禽流感免疫胶体金快速检测技术研究课件.ppt

1、禽流感免疫胶体金快速检测技术研究研究的背景和意义AI爆发时来势凶猛，新型毒株的出现和致病力的增强等特点始终威胁着畜牧业和人类健康，对禽流感进行实时监测已成为畜禽疾病检测的重要内容。禽流感的检测方法虽然已有较多报道，但多数方法需要特殊的仪器设备，且在灵敏性、特异性等方面存在不同差异，多数方法只能在实验室中完成。因此急需建立一种适合基层使用的禽流感快速检测方法。免疫胶体金层析法是将免疫胶体金技术与层析分析技术有机结合起来的一种快速免疫学检测技术。近几年该技术已经引起兽医界的重视，猪瘟免疫抗体、口蹄疫抗体、猪伪狂犬病抗体快速检测及鸡传染性法氏囊快速诊断等均有用相关免疫胶体金层析测试条进行快速检测的试

2、验。禽流感免疫胶体金测试条可在十几分钟内实现对禽流感的快速检测，该测试条在国外已有生产，我国还未见有相关研究的报道。本试验将免疫胶体金诊断技术用于AIV的检测，该方法确实立将为实现临床快速、准确诊断禽流感提供有效检测方法。研究内容研究内容 1.通过对抗AIV McAb、羊抗AIV多克隆抗体的制备，获得高效价的单抗和多抗。2.制备性能稳定、免疫学活性好的金标AIV McAb，并将其将其固定于玻璃纤维膜上作为显色源，将抗AIV多克隆抗体结合于硝酸纤维素膜上作为捕获抗体，制备AIV免疫胶体金层析测试条，初步建立AIV免疫胶体金层析法。通过与双抗体夹心ELISA比较、对AIV免疫胶体金层析法作出评定。

3、BALB/c鼠细胞融合，筛选、制备、鉴定、提纯单克隆抗体间接ELISA法建立AIV免疫胶体层析法禽流感抗原免疫动物比较 采小鼠脾脏集小鼠血清 羊对AIV免疫胶体金层析法作出评定制备金标抗体技术路线技术路线制备羊抗AIV多克隆抗体胶体金颗粒的制备确定最适标记量、标记条件结合垫上喷涂金标抗体购进羊抗鼠IgG处理结合垫及样品垫NC膜上喷涂各种抗体建立禽流感夹心ELISA诊断方法免疫胶体金测试条的组装 试验一试验一 抗抗AIV McAb的研制的研制lAIV抗原的纯化及鉴定 lBALB/c小鼠的免疫 l阳性McAb筛选方法的建立 l细胞融合及培养 lMcAb的大量制备及生物学特性鉴定：McAb的Ig亚型

4、鉴定，McAb特异性鉴定试验，McAb的提纯及效价测定 标准禽流感抗原经葡聚糖凝胶标准禽流感抗原经葡聚糖凝胶 Sephadex G-200 Sephadex G-200柱层析，分柱层析，分次收集并测定各管蛋白含量，经过次收集并测定各管蛋白含量，经过pHpH为洗脱，所得的洗脱峰为洗脱，所得的洗脱峰如图。如图。00.20.40.61 13 25 37 49 61 73 85管号OD280值系列1AIV的别离纯化的别离纯化收集收集6178号管内样品，用国外标准禽流号管内样品，用国外标准禽流感胶体金试纸条初步鉴定结果如图感胶体金试纸条初步鉴定结果如图。AIV胶体金试纸条鉴定结果 AIV AIV 10

5、SDSPAGE鉴定结果鉴定结果 1 2 3 1,泳道为提纯提纯前AIV抗原；2泳道为提纯后AIV抗原；3泳道为蛋白质Marker 间接ELISA抗原与抗体的工作浓度确实定 AbAg(g/ml)1:5001:10001:20001:40001:8000空白+401.85 0.0841.68 0.0731.49 0.0691.31 .0781.14 0.0680.057 0.058201.79 0.0791.61 0.0721.43 0.0681.28 0.0791.11 0.0720.059 0.062101.67 0.0711.58 0.0671.34 0.0691.15 0.0821.04

