工程的好处细胞工程的好处以植物细胞全能性为基础的植物组织和细胞培养已经获得各种试管植物上千种，并可以获得有重要经济价值的药物和其他产品。细胞器移植、体外受精、胚胎培养，为植物和家畜的品种改良提供了新的途径。细胞融合技术，可以获得前所未有的生物为人类造福。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，被称为“生物导弹”，在治疗癌症方面发挥着巨大作用。酶工程制药技术基础酶工程制药技术

23、基础back 酶的特性酶的特性 定义：酶是由活细胞产生的具有特殊催化功能的一类蛋白质。催化效率高专一性强反应条件温和催化活性受到调节和控制（一）、酶工程(enzyme engineering)u酶工程是酶学和工程学相互渗透结合发展而形成一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能或者药用功效，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。u主要包括药用酶的生产和酶法制药两方面的技术。P102 药用酶的生产药用酶的生产药用酶是指可用于预防和治疗疾病的酶。例如：蛋白酶治疗消化不良；L-天冬酰胺酶治疗白血病；超氧化物歧化酶防护辐射损伤；溶菌酶抗菌消炎；尿激酶治疗心肌梗塞等等。药

24、用酶的生产主要包括发酵生产，药用酶的分离纯化，药用酶的分子修饰等。酶法制药酶法制药酶法制药是指利用酶的催化作用而制造出具有药用功效的物质的技术过程。例如：青霉素酰化酶生产半合成抗生素；-酪氨酸酶生产多巴；核苷磷酸化酶催化阿糖尿苷生成阿糖腺苷等等。酶法制药主要包括酶的催化反应，酶的固定化，酶的非水相催化等。(二)、固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)定义：是指借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定空间内并具有催化活性的酶制剂。广义的固定化酶包括固定化酶和固定化细胞。优点：优点：（1）固定化稳定性提高（2）可重复使用、提高使用效率、降低成本（3）提高强度，便于连续、自动、规模化生

25、产（4）便于产物的分离、纯化 缺点：缺点：固定化过程中往往会引起酶的失活P102（三）、酶的固定化方法（三）、酶的固定化方法 (1)吸附法吸附法：可分为物理吸附法和离 子吸附法。离子吸附法是将酶与含 有离子交换剂的水溶性载体相结合。(2)包埋法包埋法：凝胶包埋法和微囊化包埋法。是将酶或细胞定位在高聚物网格或不同 构型膜外壳内。EEEEEEEEP103(4)交联法交联法：使用双功能或多功能试剂与酶分子之间进行分子间的交联反应的固定化方法。EEEEEEEEEEE(3)共价结合法共价结合法：通过化学偶联使酶 的活性基团与载体表面活泼基团 共价结合。P1051.固定化细胞固定化细胞：将细胞限制或定位于

26、特定空间位置的细胞称为固定化细胞。2.固定化细胞的特点固定化细胞的特点 有细胞特性，生物催化剂功能，固相催化剂特点。优点：无须进行酶的分离纯化 保持酶的原始状态，酶回收率高 比固定化酶稳定性高 细胞内酶附助因子可再生 细胞本身含多酶体系 抗污染能力强P1063.固定化细胞的制备技术固定化细胞的制备技术 (1)载体结合法载体结合法 是将细胞悬液直接与水不溶性的载体相结合的固定化方法。(2)包埋法包埋法 将细胞定位于凝胶网格内的技术。(3)交联法交联法 用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法。(4)无载体法无载体法 靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。P106第五节第五节 酶工程在医药工业中

27、的应用酶工程在医药工业中的应用固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸（6-APA）培养培养固定固定转化转化过滤过滤抽提抽提 E.Coli 细胞细胞 青霉素青霉素 转化液转化液 滤液滤液 6-APA 粗品粗品 发酵工程制药技术基础发酵工程制药技术基础back微生物发酵技术微生物发酵技术u 1857年法国化学家、微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。”u巴斯德认为：酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟。u同时，把发酵的微生物分离出来，通过人工培养，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的发酵产品。发酵工程发酵工程Fermentatio

