基层培训之免疫学技术培训课件.ppt

1、基层培训之免疫学技基层培训之免疫学技术术临床免疫检验是运用免疫学基本的基本原临床免疫检验是运用免疫学基本的基本原理和技术，检查临床标本中的微生物抗原、理和技术，检查临床标本中的微生物抗原、肿瘤抗原以及相应的微生物抗体、自身抗肿瘤抗原以及相应的微生物抗体、自身抗体，为感染性性疾病、肿瘤、自身免疫病体，为感染性性疾病、肿瘤、自身免疫病以及免疫缺陷提供诊断依据。以及免疫缺陷提供诊断依据。2基层培训之免疫学技术免疫检验分为两个部分，一部分为利用免疫检免疫检验分为两个部分，一部分为利用免疫检测原理检测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、测原理检测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细胞因子、细胞粘附分子等免疫相

2、关物质，另细胞因子、细胞粘附分子等免疫相关物质，另一部分是利用免疫检测原理检测体液中微量物一部分是利用免疫检测原理检测体液中微量物质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓度、质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓度、微量元素等。这些检测结果为临床上确定诊断、微量元素等。这些检测结果为临床上确定诊断、分析病情、调整治疗方案和判断预后等提供了分析病情、调整治疗方案和判断预后等提供了有效的实验依据。有效的实验依据。3基层培训之免疫学技术第一节第一节 免疫学检验原理、特点和方法免疫学检验原理、特点和方法 4基层培训之免疫学技术一、免疫学检验原理一、免疫学检验原理（一）抗原抗体反应是抗原与相应抗体之间的特

3、异性结（一）抗原抗体反应是抗原与相应抗体之间的特异性结合反应。它既可发生在体内，也可发生在体外。在体内合反应。它既可发生在体内，也可发生在体外。在体内发生的抗原抗体反应即为体液免疫应答的效应作用。体发生的抗原抗体反应即为体液免疫应答的效应作用。体外的抗原抗体结合反应，根据参与反应的抗原的物理性外的抗原抗体结合反应，根据参与反应的抗原的物理性状（可溶性或颗粒性）以及参与反应的条件（电解质、状（可溶性或颗粒性）以及参与反应的条件（电解质、补体等）不同，表现出不同的现象，如沉淀、凝集、细补体等）不同，表现出不同的现象，如沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合和毒素中和等。胞溶解、补体结合和毒素中和等。一般将

4、检查血清中病一般将检查血清中病原微生物抗原和抗体的试验称为血清学试验。原微生物抗原和抗体的试验称为血清学试验。5基层培训之免疫学技术抗原抗体反应可分为两个阶段。第一阶段为特异抗原抗体反应可分为两个阶段。第一阶段为特异性结合阶段，此阶段仅需数秒至数分钟，但并不性结合阶段，此阶段仅需数秒至数分钟，但并不出现可见的反应；第二阶段为可见反应阶段，这出现可见的反应；第二阶段为可见反应阶段，这一阶段抗原抗体复合物在适当的电解质、一阶段抗原抗体复合物在适当的电解质、pH、温度和补体等的影响下，进一步交联聚集，出现温度和补体等的影响下，进一步交联聚集，出现凝集、沉淀、溶解和补体结合介导的生物现象等凝集、沉淀、

5、溶解和补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。第二阶段反应较慢，往往需要肉眼可见的反应。第二阶段反应较慢，往往需要数分钟至数小时。这两个阶段不能严格划分，所数分钟至数小时。这两个阶段不能严格划分，所需的时间也受多种因素的影响。需的时间也受多种因素的影响。6基层培训之免疫学技术（二）抗原抗体反应的特点：（二）抗原抗体反应的特点：1、特异性、特异性抗原抗体反应的特异性（抗原抗体反应的特异性（specificity）是指抗原分子上）是指抗原分子上的抗原决定簇和抗体分子超变区结合的特异性，由这两的抗原决定簇和抗体分子超变区结合的特异性，由这两个分子之间空间结构的互补性决定的。形同钥匙与锁一个分子之间空

6、间结构的互补性决定的。形同钥匙与锁一样，所以抗原抗体的结合是有高度特异性的。例如白喉样，所以抗原抗体的结合是有高度特异性的。例如白喉抗抗毒素只能与相应的外毒素结合，而不能与破伤风外抗抗毒素只能与相应的外毒素结合，而不能与破伤风外毒素结合。毒素结合。因此，在抗原抗体反应的免疫学实验中，可因此，在抗原抗体反应的免疫学实验中，可以用已知的抗原或抗体来检测特定的相对应的抗体或抗以用已知的抗原或抗体来检测特定的相对应的抗体或抗原。原。7基层培训之免疫学技术2、比例性、比例性比例性（比例性（proportionality）是指抗原与抗体特异）是指抗原与抗体特异性结合反应时，生成肉眼可见结合物的量与反性结合

