五-高血压的基因研究与基因治疗进展课件.ppt

1、.1 1高高 血血 压压 的的 基基 因因 研研 究究与与 基基 因因 治治 疗疗 进进 展展2 2.高血压是一种以体循环动脉收缩压（高血压是一种以体循环动脉收缩压（SBPSBP）和（或）舒张压（和（或）舒张压（DBPDBP）升高为特征的临）升高为特征的临床综合征，它是目前临床最常见、最重要床综合征，它是目前临床最常见、最重要的心血管疾病之一的心血管疾病之一 。第一节第一节 高血压的基因研究高血压的基因研究3 3.血压及高血压血压及高血压血压的形成血压的形成血容量血容量血管张力血管张力心输出量心输出量4 4.美国高血压预防、评价和治疗联合委员会第六次会议报告：美国高血压预防、评价和治疗联合委员

2、会第六次会议报告：理想血压：理想血压：120/80mmHg120/80mmHg 正常血压：正常血压：130/85mmHg130/85mmHg 正常高限：正常高限：130130139/85139/8589mmHg89mmHg 高血压：高血压：140/90mmHg140/90mmHg (18.7/12.0kPa)(18.7/12.0kPa).5 5 高血压：高血压：1级：级：收缩压收缩压140-159 mmHg 或舒张压或舒张压90-99 mmHg 2级：级：收缩压收缩压160-179 mmHg 或舒张压或舒张压100-109 mmHg 3级：级：收缩压收缩压180 mmHg 或舒张压或舒张压11

3、0 mmHg6 6.高血压高血压原发原发:90%继发继发:10%:10%肾脏疾病、内分泌疾病肾脏疾病、内分泌疾病如如嗜铬细胞瘤等嗜铬细胞瘤等7 7.高高 血血 压压 的的 病病 因因8 8.（1 1）由于血压升高促成心肌细胞肥大）由于血压升高促成心肌细胞肥大心脏肥厚或扩大心脏肥厚或扩大瓣膜闭合不严瓣膜闭合不严血液回流血液回流心力衰竭心力衰竭。2 2）由于血压升高）由于血压升高脑部血管缺血形成动脉硬化脑部血管缺血形成动脉硬化脑血脑血栓或脑出血栓或脑出血。（3 3）由于血压升高）由于血压升高肾小球压力升高肾小球压力升高肾小球萎缩肾小球萎缩肾肾动脉硬化缺血动脉硬化缺血肾功能衰竭。肾功能衰竭。（4 4

4、）长期高血压或血压急骤增高）长期高血压或血压急骤增高视网膜渗血和出血视网膜渗血和出血 直接并发症直接并发症.9 9中枢中枢神经节神经节末梢递末梢递质释放质释放突触后突触后膜受体膜受体血管平滑肌血管平滑肌二、体液调节：肾素二、体液调节：肾素-血管紧张素血管紧张素-醛固酮系统醛固酮系统肾脏邻球肾脏邻球 肾素肾素 转化酶转化酶 小动脉收缩小动脉收缩 旁旁 器器 血管紧血管紧 血管紧血管紧 血管紧血管紧 张素原张素原 张素张素 张素张素 醛固酮分泌醛固酮分泌水钠潴留水钠潴留可乐定可乐定-甲基多巴甲基多巴 莫索尼定莫索尼定美加明美加明利血平利血平胍乙啶胍乙啶 普萘洛尔普萘洛尔 1哌唑嗪哌唑嗪 1 拉贝洛

5、尔拉贝洛尔肼屈嗪肼屈嗪 硝普钠硝普钠硝苯地平硝苯地平米诺地尔米诺地尔-R-R阻断药阻断药ACEI(卡托普利卡托普利)氯沙坦氯沙坦利尿药利尿药(噻嗪类噻嗪类)一、神经调节：交感神经系统一、神经调节：交感神经系统1010.对高血压形成密切关联的主要候选基因对高血压形成密切关联的主要候选基因一、肾素血管紧张素系统一、肾素血管紧张素系统 (Renin-Angiotensin System,RAS)(Renin-Angiotensin System,RAS)肾素是一种蛋白分解酶肾素是一种蛋白分解酶,主要在肾内但也可在肾外组织合主要在肾内但也可在肾外组织合成、储存和分泌成、储存和分泌,它本身无生理活性它本