28、n Engineering：采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程中的一种新技术。发酵工程的内容发酵工程的内容包括以下的基本步骤：包括以下的基本步骤：1.菌种的选育菌种的选育2.培养基的配置培养基的配置3.灭菌灭菌4.扩大培养和接种扩大培养和接种5.发酵过程发酵过程6.分离提纯分离提纯发酵工程Continuous centrifuges（1）自然选育）自然选育 依据自发突变原理，通过不断分离筛选，去衰变菌落，选择高产菌，达到纯化、复壮、稳定生产目的。方法：a平板划线法 b稀释平板法1菌种的选育菌种的选育P52 （2）诱变育种）诱变

29、育种 出发菌株的选择 a稳定性 b具备某种优良性状的菌株 c对诱变剂敏感 d生理状态及生长时间 诱变处理 a化学诱变 b物理诱变 c生物诱变 筛选 a随机筛选 b半理性化筛选（3）现代菌种选育技术现代菌种选育技术 杂交育种 原生质体融合 基因工程技术P52-552 培养基的配置培养基的配置培养基配置的原则：培养基配置的原则：u 根据不同的菌种，选择不同的材料配制培养基 配制的培养基应满足微生物在碳源、氮源、生长因子、水、无机盐等方面的营养要求，并为微生物提供适宜的pH。u 培养基的营养要协调，以利于产物的合成。u 培养基在满足微生物的营养需求的基础上应尽量降低生产成本，以得到更高的经济效益。举

30、例：发酵生产常采用天然成分的液体培养基。而且，经常用野生的植物淀粉、甘蔗渣、秸秆，以及乙醇、醋酸等石化产品代替粮食来配制培养基。P58-613 灭菌灭菌灭菌与除菌方法灭菌与除菌方法 加热灭菌、辐射灭菌、介质过滤灭菌、化学灭菌灭菌的原因：灭菌的原因：在发酵过程中如混入其他微生物，将与菌种形成竞争关系，对发酵过程造成不良影响。举例：举例：如果在谷氨酸发酵过程中混入放线菌，则放线菌分泌的抗生素就会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡。如果在青霉素生产过程中污染了杂菌，这些杂菌则会分泌青霉素酶，将合成的青霉素分解掉。P61-63（1）染菌对产物提取和产品质量的影响）染菌对产物提取和产品质量的影响对过滤的影响：对

31、过滤的影响：发酵液的粘度加大由于发酵不彻底，基质的残留浓度增加造成的后果：造成的后果：过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡大幅度降低过滤收率3 灭菌灭菌对提取的影响对提取的影响有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量3 灭菌灭菌（1）染菌对产物提取和产品质量的影响）染菌对产物提取和产品质量的影响对产品质量的影响对产品质量的影响对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。对产品的纯度有较大影响。对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理

32、过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。3 灭菌灭菌（1）染菌对产物提取和产品质量的影响）染菌对产物提取和产品质量的影响（2）发酵过程中染菌的检查判断）发酵过程中染菌的检查判断杂菌的检查方法 显微镜检查：染色 镜检平板划线检查：倒平板 空培养 待测样品划线 培养观察酚红肉汤培养检查：无菌肉汤培养基空培养 接入样品 培养观察3 灭菌灭菌各种检查方法的比较显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜检取样少，视野的观察面也小，因此不易检出早期杂菌。平板划线法和肉汤培养方法的缺点是需经较长时间培养(一般要过夜)才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能检出更少的杂菌，而且结

33、果也更为准确。3 灭菌灭菌（2）发酵过程中染菌的检查判断发酵过程中染菌的检查判断（3）发酵染菌的防止）发酵染菌的防止种子带菌的原因及防止u带菌的原因 无菌室的无菌条件不符合要求 培养基灭菌不彻底 操作不当u种子带菌的防止 种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂菌。种子培养的设备和装置有无菌室、灭菌锅和摇瓶机等。3 灭菌灭菌（4）染菌后的挽救措施染菌后的挽救措施 u发酵早期染菌可以适当添加营养物质，重新灭菌后再接种发酵。u中后期染菌，如果杂菌的生长将影响发酵的正常进行或影响产物的提取时，应该提早放罐。u有些发酵染菌后发酵

