新一代测序技术的引入-ThermoFisherScientific课件.ppt

1、新一代测序技术在疑难案新一代测序技术在疑难案件中的应用件中的应用CE法庭DNA检测技术金标准三十年的法庭科学三十年的法庭科学DNA技术发展过程中技术发展过程中,CE技术屡立奇功技术屡立奇功,目前大多数案件能够用目前大多数案件能够用CE+STR的方法解决的方法解决数据可靠、工作简单、快速、经济、数据库系统数据可靠、工作简单、快速、经济、数据库系统DNA扩增片段长度多态性人类重复序列DNA探针复合扩增STR位点的DNA分型新一代技术的融入？DNA检验技术1985年才开始运用于法庭科学检验鉴定中，但由于可以到达个人认定的作用发展迅速。20多年的发展，DNA从DNA指纹图发展到STR检验。DNA实验室

2、检验灵敏度得到了提高，可以检测到ng(106g)级STRs英国第一起移民纠纷案的DNA指纹图高降解识别率高降解识别率高识别率高识别率能自动分型能自动分型结果数字化结果数字化快速分型快速分型检验时间缩短检验时间缩短基于基于PCR方法方法微量微量DNA等位基因不连锁等位基因不连锁费用较贵费用较贵信息量大主要有以下几方面的作用 1、同一认定：除同卵双生的双胞胎、骨髓移植的患者外，两个人基因分型相同的概率只有100亿分之一（1010）。2、亲缘认定（遗传关系）母系遗传母系遗传（mtDNA）父系遗传（Y染色体）?uncle3rd cousinThomas Jefferson IIField Jeffer

3、sonPeter JeffersonPresident Thomas JeffersonEston HemingsThomas WoodsonDifferent Y HaplotypeSame Y HaplotypeJefferson Y HaplotypeJefferson Y Haplotype?3、现场重建、现场重建 嫌疑人卢某血 1of6 样样本高度降解，本高度降解，仅仅能得到部分、甚至得不到能得到部分、甚至得不到STRSTR图谱图谱 复复杂杂混合混合样样本解本解释释 复复杂亲缘杂亲缘关系关系鉴鉴定定 未知来源的未知来源的组织组织、体液溯源、体液溯源 表型推断表型推断 始祖推断始祖推断

4、 当前法医当前法医DNADNA实验室的挑战实验室的挑战更高的要求，更多的挑战更高的要求，更多的挑战疑难案件的检测有待新技术的融入10混合检测降解/痕量检材数据库无记录疑难复杂家系但CE本身技术上的局限性,无法在一些疑难案件上取得实质性的突破,领域中需要有新技术的融入新一代测序技术的引入新一代测序技术(Next Generation Sequencing)也称高通量测序 同时能测几千到几百万的DNA片段，后续通过组装和对比完成。下一代测序平台能测到200-400bp，甚至更长。高通量；全基因组；高覆盖度广东省厅广东省厅NGSNGS平台一览平台一览1of6 124 SNP位点（含90个常染色体位点

5、和34个Y染色体位点）Pi ranges from 1x10-31 6x10-35 扩增长度短(平均132,141nts,)适合降解 DNA 推荐1ng 起始DNA 对于 43 Ken Kidd SNPs，有99.99%的一致性微量、高度降解检材微量、高度降解检材,复杂亲缘关系辅助鉴定复杂亲缘关系辅助鉴定HID-Ion AmpliSeq 身份鉴定试剂盒Coverage%PositiveGenotypeMajor Allele每个每个SNP位点信息位点信息样本间的比对样本间的比对Y 单倍型预测单倍型预测HID-Ion AmpliSeq 身份鉴定试剂盒 因祖坟迁移事件，80余岁的事主无法确定祖坟内

6、究竟是否是自己的祖坟。故需要做相关亲缘鉴定。但由于严重降解,毛细管电泳技术无法得到有效的分型。故通过二代测序技术进行进一步的检测 NGS案例应用(1):高度降解检材检材状况：案件背景案件背景检材状况 NGS案例应用(1):高度降解检材牙齿检材牙齿检材:参照血卡参照血卡:牙齿检材已经严重降解,无法得到有效分型,并进行下一步的鉴定 NGS案例应用(1):高度降解检材NGS结果展示结果展示:利用ID panel进行个体识别身份验证：牙齿检材 对照检材符合孟德尔规律位点不符合孟德尔规律的位点常染色体位点79906811Y染色体位点 24 3423 1全部位点103 1249112NGSNGS测序结果显