6、身无生理活性,其作用在于激活由肝其作用在于激活由肝脏合成的血管紧张素原（脏合成的血管紧张素原（AGTAGT）,使其转化为血管紧张素使其转化为血管紧张素,并在血管紧张素转换酶并在血管紧张素转换酶(ACE)(ACE)的作用下水解形成血管紧张的作用下水解形成血管紧张素素(AT)(AT)。ACEACE还能裂解缓激肽还能裂解缓激肽(bradykinin,BK)(bradykinin,BK)等等,从而使从而使ATAT增加增加,使使BKBK等抗高血压物质失活而升高血压。等抗高血压物质失活而升高血压。.11111212.AT1AT1和和AT2AT2受体的功能受体的功能1313.1414.二、激肽释放酶二、激肽

7、释放酶-激肽系统激肽系统 缓激肽是体内最强的血管舒张物质之一。缓激肽通过与缓激肽是体内最强的血管舒张物质之一。缓激肽通过与缓激肽缓激肽2 2受体结合可引起全身小动脉舒张，显著降低外受体结合可引起全身小动脉舒张，显著降低外周血管循环阻力，血管通透性增强，从而引起血压下降。周血管循环阻力，血管通透性增强，从而引起血压下降。1515.缓激肽缓激肽2 2受体基因可能是原发性高血压等心血管疾病的受体基因可能是原发性高血压等心血管疾病的致病候选基因之一。致病候选基因之一。缓激肽缓激肽2 2受体基因启动子区域存在受体基因启动子区域存在T-58CT-58C多态性，其多态性，其-58C-58C等位基因突变使受体

8、数目减少，血管的舒张能力降低，产等位基因突变使受体数目减少，血管的舒张能力降低，产生高血压。生高血压。1616.三、交感神经三、交感神经-肾上腺素系统肾上腺素系统1717.交感神经引起血压升高的机制：交感神经引起血压升高的机制：作用于血管作用于血管 受体，使小动脉收缩，增大外周阻力受体，使小动脉收缩，增大外周阻力通过兴奋心脏的通过兴奋心脏的 受体使心脏收缩加强、加快，从而受体使心脏收缩加强、加快，从而提高心输出量；提高心输出量；直接或间接激活直接或间接激活RASRAS系统进而收缩血管和通过血管系统进而收缩血管和通过血管紧张素紧张素（angiotensinangiotensin,Ang,Ang）

9、促进醛固酮分泌，）促进醛固酮分泌，增加血容量增加血容量 。1818.22肾上腺素受体遗传多态性可能参与高血压的发病肾上腺素受体遗传多态性可能参与高血压的发病机制。机制。目前在目前在22肾上腺素受体基因的启动和编码区共报道肾上腺素受体基因的启动和编码区共报道了了1717个单核苷酸多态性，其中个单核苷酸多态性，其中G16RG16R多态性很常见。多态性很常见。1919.四、四、G G蛋白蛋白&信号传导系统信号传导系统 G G蛋白信号调节因子可与多种心血管激素（蛋白信号调节因子可与多种心血管激素（如血管如血管紧张素和去甲肾上腺素）紧张素和去甲肾上腺素）偶连。偶连。G G蛋白亚基编码基蛋白亚基编码基因多

10、态性对心血管系统有明显影响。其中因多态性对心血管系统有明显影响。其中G G蛋白蛋白 3 3亚基基因多态性被认为是研究心血管药物基因组学亚基基因多态性被认为是研究心血管药物基因组学最佳候选基因。最佳候选基因。2020.文献报道，文献报道，G G蛋白蛋白3 3亚基基因第亚基基因第10 10 外显子外显子825 825 位存在位存在CT CT 核苷酸转换，核苷酸转换，825T 825T等位基因与白种人高血压相关。等位基因与白种人高血压相关。2121.第二节第二节 高血压的基因治疗研究高血压的基因治疗研究一、基因治疗的概念一、基因治疗的概念 基因治疗指将正常和野生型的基因插入靶细胞的染基因治疗指将正常