34、液中的碳、氮源还较多，如果提早放罐，这些物质会影响后处理提取使产品取不出，此时应先设法使碳、氮源消耗，再放罐提取。3 灭菌灭菌 有时发酵罐偶尔染菌，原因一时又找不出，一般可以采取以下措施：连续灭菌系统前的料液贮罐在每年4一10月份(杂菌较旺盛生长的时间)加入0.2%甲醛，加热至80C，存放处理4小时，以减少带入培养液中的杂菌数。对染菌的罐，在培养液灭菌前先加甲醛进行空消处理。甲醛用量每立方米罐的体积0.120.17升。对染菌的种子罐可在罐内放水后进行灭菌，灭菌后水量占罐体的三分之二以上。这是因为细菌芽孢较耐干热而不耐湿热的缘故。3 灭菌灭菌（4）染菌后的挽救措施）染菌后的挽救措施（1）微生物生

35、长动力学微生物生长动力学 微生物的发酵方式可分为分批培养（batch culture）、补料分批培养（fed-batch culture）、连续培养（continuous culture）、透析培养（dialysis culture）分批发酵：在灭菌的培养基中接种相应的微生物，然后不再加入新的培养基。补料分批发酵：发酵过程中在不同时期加入越来越多的营养物，但不除去旧的营养物。连续发酵：在发酵过程中不断加入新鲜的培养基，同时放出等体积的旧的含悬浮的微生物的培养物。透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。4 扩大培养和接种扩大培养和

36、接种 P69-70减速期加速期对数期延迟期停滞期死亡期时间图6-2 在罐批发酵过程中细胞数量与时间的关系示意图Lg（细胞数）1、延迟期：细胞接种到灭菌的培养基后，细胞的数目并不是立即增长，这一时期称为延迟期。细胞进入延迟期可能是由于某种底物的缺乏或产物的抑制，而细胞需要重新启动它们的代谢系统，以适应新环境。2、加速期：延迟期后，对数期前，细胞生长速度逐渐加快的时期称为加速期。3、对数期：在细胞生长的对数期，细胞总量几次翻番，但是细胞的特定生长率保持不变。4、减速期：由于在对数期末期培养基中所含的细胞数目很大，底物可能被迅速吸收利用。所以减速期很短。5、停滞期：减速期后，由于某种关键底物被耗尽，

37、或是一种或几种抑制生长的代谢产物的积累，培养体系中细胞数量的增长逐渐停止。6、死亡期：细胞的能量耗尽，代谢停止。P69（2）补料分批发酵补料分批发酵优点：优点：在发酵的不同时期不断加入培养基，使培养基的量逐渐增大，这可以延长对数期与停滞期的持续时间，增加生物量的积累，也能增加停滞期的细胞代谢物的积累。缺点：缺点：停滞期的微生物常常会产生蛋白水解酶或蛋白酶，这些酶有可能降解重组微生物所产生的任何一种蛋白产物。解决方法：解决方法：在用重组微生物生产蛋白时，必须阻止发酵进行到停滞期。直接检测发酵时的培养基浓度的变化比较困难，所以，人们一般采用与之相关的其它因素，如有机酸的产生、pH值的变化、CO2的

38、产生等作为检测的标准，来推断应在何时加入新的培养基。4 扩大培养和接种扩大培养和接种（3）连续发酵连续发酵 在连续发酵时，如果生物反应其中的细胞总数与总体积均保持不变，那么体系就达到了稳态，即是说，取出的细胞与新生细胞的数目恰好处在平衡状态。优点：优点：可以降低成本；易于实现生产过程的仪表化和自动化；有利于对微生物生理、生态及反应机制的研究等。缺点：缺点：在培养过程中某些细胞可能会丢失重组质粒，从而成为反应器中的优势菌群，降低产量，将外源基因整合到宿主染色体上可避免这一问题；长时间维持工业规模生产的无菌状态很困难；工业发酵用的培养基质量不如实验室用的培养基那样有保证，不同批次的培养基质量可能不

