1、 浓度浓度50ul体系体系(ul）10 PCR Buffer5Mg2+1.5mmol/L4dNTPs200umol/L4引物引物110pmol2引物引物210pmol2模板模板0.12ug1Taq酶酶2.5u0.5ddH2O31.51234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍预变性预变性(94(94 C,3m)C,3m)变性变性(94(94 C,30s)C,30s)复性复性(50-7050-70 C,30s)C,30s)延伸延伸(72(7
2、2 C,C,30-6030-60s)s)总延伸总延伸(72(72 C,10m)C,10m)(25-35)(25-35)变性温度变性温度:94C or 95C,不变；不变；延伸温度：延伸温度：72C，不变；，不变；退火温度：退火温度：50C左右，可变，左右，可变，Tm值值-5延伸时间：延伸时间：30-60s，与，与PCR产物产物的大小有关，参考酶的延伸效率的大小有关，参考酶的延伸效率（通常（通常1000bp/min）加样顺序加样顺序50ul体系体系(ul）10 PCR Buffer5Mg2+34dNTPs44引物引物152引物引物262模板模板71Taq酶酶80.5ddH2O131.52混匀，瞬
3、时离心混匀，瞬时离心3-5secDNA聚聚合酶合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增一步法一步法两步法两步法cDNA PCR扩增扩增 cDNA第一链合成反应第一链合成反应 过程中过程中cDNA第一第一链合成反应所用的枪头、链合成反应所用的枪头、枪头盒、枪头盒、PCR管等塑料制管等塑料制品均提前用氯仿进行处理，品均提前用氯仿进行处理，高压灭菌后使用。玻璃制高压灭菌后使用。玻璃制品在品在180干烤干烤6-8小时。小时。加样过程在超净台内进行，加样过程在超净台内进行，需戴手套与口罩。需戴手套与口罩。cDNA PCR扩增的准备工作同普扩增的准备工作同普通通PCR反应。反应。琼脂糖凝胶浓度与线性琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围分辨范围