7、反应时，生成肉眼可见结合物的量与反应物浓度的关系，只有当二者浓度比例适当时，应物浓度的关系，只有当二者浓度比例适当时，才出现可见反应。才出现可见反应。抗原抗体分子比例合适的范抗原抗体分子比例合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带。围，称为抗原抗体反应的等价带。在此范围抗在此范围抗原抗体结合充分，沉淀物形成得快而多。原抗体结合充分，沉淀物形成得快而多。8基层培训之免疫学技术在等价带的前后，由于抗体和抗原的过量，上在等价带的前后，由于抗体和抗原的过量，上清液中可测出游离的抗体或抗原，形成的沉淀清液中可测出游离的抗体或抗原，形成的沉淀物少。物少。当抗体过量时，称为前带，抗原过量时当抗体过量时，称为前带

8、，抗原过量时称为后带。称为后带。因此，在抗原抗体反应的试验中，因此，在抗原抗体反应的试验中，如果没有产生肉眼可见的抗原抗体复合物出现，如果没有产生肉眼可见的抗原抗体复合物出现，一方面要考虑是否有抗原与相应的抗体存在，一方面要考虑是否有抗原与相应的抗体存在，另一方面还必须注意到两者反应的比例是否适另一方面还必须注意到两者反应的比例是否适当。当。9基层培训之免疫学技术3、可逆性、可逆性抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性称为抗原抗体又可解离为游离抗原与抗体的特性称为抗原抗体结合的可逆性（结合的可逆性（reversibil

9、ity）。由于抗原抗体的）。由于抗原抗体的结合是分子表面的非共价键结合，故形成的复合结合是分子表面的非共价键结合，故形成的复合物是不牢固的，在一定的条件下可以解离，所以物是不牢固的，在一定的条件下可以解离，所以说抗原抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一说抗原抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一动态平衡过程。动态平衡过程。10基层培训之免疫学技术抗原抗体复合物解离取决于两方面的因素：一是抗体抗原抗体复合物解离取决于两方面的因素：一是抗体对相应抗原的对相应抗原的亲和力亲和力；二是；二是环境因素环境因素对复合物的影响。对复合物的影响。亲和力高的抗体与抗原表位在空间构型上非常适合，亲和力高的抗体与抗原

10、表位在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不容易解离，反之，亲和力低的抗体两者结合牢固，不容易解离，反之，亲和力低的抗体与抗原形成的复合物较易解离。环境因素中的过高或与抗原形成的复合物较易解离。环境因素中的过高或过低均可破坏离子间的静电引力，使抗原抗体的结合过低均可破坏离子间的静电引力，使抗原抗体的结合力下降。增加离子强度，也可使静电引力消失，降低力下降。增加离子强度，也可使静电引力消失，降低抗原抗体的结合力，促使其解离。解离后的抗原和抗抗原抗体的结合力，促使其解离。解离后的抗原和抗体仍然保持游离抗原、抗体的生物活性。体仍然保持游离抗原、抗体的生物活性。11基层培训之免疫学技术（三）影响抗原抗体

11、反应的因素（三）影响抗原抗体反应的因素 影响抗原抗体反应的因素较多，主要影响抗原抗体反应的因素较多，主要有两方面：一是反应物自身的因素，另一有两方面：一是反应物自身的因素，另一方面是反应环境的因素。方面是反应环境的因素。12基层培训之免疫学技术1、反应物自身因素、反应物自身因素（1）抗原）抗原抗原的理化性状、表面抗原决定簇的种类和数抗原的理化性状、表面抗原决定簇的种类和数目均可影响抗原抗体反应的结果。如颗粒性抗目均可影响抗原抗体反应的结果。如颗粒性抗原与相应抗体结合后产生凝集现象；可溶性抗原与相应抗体结合后产生凝集现象；可溶性抗原与相应抗体结合后产生沉淀现象；单价抗原原与相应抗体结合后产生沉淀

12、现象；单价抗原与相应抗体结合后不出现沉淀现象。与相应抗体结合后不出现沉淀现象。13基层培训之免疫学技术（2）抗体）抗体来源来源 来源于不同动物的免疫血清，其反应性来源于不同动物的免疫血清，其反应性有差异。家兔等大多数动物的免疫血清，由于有差异。家兔等大多数动物的免疫血清，由于具有较宽的等价带，与相应抗原结合易出现可具有较宽的等价带，与相应抗原结合易出现可见的抗原抗体复合物。马、人的免疫血清等价见的抗原抗体复合物。马、人的免疫血清等价带窄，抗原不足或过剩，均易形成可溶性复合带窄，抗原不足或过剩，均易形成可溶性复合物。物。单克隆抗体一般不适合用于凝集和沉淀反单克隆抗体一般不适合用于凝集和沉淀反应。