39、同。4 扩大培养和接种扩大培养和接种 u 发酵产物：发酵产物主要在菌体生长的停滞期产生。u 发酵进程在发酵过程中随时取样检测培养液中细菌数目、产物浓度以了解发酵进程，及时添加必需的培养基成分来延长菌体生长停滞期的时间，以得到更多的发酵产物。u 发酵条件发酵生产中温度、pH、溶氧量等对发酵过程有重大影响。5 发酵过程发酵过程 u 发酵过程的优化发酵过程的优化氧气浓度：氧气浓度：以无菌空气的形式持续向培养基中通气，达到细菌生长所需的氧气浓度。培养基：培养基：培养基的碳氮比(C/N)值是衡量一种培养基是否适用的重要指标之一。充分混合：充分混合：细胞的养分供应充足，防止有毒代谢产物局部积累。温度：温度

40、：微生物在低于最适温度时生长缓慢，细胞的生产力降低；而如果温度过高则会导致细胞热休克，使细胞产生大量的胞内蛋白酶，而降低目的蛋白的产量。pH值：值：绝大多数微生物在pH5.5-8.5时生长得最好。在发酵过程中必须对培养基的pH值监测，并根据监测结果适量加入酸和碱以维持恒定的pH值。5 发酵过程发酵过程 P71-72n（1）、杂蛋白质的去除）、杂蛋白质的去除u加入凝聚剂加入凝聚剂 凝聚作用凝聚作用(coagulation):在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。u加入絮凝剂加入絮凝剂 凝絮作用凝絮作用(flocculation

41、):当往胶体悬浮液中加入絮凝剂时，胶体可强烈地吸附在凝絮剂表面的功能团上，而且一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同颗粒表面上，产生架桥连接，形成粗大的凝絮团沉淀出来，有助于过滤。6 分离提纯分离提纯 细胞培养液的预处理细胞培养液的预处理P117-119絮凝剂的分子量絮凝剂的分子量 絮凝剂的用量絮凝剂的用量 溶液溶液pH值值 搅拌速度和时间搅拌速度和时间 影响絮凝效果的因素影响絮凝效果的因素P118u变性沉淀变性沉淀u等电点沉淀等电点沉淀u加各种沉淀剂沉淀加各种沉淀剂沉淀u吸附吸附:四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾锌钾K2Zn3

42、Fe(CN)62的胶状沉淀，能将杂蛋白质和菌体等黏附的胶状沉淀，能将杂蛋白质和菌体等黏附在其中而除去。在其中而除去。n（1）、杂蛋白质的去除）、杂蛋白质的去除细胞培养液的预处理细胞培养液的预处理6 分离提纯分离提纯 P117-119n（2）多糖的去除）多糖的去除 可用酶将多糖转化为单糖提高过滤速度。黏多糖可与一些阳离子表面活性剂如十六烷基溴化铵（CTAB）生成沉淀去除。n（3）高价金属离子的去除）高价金属离子的去除u离子交换法离子交换法u沉淀法沉淀法 Ca2+草酸 Mg2+磷酸盐,三聚磷酸钠 Fe3+黄血盐细胞培养液的预处理细胞培养液的预处理6 分离提纯分离提纯 P118细胞破碎细胞破碎 机械

43、法机械法 物理法物理法 化学法化学法1、匀浆法 1、干燥 1、化学试剂处理2、珠磨法 2、冻融 2、制成丙酮粉3、超声波 3、渗透压冲击 3、酶解法6 分离提纯分离提纯 P120 机机 械械 法法方法方法原理原理特点特点匀浆法 基于液相的剪切力 适用面广，处理量大，速度快，在工业生产上广泛应用，但不适用于某些高度分枝的微生物，另外产热大，可能造成生物活性物质失活珠磨法 利用研磨作用破碎适用面广，处理量大，在工业生产上广泛应用；产热大，可能造成生物活性物质失活超声波 利用超声波的空穴作用使细胞破碎产热量大，且散热不易，成本高，仅适用于小量样品破碎选择破碎方法的依据选择破碎方法的依据物物理理法法方

