生物技术之层析技术课件.ppt

1、引 言1850年德国科学家朗格首先发现了色谱分离的现象，当他把一种有颜色的物质滴到一张滤纸上，观察到它们扩散成一圈一圈的圆环。层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家茨维特（Michael Tswett）发现并命名的。他将碳酸钙细粉装入玻璃管内使其成柱形，然后把石油醚抽提的植物叶子的色素溶液倾入，让其通过碳酸钙柱，接着用石油醚洗涤，于是奇迹出现了，在吸附柱的不同部位出现了绿色的叶绿素，黄色的叶黄素和胡萝卜素，混合物的不同色素组分得到了分离。当时茨维特把这种色带叫作“色谱”，茨维特把他开创的方法叫色谱法（Chromatography)。4 层析技术（层析技术（chromatographychr

2、omatography）又称）又称色谱技术色谱技术、层离技层离技术术等，是一组相关技术的总称。等，是一组相关技术的总称。层析技术是利用混合物中各组分的层析技术是利用混合物中各组分的物理化学性质物理化学性质(分分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数配系数等等)的不同，使各组分以不同程度分布在的不同，使各组分以不同程度分布在固定相固定相和和流动相流动相中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的技术。度移动，而达到分离的技术。5 层析技术具有分离精度高、设备简单、操作方层析

3、技术具有分离精度高、设备简单、操作方便等优点，样品可多可少，既可用于实验室的便等优点，样品可多可少，既可用于实验室的研究工作，又可用于工业生产，研究工作，又可用于工业生产，还可与其他还可与其他分析仪器配合，组成各种自动分析仪器。分析仪器配合，组成各种自动分析仪器。层析技术是当前获得高纯度产物最有效的分离层析技术是当前获得高纯度产物最有效的分离纯化技术。纯化技术。6主要内容主要内容第一节第一节 概述概述第二节第二节 凝胶层析技术凝胶层析技术第三节第三节 离子交换层析技术离子交换层析技术第四第四节节 吸附层析技术吸附层析技术第五节第五节 亲和层析技术亲和层析技术7第一节第一节 概述概述一、基本概念

4、一、基本概念层析系统：层析系统：任何层析过程都是在两个相中进行的，一个是固任何层析过程都是在两个相中进行的，一个是固定于支持物上的定于支持物上的固定相固定相，另一个是流经固定相的，另一个是流经固定相的流动相流动相，层析系统就是由固定相和流动相组成的。，层析系统就是由固定相和流动相组成的。当流动相流过加有样品的固定相时，由于样品中当流动相流过加有样品的固定相时，由于样品中各组分的理化性质的差异，各组分的理化性质的差异，受固定相的阻力与流受固定相的阻力与流动相的推力的影响不同动相的推力的影响不同，因而各组分在固定相与，因而各组分在固定相与流动相之间的分布（含量对比）不同，从而使各流动相之间的分布（

5、含量对比）不同，从而使各组分以不同的速率移动，达到分离物质的目的。组分以不同的速率移动，达到分离物质的目的。8第一节第一节 概述概述配合相应的光学、电学和电化学检测手段，可用于定性、定配合相应的光学、电学和电化学检测手段，可用于定性、定量和纯化某种物质，其纯度高达量和纯化某种物质，其纯度高达99%99%。固定相固定相 固定相是由层析介质组成。它可以是固体物质（如吸附固定相是由层析介质组成。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），但这个液体必须附载在某个固体纤维素或硅胶上的溶液），但这

6、个液体必须附载在某个固体物质上，该物质称为载体或担体（物质上，该物质称为载体或担体（supportsupport）。这些基质能与）。这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。层析的效果起着关键的作用。9基本概念基本概念流动相流动相 在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。洗脱剂，薄层层析时称为

7、展层剂。它也是层析分离中的重要影响它也是层析分离中的重要影响因素之一。因素之一。固定相与流动相，两相互不相溶固定相与流动相，两相互不相溶10 层析法是基于被分离物质的层析法是基于被分离物质的物理物理、化学化学及及生物学特性生物学特性的不同，使混合物中各组分以不同程度分布在固定相和流的不同，使混合物中各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，并使各组分以不同速率移动，从而达到分离的目动相中，并使各组分以不同速率移动，从而达到分离的目的。的。二、基本原理二、基本原理11柱层析系统的基本组成柱层析系统的基本组成F层析柱层析柱+层析剂层析剂F上样洗脱系统上样洗脱系统F检测系统检测系统F收集系统收集系统三

