免疫荧光技术(修改)课件.ppt

1、免疫标记技术 用可以微量检测的标记物用可以微量检测的标记物（示踪示踪物质）标记抗原或抗体物质）标记抗原或抗体,作为试剂，作为试剂，与相应抗体或抗原结合反应后，测定与相应抗体或抗原结合反应后，测定抗原抗体复合物中的标记物，从而推抗原抗体复合物中的标记物，从而推断所测抗体或抗原有无及量的多少。断所测抗体或抗原有无及量的多少。常常 用用 标标 记记 物物 荧光素 酶 同位素 胶体金 可发光化学物质试验命名:根据标记物命名 如：免疫荧光技术 免疫酶技术等免疫荧光技术免疫荧光技术（Immunological fluorescent technique,IF)原理:用荧光素标记抗原或抗体,与待测标本中相应

2、抗体或抗原结合，通过检测荧光，确定标本中有无待测的抗体或抗原。免疫荧光技术分类:免疫荧光显微技术（定性）免疫荧光测定技术（定量）一.荧光、荧光素及荧光显微镜（一）荧光 一种光照射某种物质时,该物质可发出比照射光波长更长的光称为荧光。照射光:可见光、紫外光(二）荧光素 能产生荧光的物质,可作为染料。常用荧光素常用荧光素:1.异硫氰酸荧光黄异硫氰酸荧光黄(FITC)可发出可发出黄绿色黄绿色荧光荧光2.四乙基罗丹明（四乙基罗丹明（RB200)发出发出橘红色橘红色荧光荧光3.藻红蛋白（藻红蛋白（PE）发出发出橙色橙色荧光荧光（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜 1.结构结构:主要组成主要组成 A.白炽光源

3、白炽光源（超高压汞灯）：发射紫外光或（超高压汞灯）：发射紫外光或兰兰 紫光紫光;B.两组滤光板两组滤光板:激发滤板（选择合适的激发光激发滤板（选择合适的激发光谱）；抑制滤板（抑制紫外光或兰紫光进入视谱）；抑制滤板（抑制紫外光或兰紫光进入视野野,只允许荧光通过。只允许荧光通过。C.显微镜显微镜：普通的光学显微镜：普通的光学显微镜。光路程序光路程序:白炽光源 发射紫外光or兰紫光 激发滤板 紫外光 被检物（荧光染色标本）紫外光荧光 抑制滤板荧光（显微镜下可见）目镜阻挡滤镜载玻片荧光显微镜光路示意图荧光显微镜光路示意图光源隔热滤片激发滤片聚光器物镜荧光显微镜光路示意图荧光显微镜光路示意图荧光显微镜据

4、光源路径分荧光显微镜据光源路径分 透射式（光源从下面经聚光器会聚后到达样品,适用于观察对光可透的标本）落射式（光源从上面到达样品，经标本反射进入物镜。适用于观察透明度不好的标本及各种活性组织等）2.使用注意事项:染色后立即检查（荧光易猝灭）准备好后开启白炽光源,不能随时启灭。打开后15分钟才能关闭每次使用2小时保持室内通风 荧光素可以标记（染色）抗原,也可以标记抗体 标记抗原 用得少 标记抗体 用得多 一般免疫荧光显微技术均标记抗体二二.免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术（一）荧光抗体的制备（二）片子的制作（三）荧光抗体染色方法（一）荧光抗体的制备:纯化的一定量抗体 加一定量FITC(搅拌使结合

5、）去除游离荧光素 测抗体效价、测荧光素与蛋白质（Ab）结合比（F/P）小量分装保存备用（二）片子的制作:1.常做切片、涂片、印片,要求薄、均匀，并与玻片充分固定。固定后不能被洗脱。2.注意保持抗原完整性3.不同材料固定方法不同（无水已醇、丙醇、聚甲醛等）（三）荧光抗体染色法 快、直接、干扰因素少快、直接、干扰因素少 用于检测抗原用于检测抗原 每检测一种抗原需标记相应的荧光抗每检测一种抗原需标记相应的荧光抗体体,较麻烦较麻烦洗涤洗涤,AgAb2.间接法 分两步:第一步：荧光素标记抗抗体（如荧光 标记的羊抗人IgG）;第二步：已知Ag固定待测标本（Ab？）洗涤,荧光标记的 抗抗体洗涤，荧光显微镜镜