44、法方法原理原理特点特点干燥法干燥后的菌体细胞膜渗透性变化，自溶较剧烈，易引起蛋白质或其他组分变性冻融法胞内冰晶引起细胞膨胀破裂较温和，但破碎作用较弱，常需反复冻融，仅适于在实验室中使用渗透压冲击法渗透压突然变化，使细胞快速膨胀破裂较温和，但破碎作用较弱，常与酶法合用化化学学法法化学试剂处理应用化学试剂溶解细胞或抽提某些细胞组分需选择合适的试剂，减小对活性物质的破坏，可应用于大规模生产酶解法用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的化学键 反应条件温和，但成本较高，一般仅适用于小规模应用化制成丙酮粉丙酮迅速脱水，破坏蛋白质与脂质结合的键 迅速脱水，可减少蛋白质变性，促进某些结合酶释放液液-固分离去除细胞碎片

45、固分离去除细胞碎片（1）过滤）过滤过滤方式：过滤方式：常规过滤、错流过滤过滤设备：过滤设备：板框过滤机、真空鼓式过滤机过滤介质和助滤剂：过滤介质和助滤剂：过滤介质：滤布或膜助滤剂：硅藻土、纸浆、石 棉、纤维素等6 分离提纯分离提纯 P126-131（2）离心分离）离心分离过滤式离心机沉降式离心机管式离心机液液-固分离去除细胞碎片固分离去除细胞碎片6 分离提纯分离提纯 P126-131（3）影响液影响液-固分离的因素固分离的因素悬浮物种类悬浮液黏度其他因素液液-固分离去除细胞碎片固分离去除细胞碎片6 分离提纯分离提纯 P131初步纯化：蒸发、萃取、交叉流过滤法进一步纯化：层析法、离子交换层析法、

46、分子筛层析法、亲和层析法 目的产物的纯化目的产物的纯化 6 分离提纯分离提纯 蛋白产品的干燥蛋白产品的干燥（1）减压干燥（2）喷雾干燥（3）冷冻干燥（P47）6 分离提纯分离提纯 适用于科研院所以及企业的微生物实验室，是精密发酵试验的理想工具。可以适用于生物发酵培养的培养基配方的筛选，发酵工艺参数的优化以及生产工艺与菌种的验证。GBQS系列气升式玻璃发酵罐系列气升式玻璃发酵罐7发酵罐发酵罐用于工业规模的发酵生产GJ系列机械搅拌不锈钢发酵罐系列机械搅拌不锈钢发酵罐适用于科研院所以及企业的的微生物实验室，是精密发酵试验的理想工具。适用于微生物发酵培养基配方的筛选，发酵工艺参数的优化以及生产工艺与菌

47、种的验证。GUJT系列中试机械搅拌不锈钢发酵罐系列中试机械搅拌不锈钢发酵罐8 发酵工程的应用发酵工程的应用在医药方面：在医药方面：u 发酵工程能生产人们所需的药品。例如：通过青霉发酵能生产青霉素。u 通过发酵工程能生产基因药品。例如：将合成的人的胰岛素基因转移到大肠杆菌细胞内构建成“工程菌”，再通过培养“工程菌”即可获得人的胰岛素。在食品工业方面：在食品工业方面：u 发酵工程能为人们提供丰富优质的传统发酵产品。如：生产啤酒，果酒等。u 发酵工程能生产各种食品添加剂。例如，酸味剂：柠檬酸、乳酸等；鲜味剂：谷氨酸等；色素：-胡萝卜素等；甜味剂：高果糖浆等。u 发酵工程能为解决人类粮食短缺问题开辟新途径。例如：通过发酵可获得大量的微生物菌体单细胞蛋白。20世纪80年代中期全世界的单细胞蛋白年产量已达2.0 x107t，广泛用于食品加工和饲料中。8 发酵工程的应用发酵工程的应用