13、应。14基层培训之免疫学技术浓度浓度 抗体的浓度往往是与抗原相对而言，二抗体的浓度往往是与抗原相对而言，二者合适的浓度才易出现可见的反应结果。者合适的浓度才易出现可见的反应结果。特异性和亲和力特异性和亲和力 特异性与亲和力是影响抗原特异性与亲和力是影响抗原抗体反应的关键因素，它们共同影响试验结果抗体反应的关键因素，它们共同影响试验结果的准确程度。诊断试剂应尽可能选高特异性、的准确程度。诊断试剂应尽可能选高特异性、高亲和力的抗体，才能提高试验的可靠性。高亲和力的抗体，才能提高试验的可靠性。15基层培训之免疫学技术2、反应的环境条件、反应的环境条件（1）电解质）电解质抗原抗体结合后，由亲水性向疏水

14、性转换过程中必须抗原抗体结合后，由亲水性向疏水性转换过程中必须要有电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失要有电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷，破坏水化层，使复合物相互靠拢聚集，形成去电荷，破坏水化层，使复合物相互靠拢聚集，形成大块凝集、沉淀。若无电解质存在，则不出现可见反大块凝集、沉淀。若无电解质存在，则不出现可见反应。应。在抗原抗体反应中，通常使用在抗原抗体反应中，通常使用0.85%NaCl溶液或溶液或各种缓冲液作抗原抗体的稀释液及反应液。各种缓冲液作抗原抗体的稀释液及反应液。16基层培训之免疫学技术（2）酸碱度）酸碱度抗原抗体反应必须在合适的抗原抗体反应必须在合适的pH

15、环境中进行，环境中进行，pH过低或过高都会影响抗原抗体的反应。过低或过高都会影响抗原抗体的反应。抗原抗抗原抗体反应中一般以体反应中一般以pH69为宜。为宜。有补体参与的反有补体参与的反应应pH为为7.27.4，超过这个范围会降低补体的酶，超过这个范围会降低补体的酶活性而影响反应。活性而影响反应。17基层培训之免疫学技术（3）温度）温度抗原抗体反应需要合适的温度才有利于二者结合。一抗原抗体反应需要合适的温度才有利于二者结合。一般以般以1540为宜，为宜，最适温度为最适温度为37。在此范围内，。在此范围内，温度越高，抗原抗体分子运动越快，碰撞接触机会越温度越高，抗原抗体分子运动越快，碰撞接触机会越

16、多，两者结合反应速度越快。但是如果温度高于多，两者结合反应速度越快。但是如果温度高于56，会导致抗原抗体复合物解离，甚至分子变性。温度越会导致抗原抗体复合物解离，甚至分子变性。温度越低，反应速度越缓慢，但抗原抗体结合越牢固，易于低，反应速度越缓慢，但抗原抗体结合越牢固，易于观察。观察。18基层培训之免疫学技术（4）振荡）振荡在抗原抗体反应中，适当的在抗原抗体反应中，适当的振摇可振摇可促使促使抗原抗体分子的接触，抗原抗体分子的接触，加速其反应加速其反应。19基层培训之免疫学技术（四）抗原抗体反应的类型（四）抗原抗体反应的类型随着免疫学技术的飞速发展，在原有经典免疫随着免疫学技术的飞速发展，在原有

17、经典免疫学实验方法基础上，新的免疫学测定方法不断学实验方法基础上，新的免疫学测定方法不断出现，使免疫学实验技术更特异、更敏感和更出现，使免疫学实验技术更特异、更敏感和更稳定。目前根据抗原和抗体的性质不同，反应稳定。目前根据抗原和抗体的性质不同，反应出现的现象和结果的不同，以及反应时参与的出现的现象和结果的不同，以及反应时参与的其他条件不同，将抗原抗体反应分为五种类型。其他条件不同，将抗原抗体反应分为五种类型。20基层培训之免疫学技术（1）可溶性抗原与相应抗体结合产生的沉淀）可溶性抗原与相应抗体结合产生的沉淀反应；（反应；（2）颗粒抗原与相应抗体结合发生的）颗粒抗原与相应抗体结合发生的凝集反应；

18、（凝集反应；（3）抗原抗体结合后激活补体所）抗原抗体结合后激活补体所产生的溶细胞反应；（产生的溶细胞反应；（4）细菌外毒素或病毒）细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应；（与相应抗体结合所致的中和反应；（5）标记）标记免疫的抗原抗体反应。每种反应类型都包括若免疫的抗原抗体反应。每种反应类型都包括若干实验技术。（见抗原抗体反列应表干实验技术。（见抗原抗体反列应表1）21基层培训之免疫学技术表表1 抗原抗体反应的类型和试验方法抗原抗体反应的类型和试验方法-反应类型反应类型 实验方法实验方法 结果判断结果判断-沉淀反应沉淀反应液相沉淀实验液相沉淀实验观察沉淀、检测浊度观察沉淀、检测浊度 琼脂凝