6、检 间接法用得最多优点:制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用于多种于多种Ab检测检测灵敏度高灵敏度高3.补体法:第一步：荧光素标记抗补体;第二步：已知Ag固定待测标本（Ab？）补体洗涤,荧光标记的抗补体洗涤，荧光显微镜镜检特点:灵敏度高灵敏度高,制备一种荧光抗补体用于多制备一种荧光抗补体用于多 种检测种检测 干扰因素多，补体不稳定，干扰因素多，补体不稳定，易失活，易失活，该法该法少用少用4.双标记法 用两种荧光素（FITC、罗丹明）分别标记针对同一Ag上不同抗原表位的抗体,对同一标本染色，当Ag有两种相应抗原表位存在时，可同时见到黄绿和橙红两种荧光。（四）免疫荧

7、光显微技术优缺点优点:1.特异性、敏感性高 2.快速 3.可定位 4.既可测Ag又可测Ab缺点:1.需要荧光显微镜2.存在非特异荧光干扰（产生原因：自发、抗体不纯、交叉反应、技术问题）3.定性测定、判断结果不客观4.制备的片子难以长期保存（荧光猝灭）三.时间分辨荧光免疫测定（液相检测）原理原理:用用铕铕(Eu)(Eu)等具等具有较长荧光寿命有较长荧光寿命的稀土的稀土金属金属作荧光标记物作荧光标记物来标记来标记AbAb或或Ag Ag,从而检测待从而检测待测标本中相应测标本中相应AgAg或或AbAb的新技术。的新技术。其特点是其特点是：利：利用用时间分辨荧光仪时间分辨荧光仪延缓检测时间，延缓检测时

8、间，排除非特异性干扰荧光。排除非特异性干扰荧光。灵敏度可达灵敏度可达0.20.2 1 1 ng/ml ng/ml。思考题:1.免疫标记技术的原理2.免疫荧光技术中最常用的荧光素是什么？3.免疫荧光显微染色的各种方法及优缺点免疫酶技术免疫酶技术Immunoenzyme technique概述:70年代初在免疫荧光技术基础上建立。年代初在免疫荧光技术基础上建立。较较IF、RIA(radioimmunoassay)更优更优 越越 ,具有敏感、安全、稳定、易观察结果等优点具有敏感、安全、稳定、易观察结果等优点原理原理:利用利用酶酶标记标记Ag或或Ab后不改变后不改变Ag、Ab反应特异性反应特异性,同时

9、又不影响酶的活性，结同时又不影响酶的活性，结合在合在AgAb上的酶催化底物，生成有色产上的酶催化底物，生成有色产物，根据物，根据产物颜色深浅产物颜色深浅推测出待测物中相推测出待测物中相应物质（应物质（Ab、Ag)有无及含量多少。有无及含量多少。免疫酶技术具有 特异性 Ag、Ab反应 敏感性 酶的高效催化作用 酶免疫组织化学染色技术（免疫组化）酶免疫测定法（酶联免疫吸附实验,Enzyme-Linked immunosorbent assay,ELISA)常用的酶（一）选择酶的要求1.自然界存在广,易获得2.易纯化、性稳、活力高3.形成的酶结合物稳定，并保留酶、抗体或抗原的活性4.底物来源方便并易

10、保存5.反应后有色产物能快速测定6.酶分子量不能太大,太大不易进入组织细胞内，影响组化染色定位（二）常用的酶辣根过氧化物酶碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶等 辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP)一种铁卟啉蛋白质,分子量4.4万，能进入细胞内酶活性强，酶结合物可长期保存最适pH为5.5左右 选用时注意酶纯度和活性纯度:RZ表示,反映酶含量与蛋白含量之比，最好要RZ值为3.0左右活性：每1mg酶中所具有的活性单位，应大于250u/mg HRP的底物:邻苯二胺邻苯二胺(OPD),四甲基联苯胺（四甲基联苯胺（TMB）反应体系中作为供氢体反应体系中作为供氢体DH2+H2O2 D+