6、0.0740.061 0.06651.45 0.0641.26 0.0741.13 0.0700.97 0.0760.86 0.0870.061 0.0582.51.14 0.0721.03.0.0720.82 0.0740.69 0.0750.54 0.0710.058 0.0631.250.98 0.0760.73 0.0790.51 0.0710.34 0.0690.21 0.0890.064 0.0630.750.71 0.0730.52 0.0700.38 0.0750.21 0.0710.1 0 6 0.0690.062 0.0610.350.57 0.0840.39 0.0810

7、.23 0.0790.19 0.0750.08 0.0890.061 0.057抗原工作浓度为10 g/ml，一抗的工作浓度为1:8000 融合前后细胞形态观查融合前后细胞形态观查 SP2/0 3d 5d 6d 8d 细胞融合及筛选细胞融合及筛选选择其中选择其中ODOD450450值较高的孔进行亚克隆，采用有限稀释法，经过反复筛选及二次值较高的孔进行亚克隆，采用有限稀释法，经过反复筛选及二次亚克隆获得两株能稳定分泌抗亚克隆获得两株能稳定分泌抗AIVAIV抗体的杂交瘤细胞株，分别命名抗体的杂交瘤细胞株，分别命名5A65A6，5G75G7。板号融合孔数融合率ELISA 阳性孔数ELISA阳性率16

8、969/9699/6924848/9677/4836767/9688/6746868/9699/6856464/961212/64总计316316/4804545/316Total65.814.2%McAb的Ig亚型鉴定试纸条的G1，区各出现一条清晰的条带，说明单抗的亚型属IgG1,型。McAb的提纯 1 2 3 单抗提纯SDSPAGE电泳图注：1,2泳道为提纯AIV McAb；3泳道为蛋白质Marker。McAb交叉间接ELISA试验结果 杂交瘤细胞株小鼠腹水稀释度（效价）杂交瘤细胞株小鼠腹水稀释度（效价）抗原1:4001:8001:16001:32001:64001:128001:2560

9、0阴性阳性空白NDV MDV IBV H9 AIV H5 AIV 标准AIV0.1070.109 0.115 1.983 1.985 1.9890.1110.107 0.116 1.788 1.786 1.7720.1060.109 0.107 1.475 1.455 1.4720.1020.115 0.124 1.280 1.279 1.2580.1030.110 0.121 0.985 0.980 0.9790.1090.111 0.113 0.951 0.942 0.9460.1060.117 0.126 0.838 0.844 0.8470.0880.086 0.079 0.114 0

10、.109 0.1070.109 0.1080.080 1.79 1.78 1.7980.087 0.082 0.0830.079 0.081 0.085 提纯腹水效价间接ELISA测定结果 效价腹水1:10001:20001:40001:80001:160001:320001:640001:128000阴性空白提纯前提纯后1.454 1.0871.269 0.9681.083 0.7590.952 0.6120.790 0.5490.633 0.4290.4290.524 0.3140.4470.447 0.2560.1480.1320.0小结小结 1本试验用提纯的禽流感标准抗原通过间接ELI

11、SA法筛选最终获得了两株抗禽流感McAb细胞株，将其命名为5A6，5G7。特异性试验证明所获得的两株杂交瘤细胞分泌的抗体能特异性针对禽流感抗原的共同表位。2对单抗采用乳胶凝集试剂条进行亚型鉴定，结果说明单抗的亚型属IgG1,型。采用辛酸-硫酸铵提取IgG1型的单抗的方法，到达了较满意的结果。提纯后的单抗特异性好，效价高，可直接用于胶体金标记，将在AIV的诊断和检测发挥重要作用。试验二试验二 禽流感免疫胶体金层析法的建立禽流感免疫胶体金层析法的建立羊抗AIV抗体的制备 制备胶体金颗粒、金标抗体,免疫胶体金测试条的组装 免疫胶体金层析法各种最正确条件的选择 羊抗AIV抗体效价测定 琼扩试验效价1:

12、8以上 不同胶体金颗粒标记抗体效果不同胶体金颗粒标记抗体效果如表所示，如表所示，40 nm的胶体金很不稳定，制备起来的胶体金很不稳定，制备起来很困难，容易产生沉淀，很困难，容易产生沉淀，20 nm的胶体金灵敏度的胶体金灵敏度较差；较差；30 nm的胶体金稳定性、灵敏度均较好。的胶体金稳定性、灵敏度均较好。质量 20 nm 30 nm 40 nm 稳定性 灵敏度 半年内未出现沉淀 15ng/ml 半年内未出现沉淀 5ng/ml 2月后出现沉淀 5ngml 抗体最适稳定量抗体最适稳定量 空白 5 10 15 20 25 30 35 40 45 目测法结果如以下图，使胶体金的红色不变的最低抗体稳定量

13、是15 g/ml。在此根底上再加上20%即为稳定所需抗体的实际用量，18 g/ml。参加抗体后反响时间确实定 金颗粒中参加最正确量的抗体后不同反响时间的标记结果说明，在70 min以上的胶体金溶液存放半年以上无沉淀产生。而45 min和60 min标记的金颗粒分别在3个月、5个月出现沉淀。因而选择标记时间为70 min。金标抗体的稳定剂的选择 BSA稳定的标记胶体金，放在4达1年以上半仍然保持良好性能，而用PEG稳定的标记胶体金放在4，4个月左右就有分层现象，且灵敏度亦下降。因此，选择BSA作稳定剂。金标抗体的保存液的选择 硼酸缓冲液中以含5 mM NaCl、1%BSA作保存液的胶体金,稳定性

14、良好，半年内未出现沉淀；含5 mM NaCl、10%蔗糖保存的胶体金半年内出现沉淀；含5mM NaCl、20%蔗糖保存的胶体金，2月后出现沉淀。结合垫处理液的选择 编号为的结合垫处理液浸泡过的玻璃纤维膜释放金标抗体的效果最好。试剂 Na2B4O710H2O(mM）70 708080 90 90PVA(%)0.10.20.20.10.20.1Tween-20(%)0.20.20.10.10.10.1BSA(%)0.30.30.30.30.30.1样品垫处理液的选择样品垫处理液的选择 编号为的液体处理的样品垫加样后，样品垫上的流速快慢适中，符合要求，约10min内样品从测试条加样端流到吸水纸端，且

15、可在一定程度上控制非特异性反响。试剂Na2B4O710H2O(g)1.421.42 1.422.02.02.0PVP-10(g)1.02.02.02.02.01.0Triton-100(ml)332322BSA(g)0.50.50.60.60.60.5金标抗体、羊抗金标抗体、羊抗AIV IgG、羊抗鼠、羊抗鼠IgG喷涂量确实定喷涂量确实定试验组试验组金标抗体喷涂量金标抗体喷涂量羊抗鼠羊抗鼠IgG喷涂量喷涂量羊抗羊抗AIV IgG喷涂量喷涂量(OD520=0.62)（8.0 mg/ml）（5.0 mg/ml）11.50.50.521.50.750.7531.51.01.042.50.51.052

16、.00.750.562.00.50.7572.01.00.7582.50.750.592.51.01.0 7号效果最好，当稀释100后OD520的金标抗体喷量为2.0 l/cm，羊抗AIV IgG(5.0mg/ml)喷量0.75 l/cm，羊抗鼠IgG(8mg/ml)喷量为l/cm时检测线、质控线最为清晰。1 2 3 4 5 6 7 8 9 阴性测试方法与评判测试方法与评判 取待检样品取待检样品50 ul，滴于测试条的加样，滴于测试条的加样区；待测样品按如以下图的方向，通过区；待测样品按如以下图的方向，通过层析作用，从加样区经过检测线、质控层析作用，从加样区经过检测线、质控线，最后到达吸附区。