7、示，测序结果显示，9090个常染色个常染色SNPSNP位点中，双方均出齐的位点为位点中，双方均出齐的位点为7979个，其中有个，其中有1111个位点不符合个位点不符合孟德尔遗传规律。且孟德尔遗传规律。且Y Y位点有一个位点不一致，故排除坟墓中的故人是事主的生父位点有一个位点不一致，故排除坟墓中的故人是事主的生父 NGS案例应用(1):高度降解检材 最终信息常染色体位点Y染色体位点共出位点无名尸结果741993 因无相关数据库和对照样本，所以无法进行相关比对。但是可建议放入宗卷，以便将来数因无相关数据库和对照样本，所以无法进行相关比对。但是可建议放入宗卷，以便将来数据库或其他参照样本可以进行对比

8、据库或其他参照样本可以进行对比利用ID panel进行个体识别身份验证：CE结果显示无名尸骨高度降解：NGS案例应用(2):高度降解无名尸 鉴定莫鉴定莫XXXX和莫和莫XXXX的丈夫是否为孩子的丈夫是否为孩子A A和孩子和孩子B B的亲身父母。的亲身父母。莫莫XXXX为骨髓移植患者，且移植已多年，效果不错，考虑其血液可能表现为供为骨髓移植患者，且移植已多年，效果不错，考虑其血液可能表现为供体基因分型，遂要求采其口腔拭子、血拭子、指甲和头发；要求提供骨髓移体基因分型，遂要求采其口腔拭子、血拭子、指甲和头发；要求提供骨髓移植供体的血拭子；其丈夫、孩子植供体的血拭子；其丈夫、孩子A A、孩子、孩子B

9、 B的口腔拭子共的口腔拭子共8 8份检材，使用份检材，使用Identity SNP Panel Identity SNP Panel 在在PGMPGM平台上检测。平台上检测。同时使用同时使用Global FilerGlobal Filer试剂盒结果作为参照试剂盒结果作为参照.NGS案例应用(3):移植患者亲子鉴定莫莫XXXX、莫、莫XXXX丈夫、两个孩子的丈夫、两个孩子的SNPSNP分型符合孟德尔遗传；该结果与使用分型符合孟德尔遗传；该结果与使用Global Global FilerFiler做出来的结果完全一致。做出来的结果完全一致。莫莫XXXX血液与骨髓供体的血液与骨髓供体的SNPSNP分

10、型完全一致；与自身头发分型不一致。分型完全一致；与自身头发分型不一致。莫莫XXXX头发、指甲的头发、指甲的SNPSNP分型完全一致；分型完全一致；Samples莫-口腔莫丈夫-口腔 孩子B-口腔莫-血骨髓供体-血 孩子A-口腔莫-头发莫-指甲莫-口腔 67798888819191莫丈夫-口腔67 686565686262孩子B-口腔7968 7373868282莫-血886573 100767979骨髓供体-血886573100 767979孩子A-口腔8168867676 8282莫-头发916282797982 100莫-指甲916282797982100 NGS案例应用(3):移植患者亲

11、子鉴定Bone,teeth,and hair are the typical biological sources left from missing persons or remains失踪人员/无名尸体常见生物性检材：骨头、牙齿、头发Ion AmpliSeq technology can streamline the mtGenome sequencing workflowIon AmpliSeq 技术科简化线粒体基因组测序流程线粒体全基因组/高变区测序试剂盒Average amplicon length is 163ntAverage amplicon overlap of 11ntIo

12、n AmpliSeq mtGenome Panels线粒体全基因组测序线粒体全基因组测序打拐工作开展过程中怀疑安徽省的沈某（现年43岁）是山西省的连某（现年59岁，疑似姐姐）家中走失亲人。由于年事已高，双亲皆故。所以需要进行疑似亲姐妹全同胞/半同胞鉴定。解决思路：若直接采取传统CE对全同胞进行检测需要检测进行至少超过39个STR位点，在根据IBS评分来进行断定，若IBS评分为42分以上，准确率在百分之九十五以上。但其是建立在全同胞的基础，结合打拐案情，可直接对两者的线粒体进行测序，判断是否来自同一母系。NGS案例应用(4):疑似亲姐妹打拐鉴定案件背景案件背景常规思路线粒体二代测序结果展示线粒体