19、胶扩散琼脂凝胶扩散观察和测定扫描沉淀线或环观察和测定扫描沉淀线或环 凝胶电泳技术凝胶电泳技术观察和测定扫描沉淀峰弧等观察和测定扫描沉淀峰弧等凝集反应凝集反应直接凝集实验直接凝集实验用裸眼、放大镜或显微镜观察红用裸眼、放大镜或显微镜观察红 细胞或胶乳颗粒的凝集现象细胞或胶乳颗粒的凝集现象 间接凝集实验间接凝集实验 同上同上 凝集抑制实验凝集抑制实验 同上同上 协同凝集实验协同凝集实验 同上同上 抗球蛋白实验抗球蛋白实验 同上同上-22基层培训之免疫学技术-补体参与反应补体参与反应补体溶血实验补体溶血实验 以裸眼或光电比色仪观察以裸眼或光电比色仪观察 测定溶血现象测定溶血现象 补体结合实验补体结合

20、实验 同上同上中和反应中和反应 病毒中和实验病毒中和实验病毒感染性丧失病毒感染性丧失 毒素中和实验毒素中和实验外毒素毒性丢失外毒素毒性丢失标记免疫标记免疫 荧光免疫技术荧光免疫技术 检测荧光检测荧光 放射免疫技术放射免疫技术 检测放射性检测放射性 酶标免疫酶标免疫 检测酶底物显色、发光、荧光检测酶底物显色、发光、荧光 发光免疫技术发光免疫技术 检测发光检测发光 金标免疫技术金标免疫技术 观察金颗沉淀线观察金颗沉淀线-23基层培训之免疫学技术二、免疫学检验方法和应用二、免疫学检验方法和应用（一）凝集反应（一）凝集反应颗粒性抗原或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒颗粒性抗原或可溶性抗原（

21、或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，与相应抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当电解质存在后，与相应抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。凝集试验应用广下，形成肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。凝集试验应用广而且敏感度高，方法简便，迄今已成为通用的免疫学技术之一，而且敏感度高，方法简便，迄今已成为通用的免疫学技术之一，广泛用于细菌的鉴定和分型、抗原分析、测定抗体和诊断疾病等广泛用于细菌的鉴定和分型、抗原分析、测定抗体和诊断疾病等临床检验。在免疫检验技术中，根据参与反应的颗粒的不同，把临床检验。在免疫检验技术中，根据参与反应的颗粒的不同，把凝集反应

22、分为直接凝集反应和间接凝集反应。而自身红细胞凝集凝集反应分为直接凝集反应和间接凝集反应。而自身红细胞凝集反应试验和抗球蛋白参与的凝集试验是两种特殊的凝集反应。反应试验和抗球蛋白参与的凝集试验是两种特殊的凝集反应。24基层培训之免疫学技术1、直接凝集反应：、直接凝集反应：细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体反应，当二者电解质参与下可直接与相应抗体反应，当二者比例适当时，出现凝集，称为直接凝集反应。比例适当时，出现凝集，称为直接凝集反应。反应中的抗原称为凝集原，参与反应的抗体称反应中的抗原称为凝集原，参与反应的抗体称为凝集素。

23、常用的凝集试验有玻片法、试管法为凝集素。常用的凝集试验有玻片法、试管法和微量血凝反应板法。和微量血凝反应板法。25基层培训之免疫学技术（1）玻片凝集试验：多用于定性。用以知抗体诊断血）玻片凝集试验：多用于定性。用以知抗体诊断血清与受检菌液在玻片上混匀，放置数分钟后如抗体与清与受检菌液在玻片上混匀，放置数分钟后如抗体与相应抗原反应即出现肉眼可见的凝集反应。如沙门菌相应抗原反应即出现肉眼可见的凝集反应。如沙门菌玻片凝集试验。玻片凝集试验。（2）试管凝集试验：多用于半定量和定量试验，常用）试管凝集试验：多用于半定量和定量试验，常用已知一定量的抗原（细菌、细胞等）与一系列稀释的已知一定量的抗原（细菌、

24、细胞等）与一系列稀释的病人血清混合，在保温放置后观察结果，判定受检血病人血清混合，在保温放置后观察结果，判定受检血清有无相应抗体以及效价，如肥达反应。清有无相应抗体以及效价，如肥达反应。26基层培训之免疫学技术2、间接凝集反应：将可溶性抗原（或抗体）先吸附、间接凝集反应：将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联与免疫无关大小适当的颗粒表面，使之成为致或偶联与免疫无关大小适当的颗粒表面，使之成为致敏载体颗粒，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适敏载体颗粒，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在条件下，出现特异性的凝集现象，称宜的电解质存在条件下，出现特异性的凝集现象，称为间接凝集反应。其敏感度

25、比直接凝集反应高为间接凝集反应。其敏感度比直接凝集反应高28倍，倍，亦明显高于沉淀反应。在临床上广泛用于各种抗体和亦明显高于沉淀反应。在临床上广泛用于各种抗体和可溶性抗原的检测。间接凝集反应试验可分为：可溶性抗原的检测。间接凝集反应试验可分为：27基层培训之免疫学技术（1）间接凝集试验：用抗原致敏载体以检测）间接凝集试验：用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体。将可溶性抗原与载体颗粒标本中的相应抗体。将可溶性抗原与载体颗粒结合，再与样品中的抗体反应，形成肉眼可见结合，再与样品中的抗体反应，形成肉眼可见的凝集颗粒或凝集块者为阳性。的凝集颗粒或凝集块者为阳性。28基层培训之免疫学技术（2）反向间接凝