11、和野生型的基因插入靶细胞的染色质基因组中色质基因组中,以补充缺失基因或置换致病基因以补充缺失基因或置换致病基因,从而产生新的表型的一种治疗方法。从而产生新的表型的一种治疗方法。.222219911991年，美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺年，美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶苷脱氨酶ADAADA基因缺陷）的基因缺陷）的4 4岁女孩体内导入重组的岁女孩体内导入重组的ADAADA基因，获得成功。基因，获得成功。19941994年，中国用导入人凝血因子年，中国用导入人凝血因子基因的方法成功基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者。治疗了乙型血友病的患者。.2323二、基因治疗的基本程序二、

12、基因治疗的基本程序治疗性基因的选择治疗性基因的选择基因载体的选择基因载体的选择靶细胞的选择靶细胞的选择基因转移基因转移外源基因表达的筛选外源基因表达的筛选 利用在体中的标记基因利用在体中的标记基因回输体内回输体内病毒载体病毒载体非病毒载体非病毒载体体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞间接体内疗法间接体内疗法直接体内疗法直接体内疗法2424.回体转移法2525.在体直接转移法在体直接转移法2626.2727.三、基因治疗的基本策略三、基因治疗的基本策略(1)(1)基因置换：是用有功能的正常基因置换致病基因基因置换：是用有功能的正常基因置换致病基因,达达到彻底治愈。到彻底治愈。(2)(2)基因修正：将突变

13、碱基序列修正基因修正：将突变碱基序列修正,正常序列保留正常序列保留,恢恢复其正常功能。复其正常功能。2828.(3)(3)基因修饰：是将目的基因导入缺陷细胞或其他细胞基因修饰：是将目的基因导入缺陷细胞或其他细胞,目的基因的表达产物可修饰和改变缺陷细胞的功能或使原目的基因的表达产物可修饰和改变缺陷细胞的功能或使原有功能加强。有功能加强。(4)(4)基因失活：就是运用反义技术特异封闭某些基因的基因失活：就是运用反义技术特异封闭某些基因的表达表达,以达到抑制某些有害基因的表达。以达到抑制某些有害基因的表达。2929.原发性高血压发病涉及多个基因原发性高血压发病涉及多个基因,具体缺陷基因具体缺陷基因仍

14、未彻底阐明仍未彻底阐明,现在还不能通过基因置换和基因现在还不能通过基因置换和基因修正来达到彻底治愈高血压的。修正来达到彻底治愈高血压的。目前的基因治疗还停留在使用基因修饰和失活的目前的基因治疗还停留在使用基因修饰和失活的方法增强舒血管物质的表达及减少缩血管物质的方法增强舒血管物质的表达及减少缩血管物质的表达表达,以达到类似药物降压的效果。以达到类似药物降压的效果。3030.高血压基因治疗的策略主要有两种高血压基因治疗的策略主要有两种:1)降低基因表达降低基因表达(knockdown):以能升高血压和加速心血管以能升高血压和加速心血管病理的基因为主病理的基因为主,特别是肾素血管紧张素系统特别是肾

15、素血管紧张素系统(RAS);2)诱导基因表达诱导基因表达(over-expression):以降低血压有关的基因以降低血压有关的基因为靶基因为靶基因,如心房利钠肽、内皮型一氧化氮等。如心房利钠肽、内皮型一氧化氮等。3131.四、高血压与缩血管基因的抑制四、高血压与缩血管基因的抑制（一）降低基因表达的反义技术（一）降低基因表达的反义技术 反义技术是根据靶基因结构特点设计反义寡核苷酸反义技术是根据靶基因结构特点设计反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,ASODN)分子，导入靶细分子，导入靶细胞或机体后与胞或机体后与DNA或或mRNA分子杂合分子杂合,从而封闭或抑从而封闭或

16、抑制特定基因的复制或转录，减少一些致高血压蛋白制特定基因的复制或转录，减少一些致高血压蛋白质的形成。质的形成。3232.3333.血管紧张素原血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)(angiotensinogen,AGT)是是RAS RAS 系统中的系统中的重要成员之一重要成员之一,参与血管紧张素的形成和高血压的产生。参与血管紧张素的形成和高血压的产生。2011 2011 年年Kmiura Kmiura 等利用重组腺病毒作载体携带的等利用重组腺病毒作载体携带的AGTAGT基因基因的的ASODN,ASODN,试验中给予试验中给予5d5d龄的龄的(spontaneously(spo