11、2H2O供氢体供氢体 受氢体受氢体 有色产物有色产物 HRPOPD特点特点:有色产物为黄色有色产物为黄色 空白对照接近无色空白对照接近无色 敏感度高敏感度高,有致癌作用有致癌作用TMB特点：特点：有色产物为蓝色有色产物为蓝色 无致癌作用无致癌作用底物系统（包括供氢体、受氢体）临用时配,配后避光保存酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked immunosorbent assay）ELISA 一.原理:将酶分子与Ab或Ag连接成一酶结合物（酶标记物）,当它与固相载体中相应Ag或Ab相遇，形成酶标记的AgAb复合物，加入底物，酶催化底物，生成有色产物，根据颜色深浅可测出溶液中Ag

12、或Ab的量。实验中所需酶标抗体的制备方法同荧光抗体制备:纯化后的抗体纯化后的抗体+酶酶 透析去除游透析去除游离酶离酶 测定酶标抗体工作浓度测定酶标抗体工作浓度试验中有关术语及试剂:包被包被(coat)：将将Ag或或Ab吸附在固相吸附在固相载体上的过程载体上的过程,又称固相化或吸附。包被后，又称固相化或吸附。包被后，不能被洗脱。包被缓冲液：不能被洗脱。包被缓冲液：PH9.6 CB 洗涤洗涤(wash)：PH7.2-7.4 PBS 酶结合物酶结合物：酶标抗体或酶标抗原酶标抗体或酶标抗原 终止液终止液：2M H2SO4OPD:HRP催化后其有色产物为黄色催化后其有色产物为黄色,H2SO4终止终止后变

13、为橙色（棕色）后变为橙色（棕色）。TMB：HRP催化后其有色产物为蓝色，催化后其有色产物为蓝色，H2SO4终终止后变为黄色止后变为黄色二.方法类型和操作步骤（一）双抗体夹心法双抗体夹心法步骤:包被已知Ab 洗涤 加待测标本（测Ag？）洗涤 加酶标Ab 洗涤 加底物 加终止液 观察结果洗涤三次洗涤三次终止液终止液 该法主要用于检测抗原该法主要用于检测抗原 包被的抗体与酶标抗体属同一种类包被的抗体与酶标抗体属同一种类抗体抗体 每检测一种抗原就需制备相应的酶每检测一种抗原就需制备相应的酶标抗体标抗体,较麻烦较麻烦（二）间接法测抗体（二）间接法测抗体 步骤步骤:包被已知包被已知Ag待测标本（测待测标本

14、（测Ab？）？）反应一段时间后反应一段时间后,洗涤洗涤加酶标加酶标抗抗体（酶标羊抗人抗抗体（酶标羊抗人IgG）洗涤洗涤加底物加底物加终止液加终止液，观察结果。，观察结果。该法主要用于测抗体该法主要用于测抗体 酶标记一种抗抗体可以用于多种抗酶标记一种抗抗体可以用于多种抗 体的检测体的检测包被抗体加标本（抗原）加抗体加酶标抗抗体间接法测抗原间接法测抗原（三）双位点一步法 步骤步骤:包被抗体包被抗体A待测标本待测标本 酶标抗体酶标抗体B 洗涤洗涤,底物底物终止液，观察结果终止液，观察结果（检测（检测Ag，Ag至少含至少含A、B两个抗原表位）两个抗原表位）该法是一次性加入标本和酶标抗体该法是一次性加入

15、标本和酶标抗体,试试 验验程序简单，提高了检测的特异性程序简单，提高了检测的特异性 用于检测用于检测Ag,且且Ag是具有至少是具有至少2种抗原表种抗原表 位的多价抗原位的多价抗原反应系统中固相反应系统中固相Ab与酶标与酶标Ab的量相对于的量相对于待测待测Ag是过量的，因此复合物的形成量是过量的，因此复合物的形成量与待测与待测Ag含量成正比（在方法可检测范含量成正比（在方法可检测范围内）围内）（四）竞 争 法步骤步骤:待测管：已知待测管：已知Ab包被待测标本包被待测标本（Ag？）？）洗涤洗涤,酶标酶标Ag洗涤，底物洗涤，底物显色显色先加先加（五）应用亲和素和生物 素的ELISA 亲和素亲和素(a