26、集试验：用已知特异性抗）反向间接凝集试验：用已知特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。临床体致敏载体以检测标本中的相应抗原。临床上用于检测上用于检测HbsAg、AFP等。等。29基层培训之免疫学技术（3）间接抑制试验：试剂为已知抗原致敏的）间接抑制试验：试剂为已知抗原致敏的颗粒载体和相应的抗体，用于检测标本中与致颗粒载体和相应的抗体，用于检测标本中与致敏抗原相同的抗原。检测方法是将标本与抗体敏抗原相同的抗原。检测方法是将标本与抗体试剂混合反应，然后加入致敏载体，若出现凝试剂混合反应，然后加入致敏载体，若出现凝集，说明标本中不存在相应抗原，抗体试剂未集，说明标本中不存在相应抗原，抗体试剂未被

27、结合，仍与载体上的抗原反应；如未出现凝被结合，仍与载体上的抗原反应；如未出现凝集，则说明标本中含有相应抗原，凝集反应被集，则说明标本中含有相应抗原，凝集反应被抑制。抑制。30基层培训之免疫学技术（4）协同凝集试验：其原理同反向间接凝集试）协同凝集试验：其原理同反向间接凝集试验，但所用的载体是金黄色葡萄球菌，其细胞验，但所用的载体是金黄色葡萄球菌，其细胞壁中有壁中有A蛋白（蛋白（SPA），），SPA具有能与特异性抗具有能与特异性抗体体IgG的的Fc段结合的特性。当这种葡萄球菌与段结合的特性。当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体，抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体，若与相应

28、抗原接触，就会出现反向间接凝集反若与相应抗原接触，就会出现反向间接凝集反应，常用于细菌、病毒、毒素及可溶性抗原的应，常用于细菌、病毒、毒素及可溶性抗原的快速检测。快速检测。31基层培训之免疫学技术间接血凝试验：是以红细胞作为载体的间接凝集试间接血凝试验：是以红细胞作为载体的间接凝集试验。可根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱。验。可根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱。在临床检测中应用广泛，是经典的抗原抗体反应之一。在临床检测中应用广泛，是经典的抗原抗体反应之一。胶乳凝集试验：是以聚苯乙烯胶乳微粒为载体的间胶乳凝集试验：是以聚苯乙烯胶乳微粒为载体的间接凝集试验。接凝集试验。明胶凝集试验：即

29、以明胶颗粒为载体的间接凝集试明胶凝集试验：即以明胶颗粒为载体的间接凝集试验。常用于血清中抗病毒抗体的检测。验。常用于血清中抗病毒抗体的检测。32基层培训之免疫学技术 间接凝集试验的应用间接凝集试验的应用间接凝集试验具有敏感、快速、操作简便和间接凝集试验具有敏感、快速、操作简便和不需要特殊仪器等优点，既可以检测抗原，不需要特殊仪器等优点，既可以检测抗原，又可以检测抗体。已广泛应用于医学检验。又可以检测抗体。已广泛应用于医学检验。特别是对某些疾病的诊断治疗和效果的观察特别是对某些疾病的诊断治疗和效果的观察有着重要的参考价值。有着重要的参考价值。33基层培训之免疫学技术（1）抗体的检测）抗体的检测

30、用于检测微生物、寄生虫等感染所用于检测微生物、寄生虫等感染所产生的抗体及自身抗体和药物抗体。如检测沙门菌抗产生的抗体及自身抗体和药物抗体。如检测沙门菌抗体和类风湿因子等。体和类风湿因子等。（2）抗原的检测）抗原的检测 用于在临床上用反向间接凝集试验用于在临床上用反向间接凝集试验检测甲胎蛋白抗原和乙型肝炎病毒流行病学调查。在检测甲胎蛋白抗原和乙型肝炎病毒流行病学调查。在妇产科常用胶乳凝集试验检测孕妇尿中的绒毛膜促性妇产科常用胶乳凝集试验检测孕妇尿中的绒毛膜促性腺激素（腺激素（HCG）抗原。以诊断早期妊娠。）抗原。以诊断早期妊娠。34基层培训之免疫学技术（二）沉淀反应（二）沉淀反应沉淀反应是可溶性

31、抗原与相应抗体在适当的条件下发生特异性结沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在适当的条件下发生特异性结合而产生沉淀的现象。沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖等可合而产生沉淀的现象。沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖等可溶性物质。抗原与相应抗体再介质中或固相表面发生特异性结合，溶性物质。抗原与相应抗体再介质中或固相表面发生特异性结合，可分为两个阶段，第一阶段为抗原抗体特异性结合反应，在几秒可分为两个阶段，第一阶段为抗原抗体特异性结合反应，在几秒或几十秒内就可完成，出现可溶性小附和物，十分快速，但肉眼或几十秒内就可完成，出现可溶性小附和物，十分快速，但肉眼不可见。在免疫比浊法中可以测定免疫复合物形成的速率，