17、ntaneously hypertensive rats,SHR)hypertensive rats,SHR)大鼠一次心内注射该载体大鼠一次心内注射该载体,可延可延迟发生高血压迟发生高血压91d,91d,治疗中收缩压可下降治疗中收缩压可下降23mmHg,23mmHg,且转染且转染后后ASODN ASODN 在肝、肾、心脏中稳定发挥作用在肝、肾、心脏中稳定发挥作用,明显降低肝脏明显降低肝脏中中AGTAGT水平水平,减轻左室心肌肥厚。减轻左室心肌肥厚。1.1.血管紧张素原反义基因疗法血管紧张素原反义基因疗法3434.2.2.型血管紧张素型血管紧张素受体受体(AT R)(AT R)基因反义基因疗法基

18、因反义基因疗法 ATRATR和血管紧张素和血管紧张素结合结合,产生强大的缩血管效应产生强大的缩血管效应 Wang Wang等用反转录病毒携带等用反转录病毒携带AT1R-ASODNAT1R-ASODN转染细胞，在转染细胞，在体外及体外及SHRSHR体内试验中均能明显降低体内试验中均能明显降低AngIIAngII效用效用,达到达到降低血压的目的。降低血压的目的。3535.3.3.血管紧张素转换酶反义基因疗法血管紧张素转换酶反义基因疗法血管紧张素转换酶血管紧张素转换酶(ACE)(ACE)能使无活性的血管紧张能使无活性的血管紧张素素末端裂解末端裂解2 2个氨基酸个氨基酸,形成强烈的收缩血管物形成强烈的

19、收缩血管物质质AngAng,引起血压升高。引起血压升高。WangWang等以逆转录病毒为载体将等以逆转录病毒为载体将ACE-ASODNACE-ASODN心内注射心内注射给给5 5日龄的日龄的SHR,SHR,结果发现结果发现,产生的降压作用明显产生的降压作用明显而持久而持久,BP,BP降低降低13-17mmHg,13-17mmHg,并且能够减轻心室肥并且能够减轻心室肥大大,阻断肾脏和血管内皮的病理性变化。阻断肾脏和血管内皮的病理性变化。3636.4.4.其他一些基因其他一些基因,如酪氨酸羟基酶、如酪氨酸羟基酶、1肾上腺素能受体、血肾上腺素能受体、血管紧张素基因活化素等基因的管紧张素基因活化素等基

20、因的ASODN 也都是有降低血压也都是有降低血压作用。作用。3737.（二）降低基因表达的（二）降低基因表达的RNARNA干扰技术干扰技术RNA RNA 干扰干扰(RNA interference,RNAi),(RNA interference,RNAi),是近年才发现的是近年才发现的自然界进化上高度保守而普遍存在的一种现象自然界进化上高度保守而普遍存在的一种现象,是一种重是一种重要的转录后基因沉默机制。要的转录后基因沉默机制。3838.3939.4040.在设计小干扰性在设计小干扰性RNARNA的靶位点时，应尽量选择对靶的靶位点时，应尽量选择对靶mRNAmRNA特特异、而与其他内源性基因无同

21、源性的核苷酸序列。异、而与其他内源性基因无同源性的核苷酸序列。小干扰性小干扰性RNARNA诱发的基因抑制具有高度的序列特异性。在诱发的基因抑制具有高度的序列特异性。在小干扰性小干扰性RNARNA上一个错配的碱基对即可使其失去原有的抑上一个错配的碱基对即可使其失去原有的抑制基因表达的活性。换言之，只有与小干扰性制基因表达的活性。换言之，只有与小干扰性RNARNA高度同高度同源的源的mRNAmRNA才会被降解。这一特性在将才会被降解。这一特性在将RNARNA干扰技术用于治干扰技术用于治疗人类疾病时极为重要，为减少或避免抑制不相关基因奠疗人类疾病时极为重要，为减少或避免抑制不相关基因奠定了基础。定了

