下游技术色谱分离10课件.ppt

1、第一节第一节 概述概述色谱分离（色谱分离（Chromatographic ResolutionChromatographic Resolution，CRCR）利用利用多组分混合物多组分混合物中中各组分物理化学性质（如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子各组分物理化学性质（如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲合力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在亲合力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在固定相固定相和和流动相流动相中。当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性中。当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离。质的差

2、别，而以不同的速率移动，使之分离。分离效率高，每米柱长可达几千至几十万的塔板数；分离效率高，每米柱长可达几千至几十万的塔板数；应用范围广，从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分应用范围广，从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳定的化合物，子、无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳定的化合物，尤其是对生物大分子样品的分离，是其他方法无法代替的；尤其是对生物大分子样品的分离，是其他方法无法代替的；选择性强；选择性强；高灵敏度的在线检测，可采用不同的高灵敏度检测器进行连续的在高灵敏度的在线检测，可采用不同的高灵敏度检测器进行连续的

3、在线检测；线检测；快速分离；快速分离；过程自动化操作。过程自动化操作。优点优点1.按分离机理不同分类按分离机理不同分类第二节、色谱分离的分类第二节、色谱分离的分类n吸附色谱分离（吸附色谱分离（Adsorption ChromatographyAdsorption Chromatography，ACAC）n分配色谱（分配色谱（Distribution ChromatographyDistribution Chromatography，DCDC）n离子交换色谱（离子交换色谱（Ion Exchange ChromatographyIon Exchange Chromatography，IECIEC）

4、n凝胶色谱（凝胶色谱（Gel ChromatographyGel Chromatography，GCGC）n亲合色谱（亲合色谱（Affinity ChromatographyAffinity Chromatography，AFCAFC）吸附色谱分离吸附色谱分离是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。新的吸附色谱技术有新的吸附色谱技术有：疏水作用色谱（疏水作用色谱（Hydrophobic Interaction ChromatographyHyd

5、rophobic Interaction Chromatography，HICHIC）、）、金属螯合作用色谱（金属螯合作用色谱（Metal Chelation ChromatographyMetal Chelation Chromatography，MCCMCC）、）、共价作用色谱（共价作用色谱（Covalent Interaction ChromatographyCovalent Interaction Chromatography，CICCIC）等；）等；吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、氧化钛、氢氧吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、氧化钛、氢氧化锌凝胶等。化锌凝胶

6、等。无机吸附剂在有机大分子色层分离中的实用例子无机吸附剂在有机大分子色层分离中的实用例子丝裂霉素丝裂霉素的精制的精制。丝裂霉素的发酵滤液用活性炭吸附，丙酮洗脱，丝裂霉素的发酵滤液用活性炭吸附，丙酮洗脱，蒸去丙酮的浓缩水溶液，用氯仿萃取。蒸去丙酮的浓缩水溶液，用氯仿萃取。氯仿萃取液上氧化铝柱，先用氯仿冲洗，能部分分带，氯仿萃取液上氧化铝柱，先用氯仿冲洗，能部分分带，接着以氯仿丙酮（接着以氯仿丙酮（3:23:2）展开，约）展开，约2 2小时后，能分出色小时后，能分出色层，其中蓝层，其中蓝紫色色带为有效成分丝裂霉素紫色色带为有效成分丝裂霉素C C。将柱推出，切取蓝紫色部分，用将柱推出，切取蓝紫色部分

7、，用1010甲醇氯仿洗脱，甲醇氯仿洗脱，减压蒸干，减压蒸干，在甲醇苯中结晶，即可得蓝紫色丝裂霉在甲醇苯中结晶，即可得蓝紫色丝裂霉素素C C结晶。结晶。分配色谱分配色谱是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。而分离。正相色谱正相色谱（Normal Phase ChromatographyNormal Phase Chromatography，NPCNPC）的固定相为极性，）的固定相为极性，流动相为非极性，当混合物随流动相通过固定相时，极性较强的化合物流动相为非极性，当混合物随流动相通过固定相时，极性较强的化合物被保留，极性较弱的化合物先被洗

8、脱下来。被保留，极性较弱的化合物先被洗脱下来。反相色谱反相色谱（Reversed Phase ChromatographyReversed Phase Chromatography，RPCRPC），固定相为非极），固定相为非极性，流动相为极性，用于分离非极性或弱极性物质。性，流动相为极性，用于分离非极性或弱极性物质。离子交换色谱离子交换色谱是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的亲合力而将它们分离。不同溶质对交换剂具有不同的亲合力

9、而将它们分离。该法适合于离子和在溶剂中可发生电离的物质的分离。该法适合于离子和在溶剂中可发生电离的物质的分离。碱性水溶性抗生素的分离和分析也常用离子交换色层分离法。碱性水溶性抗生素的分离和分析也常用离子交换色层分离法。例例卡那霉素卡那霉素A,B,CA,B,C可以用强碱性树脂可以用强碱性树脂Dowex1Dowex12 2（OHOH型），以水型），以水作展开剂，进行离子交换色层分离法分离。作展开剂，进行离子交换色层分离法分离。在在0.90.939cm39cm的色层分离柱中（树脂用量的色层分离柱中（树脂用量252550 mL50 mL，粒度，粒度200200400400目），流速控制在目），流速控制