16、vidin):糖蛋白糖蛋白,一分子由一分子由四个亚基组成，每一亚基可以与一分四个亚基组成，每一亚基可以与一分子生物素结合子生物素结合 生物素生物素(biotin)：维生素：维生素H，可与蛋，可与蛋白质、糖类、酶类等结合，与亲和素白质、糖类、酶类等结合，与亲和素特异结合后极稳定特异结合后极稳定亲和素亲和素生物素生物素生物素生物素生物素生物素生物素生物素 亲和素亲和素 生物素在生物素在ELISA中使用中使用:三.ELISA结果的判定（一）肉眼判定（一）肉眼判定 与阳性、阴性对照颜色比较与阳性、阴性对照颜色比较:（二）（二）酶标光度仪检测酶标光度仪检测A492值值 （吸光率）（吸光率）:比色法比色法

17、1.与阳性、阴性对照测定值比较与阳性、阴性对照测定值比较2.P/N比值：大于比值：大于2.0为阳性为阳性,小于小于2.0 为阴性为阴性 P:positive（待测吸光度值）（待测吸光度值）N:negative四.ELISA试验的影响因素（一）固相载体一）固相载体 常用固相载体材料常用固相载体材料:聚苯乙烯。其特点为吸附聚苯乙烯。其特点为吸附Ag或或Ab的能力强的能力强,一但吸附后，不能被洗脱。一但吸附后，不能被洗脱。固相载体：酶标板固相载体：酶标板 可分软、硬板可分软、硬板 一次性使用，不可回收一次性使用，不可回收酶标板要求酶标板要求:吸附性能好、空白值低、透明度高吸附性能好、空白值低、透明度

18、高板批间、孔间性能相近板批间、孔间性能相近（二）抗原、抗体Ag:需纯化需纯化Ab：需效价高、亲和力强、纯化：需效价高、亲和力强、纯化（三）试验条件1.包被包被:一般用一般用pH 9.6 CB(carbonate buffer),0.05M,有利于蛋白质吸附有利于蛋白质吸附 包被浓度包被浓度:0.1100 g/ml,一般常用一般常用10 g/ml包被时间、温度包被时间、温度：4 过夜或过夜或37 1-3h包被量包被量：100ul封闭：用封闭：用0.15%牛血清白蛋白缓冲牛血清白蛋白缓冲液浸泡液浸泡 0.5小时小时2.抗原抗体反应的条件抗原抗体反应的条件（1）微碱性有利于抗原抗体结合）微碱性有利于

19、抗原抗体结合,故用故用pH 7.4 PBS(phosphate buffer saline)洗涤洗涤（2）去污剂有利于）去污剂有利于AgAb形成，洗液中加形成，洗液中加0.05%Tween-20（3）Ag、Ab反应时间、温度反应时间、温度:一般一般 37、3040min3.洗涤洗涤 采用采用 PH7.2-7.4PBS洗涤洗涤,规一化，每规一化，每次浸泡次浸泡12min，拍干，共洗涤，拍干，共洗涤34次次4.酶促反应条件酶促反应条件 温度温度 37 时间时间 10min pH 5.5 底物量底物量 一致一致5.排除干扰排除干扰:多设多设 对对 照照ELISA试验应设对照应设对照应设对照 操操 作

20、作 应得结果应得结果阳性对照阳性对照 同标本一样同标本一样 颜色深颜色深 阴性对照阴性对照 同标本一样同标本一样 颜色浅颜色浅or无色无色酶结合物对照酶结合物对照 加酶步加入加酶步加入 无色无色底物底物 对照对照 加底物步加入加底物步加入 无色无色空白对照空白对照 只加终止液只加终止液 无色无色 血清血清 100ul 酶标二抗酶标二抗100ul 底物底物100ul 终止液终止液100ul待测待测 待测待测标本标本 血清血清 +阳性阳性 阳性阳性对照对照 血清血清 +阴性阴性 阴性阴性对照对照 血清血清 +酶结合酶结合物对照物对照 PBS100ul +底物底物对照对照 PBS100ul PBS1

21、00ul +空白空白对照对照 PBS100ul PBS100ul PBS100ul +五.ELISA试验优缺点优点:1.既可测抗原又可测抗体既可测抗原又可测抗体2.微量、定性、定量微量、定性、定量3.特异性、敏感性高特异性、敏感性高4.操作简单操作简单,可不用特殊仪器可不用特殊仪器缺点:1.影响因素多影响因素多,多方把关多方把关2.偶有假阳性、假阴性偶有假阳性、假阴性六.膜载体的酶免疫测定（一）斑点-ELISA特点:1.固相载体为硝酸纤维素膜固相载体为硝酸纤维素膜2.酶促反应后在膜上形成有色沉淀物酶促反应后在膜上形成有色沉淀物固相Ag（二）免疫印迹法（二）免疫印迹法(immunoblottin