32、称为不可见。在免疫比浊法中可以测定免疫复合物形成的速率，称为速率比浊法。第二阶段则形成大的可见的免疫复合物，需要几十速率比浊法。第二阶段则形成大的可见的免疫复合物，需要几十分钟到数小时才能完成。如沉淀线或沉淀环。沉淀反应的常用试分钟到数小时才能完成。如沉淀线或沉淀环。沉淀反应的常用试验方法有：验方法有：35基层培训之免疫学技术1、液体内沉淀试验、液体内沉淀试验（1）絮状沉淀试验：将抗原和抗体溶液混合在）絮状沉淀试验：将抗原和抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原与抗体结合形成絮一起，在电解质存在下，抗原与抗体结合形成絮状沉淀物。状沉淀物。（2）免疫浊度测定：是将光学测量仪器与分析）免疫浊度测

33、定：是将光学测量仪器与分析检测系统相结合应用于沉淀反应，对各种液体介检测系统相结合应用于沉淀反应，对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其它小分子半抗质中的微量抗原、抗体和药物及其它小分子半抗原物质进行定量测定的方法。原物质进行定量测定的方法。36基层培训之免疫学技术其原理是：当可溶性抗原与相应抗体在适当比其原理是：当可溶性抗原与相应抗体在适当比例结合时，在特殊缓冲液中快速形成一定大小例结合时，在特殊缓冲液中快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。采用的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。采用透射比浊或散射比浊的方法，根据所测的吸光透射比浊或散射比浊的方法，根据所测的吸光度值可推算

34、出待测抗原的量。免疫浊度测定又度值可推算出待测抗原的量。免疫浊度测定又可分为速率比浊法和终点比浊法。其优点是可可分为速率比浊法和终点比浊法。其优点是可以准确定量，校正曲线比较稳定，简便快捷，以准确定量，校正曲线比较稳定，简便快捷，无污染，易于自动化，也适合于大批量标本的无污染，易于自动化，也适合于大批量标本的检测，在临床检验中得到了广泛应用。检测，在临床检验中得到了广泛应用。37基层培训之免疫学技术2、凝胶内沉淀试验：利用可溶性抗原与相应抗、凝胶内沉淀试验：利用可溶性抗原与相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀

35、线或浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。根据抗原抗体反应的方式和特性，发沉淀环。根据抗原抗体反应的方式和特性，发展为以下几种实验技术：展为以下几种实验技术：（1）单向扩散试验：在琼脂凝胶中混入一定量）单向扩散试验：在琼脂凝胶中混入一定量的抗体，使待测抗原溶液从局部向琼脂内自由的抗体，使待测抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。38基层培训之免疫学技术（2）双向扩散试验：在琼脂内抗原和抗体各自）双向扩散试验：在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最适当的比例处形成抗原抗体向对方扩散，在最适当的比例处形成抗原抗体沉淀线，观察沉淀

36、线的位置、形状及对比关系，沉淀线，观察沉淀线的位置、形状及对比关系，可作抗原和抗体的定性分析。可作抗原和抗体的定性分析。（3）免疫电泳技术：是将琼脂内电泳与免疫扩）免疫电泳技术：是将琼脂内电泳与免疫扩散相结合的一种常用的一种免疫学实验方法。散相结合的一种常用的一种免疫学实验方法。有对流免疫电泳、火箭电泳、交叉免疫电泳、有对流免疫电泳、火箭电泳、交叉免疫电泳、免疫电泳、固相免疫电泳等实验技术。免疫电泳、固相免疫电泳等实验技术。39基层培训之免疫学技术（三）补体结合试验：（三）补体结合试验：是经典途径的抗原抗体反应之一，应用绵羊红是经典途径的抗原抗体反应之一，应用绵羊红细胞和溶血剂作指示剂，建立了

37、检测抗原抗体细胞和溶血剂作指示剂，建立了检测抗原抗体与补体结合的方法，如检测梅毒的华氏试验与补体结合的方法，如检测梅毒的华氏试验（现已被淘汰）。凡是能激活补体的（现已被淘汰）。凡是能激活补体的IgG、IgM类抗体与相应抗原结合的反应都可以用本法检类抗体与相应抗原结合的反应都可以用本法检测。目前主要用于病毒性传染病诊断、流行病测。目前主要用于病毒性传染病诊断、流行病学调查以及一些自身抗体、肿瘤相关抗原等的学调查以及一些自身抗体、肿瘤相关抗原等的检测。检测。40基层培训之免疫学技术（四）免疫标记技术（四）免疫标记技术免疫标记技术是将多种可以微量或超微量检测的示踪物免疫标记技术是将多种可以微量或超微