10、在202030 mL/h30 mL/h，卡那霉素，卡那霉素B B最先流最先流出，接着卡那霉素出，接着卡那霉素C C，最后卡那霉素，最后卡那霉素A A自柱中流出。自柱中流出。凝胶色谱凝胶色谱以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，又称为分子筛色谱（而进行分离的色谱技术，又称为分子筛色谱（Molecular Molecular Sieve ChromatographySieve Chromatography，MSCMSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（谱（Size Exclusion Chromato

11、graphySize Exclusion Chromatography，SECSEC）。）。凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。当混合物随流动凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。当混合物随流动相流经凝胶柱时，较大的分子不能进入所有的凝胶网孔而受相流经凝胶柱时，较大的分子不能进入所有的凝胶网孔而受到排阻，它们将与流动相一起首先流出，较小的分子能进入到排阻，它们将与流动相一起首先流出，较小的分子能进入部分凝胶网孔，流出的速度较慢，更小的分子能进入全部凝部分凝胶网孔，流出的速度较慢，更小的

12、分子能进入全部凝胶网孔，而最后从凝胶柱中流出。胶网孔，而最后从凝胶柱中流出。凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。应用举例应用举例（1）去热原去热原（2 2）纯化青霉素）纯化青霉素（3 3）大分子物质的分子量测定）大分子物质的分子量测定将离子交换树脂制备的无盐水通过羟型将离子交换树脂制备的无盐水通过羟型DEAE-A-25DEAE-A-25凝胶，可制得无热原水，用于注射。凝胶，可制得无热原水，用于注射。用葡聚糖凝胶用葡聚糖凝胶G-25G-25（粒度为（粒度为20208080mm）分离青）分离青霉素中的一些高分子杂质（青霉素聚合物、青霉霉素中的

13、一些高分子杂质（青霉素聚合物、青霉噻唑蛋白），去除这些强烈致敏性的全抗原。噻唑蛋白），去除这些强烈致敏性的全抗原。生物体中许多大分子化合物具有与其结构相对应的专生物体中许多大分子化合物具有与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性，如酶蛋白与辅酶、抗原和抗一分子可逆结合的特性，如酶蛋白与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体、核糖核酸与其互补的脱氧核糖核体、激素与其受体、核糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系，把与目的产物具有特异亲合力的生物分子酸等体系，把与目的产物具有特异亲合力的生物分子固定化后作为固定相，当含有目的产物的混合物（流固定化后作为固定相，当含有目的产物的混合物（流动相）流经此固定相时，即可

14、把目的产物从混合物中动相）流经此固定相时，即可把目的产物从混合物中分离出来。分离出来。亲合色谱亲合色谱对于生物大分子化合物的分离纯化具有特别重要的意义。对于生物大分子化合物的分离纯化具有特别重要的意义。生物亲和关系生物亲和关系u柱色谱柱色谱，具有进样量大，回收容易等优点，但其分辨率不如具有进样量大，回收容易等优点，但其分辨率不如纸上色谱和薄层色谱高；纸上色谱和薄层色谱高；u纸上色谱纸上色谱，以滤纸为载体，是以滤纸纤维及其结合水作为固以滤纸为载体，是以滤纸纤维及其结合水作为固定相，以有机溶剂作为流动相的分配色谱分离。纸上色谱分定相，以有机溶剂作为流动相的分配色谱分离。纸上色谱分离具有设备简单、操

15、作方便、分离效率高、所需样品量少等离具有设备简单、操作方便、分离效率高、所需样品量少等优点，但分离量少、回收困难，分离速度慢等；优点，但分离量少、回收困难，分离速度慢等；u薄层色谱分离薄层色谱分离 ，将固定相在玻璃平板上铺成薄层而进行分将固定相在玻璃平板上铺成薄层而进行分离的一种分离技术。薄层色谱是柱色谱和纸上色谱两者的结离的一种分离技术。薄层色谱是柱色谱和纸上色谱两者的结合。合。2.按固定相形状不同分类按固定相形状不同分类对于蛋白质、酶、核酸等生物大分子，由于它们分子量大、对于蛋白质、酶、核酸等生物大分子，由于它们分子量大、易失活以及具有生物专一和亲合性等特点，选用多糖基质（如易失活以及具有

16、生物专一和亲合性等特点，选用多糖基质（如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等）离子交换色谱、疏水作用色谱、纤维素、葡聚糖、琼脂糖等）离子交换色谱、疏水作用色谱、凝胶色谱和亲合色谱等；凝胶色谱和亲合色谱等；对于生物小分子的代谢物，由于它们分子量小、结构和性质对于生物小分子的代谢物，由于它们分子量小、结构和性质比较稳定、操作条件不太苛刻，采用吸附、分配和离子交换色比较稳定、操作条件不太苛刻，采用吸附、分配和离子交换色谱进行分离较为适宜。谱进行分离较为适宜。二、色谱分离方法的选择二、色谱分离方法的选择氨基酸、有机酸、核苷酸等一些离子型化合物的生产氨基酸、有机酸、核苷酸等一些离子型化合物的生产多用离子交换色谱分离；多用离子交换色谱分离；抗生素、生物碱、萜类、色素等次级代谢产物多采用抗生素、生物碱、萜类、色素等次级代谢产物多采用吸附色谱或反相分配色谱分离。吸附色谱或反相分配色谱分离。迁移距离流动相在色谱系统中的溶质的迁移距离fRsdmmfAKAAR比移值测量比移值测量 上行法：将滤纸上端挂起，下端浸入展开剂展开。下行法：将滤纸上端折纹浸入展开剂中，向下方展开。辐射法：展开剂由圆形滤纸中央向四周展开。双向展开法：先后用两种不同的展开剂在垂直方向展开。