17、反响经过线，最后到达吸附区。反响经过10-15 min即可判定结果。即可判定结果。加 样 区吸 附 区反 应 区样品层析方向质控线检测线AIV检测的评判标准 阳性 阴性试纸条上出现两条红色为AIV阳性，假设只有对照线为红色那么判为阴性。两条线均无显色为测试条失效 稳定性试验 1d 3d 5d 7d 8d37放置 1d、3d、5d、7d后的检测结果无明显差异，37放置8d天后检测线不清晰；4放置1、2、3、4、5、6个月后的检测结果无明显差异，4放置7个月检测线不清晰。小结小结 l 成功地制备了30nm的胶体金颗粒，并制得了稳定的金标McAb。l初步建立了免疫层析装置中各系统的稳定反响体系。l利

18、用抗AIV单抗及羊抗禽流感多抗初步建立了用于检测AIV的免疫胶体金层析检测法，该方法具有一定的灵敏度，操作简便，反响快速、特异性强等特点。试验三试验三AIV免疫胶体金层析法与夹心免疫胶体金层析法与夹心ELISA法的比较法的比较l建双抗体夹心ELISA方法lAIV免疫胶体金层析法与双抗夹心ELISA法的比较 灵敏度试验、特异性试验、准确度试验、重复性试验夹心ELISA法的程序表步骤 内容 加入试剂 加入量(l)作用时间及温度 1包被一抗 McAb(Ab1)100 37，2 h,再经4过夜 2封闭 5%脱脂乳 300 37，2 h 3加入待检样品 阳性/阴性抗原 100 37，2 h 4加入二抗

19、羊抗AIV IgG(Ab2)100 37，1 h 5加入酶标抗体 兔抗羊酶标抗体(Ab3)100 37，1 h 6显色 加入底物溶液 100 37，10-15 min 7加终止液 2 mol/L硫酸 5037或室温 5 min 8酶标仪测OD450值 Ab1Ab1、Ab2Ab2最正确工作浓度的选择确实定最正确工作浓度的选择确实定 用AIV标准抗原和阴性抗原进行了方阵滴定3次重复，结果分析说明，选择Ab1浓度为1.25 g/ml、Ab2稀释度为1:32000为最正确工作浓度。灵敏度试验 以不同浓度AIV 标准抗原，做灵敏度试验，以OD450值为纵坐标，抗原浓度为横坐，制备标准曲线如图，线性检测范

20、围在，其线性良线性检测范围在，其线性良好，最低检测下限为。好，最低检测下限为。对不同稀释浓度的对不同稀释浓度的AIV标准抗原进行检测，重复检测标准抗原进行检测，重复检测16次，浓度在的结果为阳性。次，浓度在的结果为阳性。在与之间设在与之间设7ng/ml、5ng/ml、几个浓度度，再次进行检测，当抗原浓、几个浓度度，再次进行检测，当抗原浓度为度为5ug/ml时检测线反响结果较明现，抗原浓度为时反响结果不明显。初步判时检测线反响结果较明现，抗原浓度为时反响结果不明显。初步判定定AIV免疫胶体金层析法检测的灵敏度为免疫胶体金层析法检测的灵敏度为5ng/ml。7 阴性阴性 AIV免疫胶体金层析法免疫胶

21、体金层析法灵敏度测定结果特异性试验特异性试验 夹心ELISA法、AIV免疫胶体金层析法检测NDV、IBV、IBDV、MDV和禽流感标准抗原，用PBST液作空白对照。结果如下，双抗体夹心ELISA方法与AIV免疫胶体金层析法，特异性强，与其他禽病呈阴性反响。待检样品AIVNDVIBV IBDVMDV空白平均OD450值 1.376 0.078 0.073 0.0740.0790.062 AIV NDV MDV IBV MDV 空白 准确度试验 对标准曲线抗原高，中，低三个浓度的平均OD值检测，结果说明平均回收率为，说明所建立的双夹心ELISA法具有较高的准确度，在作为对照试验时可信度较高，保证了