22、基础。4141.Wang Wang 等用针对等用针对肾上腺盐皮质激素受体肾上腺盐皮质激素受体(mineralcorticoid receptor,MR)(mineralcorticoid receptor,MR)的重组子腺的重组子腺相关病毒携带短发夹小干扰相关病毒携带短发夹小干扰RNA(AAV.MR-shRNA)RNA(AAV.MR-shRNA)来检测其对肾盐皮质激素受体的抑制和对冷诱导来检测其对肾盐皮质激素受体的抑制和对冷诱导高血压高血压(cold-induced hyper tension,CIH)(cold-induced hyper tension,CIH)的的控制能力。结果发现控制能

23、力。结果发现,AAV.MR-shRNA,AAV.MR-shRNA 治疗组治疗组CIH CIH 大鼠在基因导入后大鼠在基因导入后3 3周内血压无增高，单剂量注射周内血压无增高，单剂量注射AAV.MR-shRNA AAV.MR-shRNA 的大鼠其抗高血压作用至少维持的大鼠其抗高血压作用至少维持3 3 周。周。4242.(三三)降低基因表达的圈套技术降低基因表达的圈套技术 基本原理是基本原理是:合成与顺式元件相一致的双链寡聚脱合成与顺式元件相一致的双链寡聚脱氧核苷酸氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODNs),(oligodeoxynucleotides,ODNs),被称为被称

24、为圈套圈套ODNs,ODNs,转染入细胞转染入细胞,竞争性抑制反式因子转录竞争性抑制反式因子转录因子因子)与顺式元件的结合与顺式元件的结合,干扰转录因子的干扰转录因子的DNADNA结合结合活性及其后续基因的表达。活性及其后续基因的表达。4343.圈套策略示意图圈套策略示意图在正常状态下，转录因子（在正常状态下，转录因子（TF）与顺式元件（）与顺式元件（Cis-E）结合，）结合，导致靶基因的持续表达。导致靶基因的持续表达。与顺式元件序列一致的圈套寡核苷酸（与顺式元件序列一致的圈套寡核苷酸（decoys ODNs）能结合）能结合 TF，阻止，阻止TF与与Cis-E的相互作用，抑制靶基因的转录表达。

25、的相互作用，抑制靶基因的转录表达。4444.反义反义ODNODN和圈套和圈套ODNODN的作用原理的作用原理4545.4646.Transfection of decoydecoy but not mismatched ODN against AGE resulted in a transient decrease in blood pressure of spontaneously hypertensive rats(SHR),accompanied by a reduction in plasma angiotensinogen and angiotensin II levels.MORI

26、SHITA R,HIGAKI J,TOMITA N,AOKI M,MORIGUCHI A,TAMURA K,MURAKAMI K,KANEDA Y,OGIHARA T.ROLE OF TRANSCRIPTIONAL CIS-ELEMENTS,ANGIOTENSINOGEN GENEACTIVATING ELEMENTS,OF ANGIOTENSINOGEN GENE INBLOOD PRESSURE REGULATION.HYPERTENSION.1996;27:502507.(AGE)2：The transcriptional cis-elements,angiotensinogen gen

27、eactivating elements4747.五、高血压与五、高血压与“扩血管基因扩血管基因”增强增强 1.1.激肽释放酶激肽释放酶(kallikrein)(kallikrein)基因疗法基因疗法 激肽释放酶是体内的一类蛋白酶激肽释放酶是体内的一类蛋白酶,可使底可使底物激肽原分解为缓激肽。缓激肽具有舒张物激肽原分解为缓激肽。缓激肽具有舒张血管活性血管活性,可参与对血压和局部组织血流可参与对血压和局部组织血流的调节。在人体和动物实验中证实的调节。在人体和动物实验中证实,缓激缓激肽是目前已知的最强的舒血管物质之一。肽是目前已知的最强的舒血管物质之一。4848.Eric Eric 等给予高血压大