13、二代测序结果展示软件分析的参考序列软件分析的参考序列参考序列序列在该位点上的分型参考序列序列在该位点上的分型测试样本在该位点上的分型测试样本在该位点上的分型连某沈某一致位点不一致位点线粒体全基因组25271326高变区24424高变区14618通过线粒体全基因组测序，排除连某与沈某是来自于同一母系通过线粒体全基因组测序，排除连某与沈某是来自于同一母系：若直接采取传统CE对全同胞进行检测需要检测进行至少超过39个STR位点，在根据IBS评分来进行断定，若IBS评分为42分以上，准确率在百分之九十五以上。但其是建立在全同胞的基础，结合打拐案情，可直接对两者的线粒体进行测序，判断是否来自同一母系。N

14、GS案例应用(5):疑似亲姐妹打拐鉴定案件背景案件背景常规思路疑似妹妹疑似姐姐一致位点不一致位点线粒体全基因组4848471高变区25550高变区14440通过线粒体全基因组测序，不排除两份受检者来自于同一母系通过线粒体全基因组测序，不排除两份受检者来自于同一母系PS:不一致位点为疑似姐姐在非高变区存在一个点异质性变异 没有嫌疑人，DNA数据库未比中 始祖推断或者表型推断，如眼睛颜色、头发颜色和皮肤颜色，可以给案件侦查提供更多线索HID-Ion AmpliSeq 祖先推断试剂盒 扩增子长度短(平均长度122;130 nt)推荐1ng 起始DNA 55 Ken Kidd SNPs，99.77%的

15、一致性165 常染色体SNP版式设计版式设计165 常染色体SNP适合案件检材或者降解DNA扩增片段短(平均122;130 nt)推荐1ng 起始DNA对于55个 Ken Kidd SNP，有99.77%一致性HID-Ion AmpliSeq始祖推断试剂盒对实验室积累种族样本,包括5个封闭的满族家系和5个封闭的新疆家系进行始祖定位始祖认定二代测序结果展示始祖认定二代测序结果展示5组封闭满族种族定位：尽管都能定位到Han-HapMap,但是无法在地域上进一步细分 NGS案例应用(6):满族及维族始祖认定五组新疆建库样本种族定位：基本能够定位在和维族遗传很近的民族(Hazara),在地域定位比较一

16、致准确 NGS案例应用(6):满族及维族始祖认定NGS-STRNGS-STR用于用于CECE辅助的优势辅助的优势更加适合降解检材：容纳更多的mini-STR获得更多的信息：同一分型不同序列NGS-STRNGS-STR用于用于CECE辅助的优势辅助的优势可以给予更多信息可以给予更多信息9947A，NGS-D8S1179基因分形结果基因分型的结果基因分型的结果类似于类似于CE的展示结果的展示结果同一基因型不同分型的结果同一基因型不同分型的结果CE-STR复杂家系NGS-STR验证(1)将十余对CE-STR复杂家系用STR-panel进行验证：一致案例父亲分型：11,13母亲分型：8，98，12子代

17、分型：CE-STR复杂家系NGS-STR验证(2)4,1413,13 4,13父亲NGS分型：母亲NGS分型：子代NGS分型：家系背景 通过CE结果显示父亲在D19S433的分型为14,14.目前在D19S433的分型为13,13.小孩的分型为13,13.初步判定为时一个一步突变的家系.故用新一代测序平台进行STR分型验证.CE结果与二代测序不符,且二代测序结果符合孟德尔遗传定律CE-STR复杂家系NGS-STR验证(2)/1138案件背景案件背景 重新采用ID-PLUS试剂盒对结果进行CE验证,发现父亲和子代在D19S433基因座上确实存在4型的稀有突变,由于4型离基因座较远,且接近引物序列,大小约为80bp,故被忽略.NGS在法庭科学应用面临的挑战 行业标准和相关指南的出台 基础数据库的建立及与一代STR数据库的兼容性 适合于中国人群的群体数据建立 大量数据的信息挖掘及处理 价格昂贵 软件及更多试剂盒