1、3（1）反向）反向PCR技术技术(Inverse PCR,IPCR)：（2）锚定）锚定PCR技术技术(Anchored PCR,APCR)：（3）不对称）不对称PCR技术技术(asymmetric PCR)：（4）反转录）反转录PCR技术技术(reverse transcription PCR,RT-PCR)：（5）巢式）巢式PCR技术技术(NEST-PCR)：（6）多重）多重PCR技术技术(multiplex PCR)：（7）重组）重组PCR技术：技术：（8）原位）原位PCR技术：技术：（9）荧光定量实时）荧光定量实时PCR技术技术 技术技术 （1）反向）反向PCR技术技术(Inverse
2、PCR,IPCR)：反向反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一是克隆已知序列旁侧序列的一种方法。种方法。一种在已知序列中无 切点的限制性内切酶消化基因组DNA。酶切片段自身环化。以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）通过通过RT-PCR技术由已知部分技术由已知部分
3、cDNA序列来得到序列来得到完整的完整的cDNA5和和3端，包括单边端，包括单边PCR和锚定和锚定PCR。1.基于蛋白质保守性的兼并引物的设计及基于蛋白质保守性的兼并引物的设计及ORF保守区保守区RT-PCR克隆；克隆；2.3-RACE3.5-RACE1.基于蛋白质保守性的兼并引物的设计及基于蛋白质保守性的兼并引物的设计及ORF保守区保守区RT-PCR克隆；克隆；利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。对所找到的序列进行多序列对。确定合适的保守区域 设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50 400个aa为宜，使得pcr产物在1501200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。利用软件设计引物 RAG，YCT，MAC，KGT，SCG，W AT，H ACT，B CGT，ACG，DA/G/T,N=ACG/T密码子的兼并性密码子的兼并性氨基酸密码子数氨基酸密码子数、Ct值的确定 Sample25