22、在进行检测时其他指标的可靠性。抗原浓度 OD值1 OD值2 质控浓度回收率（%）平均回收率（%）250 ng/ml 1.014 0.997 231.65 92.6697.63 30 ng/ml0.539 0.521 28.93 96.447.5 ng/ml 0.230 0.238 7.79 103.8注：OD值1为相应标准抗原浓度对应的值 OD值2为在相应抗原浓度下实际检测所得值 精确度试验精确度试验 对不同浓度标准AIV抗原在不同批次的检测结果如上，用双夹心ELISA法检测平均OD450值，批内平均变异系数为；批间平均变异系数为；AIV免疫胶体金层析法的阳性检出率，批内平均变异系数为；批间平

23、均变异系数为。说明这两种方法重复性好，符合率高，说明二者具有较高的重复性，其性能稳定。抗原浓度抗原浓度（ng/mlng/ml）双夹心双夹心ELISAELISA试纸条法试纸条法批内批内(5(5次次)批间批间(5)(5)次次批内批内(5)(5)次次批间批间(5)(5)次次平均平均ODOD值值CV%CV%平均平均ODOD值值CV%CV%阳性率阳性率(%)(%)CV%CV%阳性率阳性率CV%CV%2502500.9980.9980.031 3.10.031 3.10.9940.9940.042 4.230.042 4.2399.099.01.98 2.01.98 2.098.598.52.058 2.

24、622.058 2.6230300.5510.5510.028 5.080.028 5.080.5540.5540.030 5.420.030 5.4298.098.03.43 3.53.43 3.597.497.44.71 4.844.71 4.84 7.5 7.50.2350.2350.016 6.80.016 6.80.2340.2340.019 8.120.019 8.1296.5196.515.79 6.05.79 6.094.1694.16 6.78 7.2 6.78 7.2小结小结 l建立了建立了AIVAIV双抗夹心双抗夹心ELISAELISA法，作为胶体金试剂条检法，作为胶体金

25、试剂条检测法的参比方法，其线性良好，线性检测范围在，测法的参比方法，其线性良好，线性检测范围在，最低检测下限为；该方法具有灵敏度高，特异性强，最低检测下限为；该方法具有灵敏度高，特异性强，准确度高，重复性好等特点。准确度高，重复性好等特点。l通过与通过与AIVAIV双抗夹心双抗夹心ELISAELISA法比较研究说明，本试验法比较研究说明，本试验所建立的所建立的AIVAIV免疫胶体金层析法在检测免疫胶体金层析法在检测AIVAIV时，可检时，可检测出的下限是测出的下限是5ng/ml5ng/ml，与双抗体夹心，与双抗体夹心ELISAELISA法无显著法无显著差异；对其它禽病不发生特异性反响和假阳性反

26、响；差异；对其它禽病不发生特异性反响和假阳性反响；具有快速、灵敏、稳定等特点，能够特异性地检测具有快速、灵敏、稳定等特点，能够特异性地检测AIVAIV，适合于基层现场检测。，适合于基层现场检测。全文总结全文总结 1 建立了用于筛选AIV McAb的间接ELISA方法。2 通过细胞融合，获得了2株能稳定分泌AIV McAb的杂交瘤细胞株，命名为5A6和5G7。3 纯化了AIV抗原，对羊进行长程免疫，获得了高效价羊抗AIV多克隆抗体。4 通过建立AIV免疫胶体金层析法，优化了免疫胶体金测试条的制作条件。5 初步建立了灵敏的AIV双抗夹心ELISA法，该方法具有灵敏度高，特异强，准确度高，重复性好等特点。6 与夹心ELISA进行比较，对AIV胶体金免疫层析法进行评定，该法最低检测下限为5ng/ml，初步建立了快速、简便、灵敏、特异的检测AIV的免疫胶体金层析法。该方法适合基层检测AIV使用。谢谢！谢谢！