38、量检测的示踪物（如荧光素、放射性核素、酶、化学或生物发光剂）对抗（如荧光素、放射性核素、酶、化学或生物发光剂）对抗原或抗体进行标记，制成标记物，加入抗原抗体反应体系原或抗体进行标记，制成标记物，加入抗原抗体反应体系中与相应未标记抗体或抗原进行反应，使免疫反应结果可中与相应未标记抗体或抗原进行反应，使免疫反应结果可被灵敏地进行分析测定。可以不测定免疫复合物本身，仅被灵敏地进行分析测定。可以不测定免疫复合物本身，仅对其中的标记物进行测定就可确定待测物质的含量。因此，对其中的标记物进行测定就可确定待测物质的含量。因此，免疫标记技术具有高度特异性和高度敏感性，由于它具有免疫标记技术具有高度特异性和高度

39、敏感性，由于它具有重复性好、准确性高、操作简便、易于商品化和自动化的重复性好、准确性高、操作简便、易于商品化和自动化的特点，现已发展成为生物活性物质分析重要的方法之一。特点，现已发展成为生物活性物质分析重要的方法之一。41基层培训之免疫学技术1、放射免疫技术、放射免疫技术放射免疫技术是利用放射性核素的灵敏性和精确性与放射免疫技术是利用放射性核素的灵敏性和精确性与抗原抗体反应的特异性相结合而创建的一类免疫测定抗原抗体反应的特异性相结合而创建的一类免疫测定技术。常用的放射性核素有技术。常用的放射性核素有 125I和和 131I等，主要有两种等，主要有两种基本类型：（基本类型：（1）放射免疫分析：是

40、最经典的模式，）放射免疫分析：是最经典的模式，是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记的抗是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记的抗原竞争特异性抗体为基本原理来测定抗原含量的分析原竞争特异性抗体为基本原理来测定抗原含量的分析方法。（方法。（2）免疫放射分析：是用放射性核素标记的）免疫放射分析：是用放射性核素标记的过量抗体方法。抗体与待测抗原直接结合，采用固相过量抗体方法。抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析。免疫分析。42基层培训之免疫学技术放射免疫技术由于其测定的灵敏度高，特异性放射免疫技术

41、由于其测定的灵敏度高，特异性强、精密度好，而且可对抗原和半抗原进行测强、精密度好，而且可对抗原和半抗原进行测定，对仪器设备条件要求不高，所以广泛应用定，对仪器设备条件要求不高，所以广泛应用于医学检验。常用于各种激素、微量蛋白质、于医学检验。常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。其缺点肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。其缺点是：放射性污染和危害；常用核素半衰期短，是：放射性污染和危害；常用核素半衰期短，试剂盒稳定期短、不易快速及自动化检验等，试剂盒稳定期短、不易快速及自动化检验等，已逐步被其它标记免疫分析方法所取代。已逐步被其它标记免疫分析方法所取代。43基层培训之免疫学

42、技术2、荧光免疫技术、荧光免疫技术荧光免疫技术是将免疫学反应的特异性与荧光技术荧光免疫技术是将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法，是最早发展的一种的敏感性结合起来的一种方法，是最早发展的一种免疫标记技术。其原理是利用荧光素标记抗体，使免疫标记技术。其原理是利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本的待测抗原特异性之在涂片上或组织切片上与标本的待测抗原特异性地结合，采用高发光效率的点光源，透过滤光板发地结合，采用高发光效率的点光源，透过滤光板发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，然后借助荧光显微镜观察底物

43、片上的而产生荧光，然后借助荧光显微镜观察底物片上的荧光染色形态，判断待测抗原或抗体。荧光染色形态，判断待测抗原或抗体。44基层培训之免疫学技术荧光免疫技术在临床检验上常用作细菌、病毒荧光免疫技术在临床检验上常用作细菌、病毒和寄生虫的检验以及自身抗体的检测。免疫荧和寄生虫的检验以及自身抗体的检测。免疫荧光间接染色法可用于测定血清中的抗体，如免光间接染色法可用于测定血清中的抗体，如免疫荧光用于梅毒螺旋体抗体的检测是梅毒特异疫荧光用于梅毒螺旋体抗体的检测是梅毒特异性诊断方法之一。间接免疫荧光试验是当前公性诊断方法之一。间接免疫荧光试验是当前公认的最有效的检测疟疾抗体的方法。认的最有效的检测疟疾抗体的

44、方法。45基层培训之免疫学技术3、酶免疫技术、酶免疫技术酶免疫技术是经典标记免疫技术之一，是以酶标记抗酶免疫技术是经典标记免疫技术之一，是以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术。酶免体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术。酶免疫技术是利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高疫技术是利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原特异性抗原-抗体免疫学反应检测敏感性的一种标记免抗体免疫学反应检测敏感性的一种标记免疫技术。临床常用的酶免疫技术是酶联免疫吸附试验疫技术。临床常用的酶免疫技术是酶联免疫吸附试验（见第三章第（见第三章第3节）节）46基层培训之免疫学技术酶免疫测定除具有高度的敏