22、g test,IBT)七七.应应 用用(包括所有标记技术)(一一)病原体的诊断及研究病原体的诊断及研究1.病毒、细菌等传染病的诊断病毒、细菌等传染病的诊断 (测抗原或抗体测抗原或抗体)2.病毒、细菌表面抗原的研究病毒、细菌表面抗原的研究(二二)某些疾病的诊断某些疾病的诊断1.某些微量物质有关疾病的诊断某些微量物质有关疾病的诊断2.肿瘤的诊断及定位肿瘤的诊断及定位3.自身抗体检测协助自身免疫病诊断自身抗体检测协助自身免疫病诊断4.寄生虫疾病的诊断等寄生虫疾病的诊断等(三)免疫学方面的研究 T、B 细胞的发生、演化、细胞的发生、演化、表面表面 抗原改变等的研究抗原改变等的研究(四)微量物质的检测

23、体内体内:微量蛋白质、激素、酶微量蛋白质、激素、酶 等抗原等抗原;药物、糖等半抗原药物、糖等半抗原 工农业工农业:微生物、微量物质等微生物、微量物质等思考题:1.ELISA 的原理、方法（以间接法测抗体和双抗夹心法为例）及影响因素。2.ELISA试验应设哪些对照,为什么？3.判断ELISA试验结果的方法。发光免疫技术 发光免疫技术是将发光系统与免疫反应相结合,来检测抗原、或抗体的方法。化学发光免疫测定一一.化学发光酶免疫测定化学发光酶免疫测定（chemiluminescent enzyme munoassay,CLEIA)试验前部分与试验前部分与ELISA一样，改变所一样，改变所加底物，使产物

24、能发光，用仪器检测发加底物，使产物能发光，用仪器检测发光强度，判断结果。光强度，判断结果。如酶是用辣根过氧化物酶如酶是用辣根过氧化物酶,常用底物是鲁米诺或其衍生物。常用底物是鲁米诺或其衍生物。二二.化学发光标记免疫测定化学发光标记免疫测定（chemiluminescent munoassay,CLIA)是用是用化学发光剂作为标记物化学发光剂作为标记物直接直接标记抗原或抗体的免疫测定方法。标记抗原或抗体的免疫测定方法。金免疫技术金免疫技术 采用胶体金作为标记物采用胶体金作为标记物 胶体金胶体金又称金溶胶又称金溶胶,是金盐是金盐(氯金氯金酸）被还原（还原剂酸）被还原（还原剂:柠檬酸钠）成柠檬酸钠）

25、成原子金后形成的金颗粒悬液原子金后形成的金颗粒悬液胶体金的特性:1.胶体金性质：颗粒稳定均匀胶体金性质：颗粒稳定均匀,分散悬分散悬浮，浮，1100nm2.呈色性：颜色与颗粒大小有关呈色性：颜色与颗粒大小有关 25nm 橙黄色橙黄色 1020nm 酒红色酒红色 3080nm 紫红色紫红色一一.斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验（dot immunogold filtration assay,DIGFA)原理原理:采用胶体金标记抗体，以硝酸纤维素膜为采用胶体金标记抗体，以硝酸纤维素膜为载体，使抗原抗体反应和洗涤在同一渗滤膜上，载体，使抗原抗体反应和洗涤在同一渗滤膜上，反应后根据在膜中央形成的红色斑点（胶体金聚反应后根据在膜中央形成的红色斑点（胶体金聚集）有无来判断结果。集）有无来判断结果。技术类型：双抗体夹心法（测技术类型：双抗体夹心法（测Ag);间接法间接法(测测Ab)二二.斑点免疫层析试验斑点免疫层析试验（dot immunochromatographic assay,DICA)以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜毛细以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜毛细管作用，使膜一端的液体慢慢向另一端渗移，管作用，使膜一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析犹如层析思考题:1.发光免疫技术、金免疫技术的原理2.用金标记免疫法（斑点免疫层析试验）检测HCG的原理