28、鼠模型静脉注射以腺病毒为等给予高血压大鼠模型静脉注射以腺病毒为载体的人组织激肽释放酶基因后，延迟载体的人组织激肽释放酶基因后，延迟BPBP升高时升高时间达间达2 d,2 d,并且降压作用持续约并且降压作用持续约23 d23 d。注射人组织激肽释放酶基因的大鼠的最大降压幅注射人组织激肽释放酶基因的大鼠的最大降压幅度可达度可达50 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),50 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),最最小降压幅度也可达小降压幅度也可达32 mm Hg32 mm Hg。Eric D,Hideaki Y,Chao JL,et al.Adenovirusmediat

29、ed kall ikrein gene delivery hypertension and protects against renal injury in deoxy-coritcosterone salt rats J.Immunopharmacology,1999,44(1-2):57.4949.2.2.肾上腺髓质素肾上腺髓质素(adrenomedulin,ADM)(adrenomedulin,ADM)基因疗法基因疗法 人类的肾上腺髓质素由人类的肾上腺髓质素由5252个氨基酸组成个氨基酸组成,在体内具有舒张血在体内具有舒张血管、促尿钠排泄和强心等作用。管、促尿钠排泄和强心等作用。5050

30、.Wei Wei 等将双链腺相关病毒为载体的人等将双链腺相关病毒为载体的人A AD DM cDNA M cDNA 通过尾静脉注通过尾静脉注射入成年射入成年SHR,SHR,两周后收缩压明显下降两周后收缩压明显下降,此作用持续时间长达此作用持续时间长达16 16 周。左室肥厚和心肌纤维化、肾小球硬化、肾小管损害程周。左室肥厚和心肌纤维化、肾小球硬化、肾小管损害程度均明显降低度均明显降低。Wei X,Zhao C,Jiang J,et al.Ad renomedullin gene delivery alleviat es hypert ensi on and it s secondary inju

31、ries of cardiovascular system J.Hum Gene T her,2005,16:372380.5151.3.3.心房利尿肽心房利尿肽(atrial natriuretic peptide,(atrial natriuretic peptide,ANP)ANP)基因疗法基因疗法 ANP ANP 主要是由心房肌细胞合成和释放主要是由心房肌细胞合成和释放,通过舒张通过舒张血管血管,降低外周阻力降低外周阻力,增加肾小球滤过率，抑制增加肾小球滤过率，抑制肾素的释放肾素的释放,引起明显的尿钠和尿量增加等作用引起明显的尿钠和尿量增加等作用机制机制,达到降低达到降低BPBP的效果

32、。的效果。5252.Lin Lin 等给盐敏感性高血压脑卒中大鼠静脉注射以腺病毒为等给盐敏感性高血压脑卒中大鼠静脉注射以腺病毒为载体的载体的ANP ANP 基因基因,平均血压可大幅度降低平均血压可大幅度降低,脑卒中的死亡脑卒中的死亡率可从率可从54%54%下降至下降至17%,17%,心肌肥厚和血管肥厚明显减轻。心肌肥厚和血管肥厚明显减轻。Lin KF,Chao J,Chao L.Atrial natriuretu peptide gene delivery reduces stroke induced mortality rate in Dahl salt sensit ive rats J

33、.Hypertension,1999,33(1pt2):219.5353.4.4.其他基因疗法其他基因疗法转染其他基因转染其他基因,如一氧化氮合酶基因、如一氧化氮合酶基因、血红素加氧酶基因、肾素结合蛋白基因等血红素加氧酶基因、肾素结合蛋白基因等,也在高血压的动也在高血压的动物实验治疗中取得了一定效果物实验治疗中取得了一定效果,表明增加血管舒张的顺义基表明增加血管舒张的顺义基因疗法治疗高血压是一种有前景的治疗方法。因疗法治疗高血压是一种有前景的治疗方法。5454.六、高血压基因治疗需要解决的问题六、高血压基因治疗需要解决的问题1.1.靶基因的确定是高血压病治疗的前提靶基因的确定是高血压病治疗的前提2.2.载体构建。构建安全、高效、免疫原性低的载体是载体构建。构建安全、高效、免疫原性低的载体是高血压基因治疗热点高血压基因治疗热点3.3.基因转移法。建立安全有效的基因导入方法也很基因转移法。建立安全有效的基因导入方法也很关键关键,一般而言一般而言,直接基因转移法优于间接法直接基因转移法优于间接法