45、感性和特异性，酶标记试剂酶免疫测定除具有高度的敏感性和特异性，酶标记试剂比较稳定，而且易与其他相关技术偶联，因此发展迅速。比较稳定，而且易与其他相关技术偶联，因此发展迅速。市场上各种符合质量要求的商品试剂盒（提供有包被好市场上各种符合质量要求的商品试剂盒（提供有包被好的的固相载体、酶标记物及其底物和洗涤液等全套试剂的的固相载体、酶标记物及其底物和洗涤液等全套试剂成分）和自动或半自动检测仪上不断研究发明问世，极成分）和自动或半自动检测仪上不断研究发明问世，极大地促进了酶免疫测定技术的普及。特别是固相载体酶大地促进了酶免疫测定技术的普及。特别是固相载体酶免疫技术与胶体金技术等的结合，使市场上出现了

46、一大免疫技术与胶体金技术等的结合，使市场上出现了一大批适用于家庭及床旁检测的快速试剂盒，大大方便了人批适用于家庭及床旁检测的快速试剂盒，大大方便了人群的自我保健和临床的快速诊断。群的自我保健和临床的快速诊断。ELISA则应用更为广则应用更为广泛，几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测。泛，几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测。47基层培训之免疫学技术该技术的检测灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标记该技术的检测灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标记试剂能够较长时间保持稳定，检测方法简便安全易行，试剂能够较长时间保持稳定，检测方法简便安全易行，而且容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广的新方法而

47、且容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广的新方法等。因此，酶免疫技术在方法学上的研究重点除与其他等。因此，酶免疫技术在方法学上的研究重点除与其他标记免疫技术一样需制备高纯度抗原和高亲和力的特异标记免疫技术一样需制备高纯度抗原和高亲和力的特异性抗体外，还包括：选择高活性的纯化标记用酶；试验性抗体外，还包括：选择高活性的纯化标记用酶；试验有效的交联试剂和交联反应，制备高质量的酶标记物；有效的交联试剂和交联反应，制备高质量的酶标记物；选用适宜的酶作用底物系统；确定有效的分离结合选用适宜的酶作用底物系统；确定有效的分离结合/游游离反应物的方法；筛选操作步骤以及研究自动化测定技离反应物的方法；筛选操作步骤

48、以及研究自动化测定技术等。术等。48基层培训之免疫学技术4、金标免疫技术、金标免疫技术 是以胶体金为标记物的是以胶体金为标记物的免疫标记技术。（见第三章第免疫标记技术。（见第三章第4节）节）49基层培训之免疫学技术第二节第二节 免疫胶乳试验及应用免疫胶乳试验及应用 50基层培训之免疫学技术一、胶乳凝集试验原理及方法一、胶乳凝集试验原理及方法（一）原理：胶乳凝集试验是以聚苯乙烯胶乳（一）原理：胶乳凝集试验是以聚苯乙烯胶乳颗粒为载体的间接凝集试验。使用抗原或抗体颗粒为载体的间接凝集试验。使用抗原或抗体致敏胶乳颗粒，再用此致敏胶乳检测相应的抗致敏胶乳颗粒，再用此致敏胶乳检测相应的抗体或抗原。胶乳凝集

49、试验所用的胶乳颗粒是人体或抗原。胶乳凝集试验所用的胶乳颗粒是人工合成的载体，均一性较好，性能比红细胞稳工合成的载体，均一性较好，性能比红细胞稳定，但与蛋白质的结合能力及凝集性能不如红定，但与蛋白质的结合能力及凝集性能不如红细胞，因此胶乳凝集试验敏感性不如血凝试验。细胞，因此胶乳凝集试验敏感性不如血凝试验。51基层培训之免疫学技术（二）（二）试验方法：试验方法：1、胶乳凝集试验：在反应板的一格中，先加受检标、胶乳凝集试验：在反应板的一格中，先加受检标本一滴，再加致敏胶乳一滴，连续摇动本一滴，再加致敏胶乳一滴，连续摇动23min观察观察结果。胶乳凝集者为阳性。不凝集者为阴性。同时作结果。胶乳凝集者

50、为阳性。不凝集者为阴性。同时作阴、阳性对照。阴、阳性对照。2、胶乳凝集抑制试验：先加受检标本一滴，再加一、胶乳凝集抑制试验：先加受检标本一滴，再加一滴相应抗血清混匀，再加一滴致敏胶乳抗原，连续摇滴相应抗血清混匀，再加一滴致敏胶乳抗原，连续摇动动23min观察结果。胶乳凝集者为阴性，不凝集者观察结果。胶乳凝集者为阴性，不凝集者为阳性。为阳性。52基层培训之免疫学技术（三）（三）注意事项：注意事项：1、受检标本和试剂的加入顺序应遵照规定的步骤，否、受检标本和试剂的加入顺序应遵照规定的步骤，否则无法判定结果。则无法判定结果。2、试剂一般保存在、试剂一般保存在46较为适宜，胶乳试剂不能冷较为适宜，胶乳