8、通阀三通阀收集器收集器检测器检测器泵泵泵泵流动相流动相料液料液DCBA层析柱层析柱（a）层析系统基本组成）层析系统基本组成12时间（或流出体体积）时间（或流出体体积）流出组分浓度流出组分浓度A B C D层析剂选择和预处理层析剂选择和预处理装柱装柱平衡平衡上样上样洗脱洗脱检测检测收集收集层析剂再生和保存层析剂再生和保存柱层析的基本操作柱层析的基本操作（b）分离出组分峰图）分离出组分峰图(1)分辨力高(2)分析效率高(3)灵敏度高(4)操作简便，应用广泛局限性：在定量分析中需要纯制得标准物质；不能精确地解决物质的化学结构问题三、层析法的特点三、层析法的特点气气-固固(GSC)气气-液液(GLC)

9、液液-固固(LSC)液液-液液(LLC)1.1.按流动相的形式不同按流动相的形式不同气气相相层层析析G GC C液液相相层层析析LCLC以气体作为流动相以气体作为流动相以液体作为流动相以液体作为流动相四、层析技术分类四、层析技术分类2.2.按层析的原理可分为按层析的原理可分为吸附层析分配层析凝胶层析亲和层析离子交换层析 层析技术分类层析技术分类3.3.按操作形式不同按操作形式不同柱层析平面层析：包括纸层析、薄层层析、薄膜层析等 层析技术分类层析技术分类是将固定相装在柱内，使样品沿一是将固定相装在柱内，使样品沿一个方向移动，以达到分离目的。个方向移动，以达到分离目的。是用滤纸作为液体的载体，点样

10、后，是用滤纸作为液体的载体，点样后，用流动相展开，使组分达到分离。用流动相展开，使组分达到分离。是将适当粒度的固定相均匀涂铺在是将适当粒度的固定相均匀涂铺在薄板上。点样后，用流动相展开，薄板上。点样后，用流动相展开，使组分达到分离。使组分达到分离。是将适当的高分子有机吸附剂制成是将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析的方法进行物薄膜，以类似纸层析的方法进行物质的分离。质的分离。17第二节第二节 常用的层析方法常用的层析方法凝胶层析凝胶层析离子交换层析离子交换层析亲和层析亲和层析吸附层析吸附层析分配分配层析层析（一）凝胶层析（一）凝胶层析又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤法等又称为

11、凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤法等 。是指混合物随流动相流经装有凝胶作固定相的层析是指混合物随流动相流经装有凝胶作固定相的层析柱时，混合物中各种物质因柱时，混合物中各种物质因分子大小不同分子大小不同而被分离纯化而被分离纯化的技术。的技术。凝胶层析柱中装填着许多直径小于1mm的凝胶颗粒，颗粒内部不是实心的，而是三维多孔网状结构。1 1.凝胶层析的原理凝胶层析的原理固定相（凝胶）固定相（凝胶）三维空间网状结构三维空间网状结构凝胶层凝胶层析法析法固固定定相相流流动动相相小分子小分子被延滯被延滯小分子小分子大分子大分子较较快流出快流出分子筛效应分子筛效应：分子大小不同分子大小不同,在凝胶受到的在凝

12、胶受到的阻滞作用有差阻滞作用有差异异,从而造成各从而造成各组分在凝胶柱组分在凝胶柱中的迁移速度中的迁移速度不同得到分离。不同得到分离。在洗脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物质因其直径大于凝胶网孔的孔径，不能进入凝胶颗粒内部，只能沿着凝胶颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而移动速度快，先流出层析柱；小分子组分由于其分子直径小于网状结构的孔径，可进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速度慢，比大分子物质后流出层析柱，分子大小不同的混合物因此得到分离。1 1.凝胶层析的原理凝胶层析的原理凝胶层析凝胶层析不同大小的分子流过多孔凝胶不同大小的分子流过多孔凝胶分子大的组分先流分子大的组分先流出，分子小的组分后流出

13、出，分子小的组分后流出各组分便按分子从大到各组分便按分子从大到小的顺序依次流出小的顺序依次流出2.2.凝胶层析的介质凝胶层析的介质凝胶是一种多孔网状结构物质。层析用的凝胶一般都呈球形，颗粒的大小通常以目数来表示。层析的分辨率和流速与凝胶颗粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢。一般常用的是100200目。目前常用的有交联葡聚糖凝胶，交联琼脂糖凝胶，丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶以及Superdex。27 p是最传统的凝胶介质。是最传统的凝胶介质。p由天然高分子葡聚糖与其它交联剂由天然高分子葡聚糖与其它交联剂(3-(3-氯氯-1,2-1,2环氧丙烷环氧丙烷)

14、交联而成的凝胶。国外商品名为交联而成的凝胶。国外商品名为SephadexSephadex。p主要由主要由Pharmacia BiotechPharmacia Biotech生产。常见的有三类：生产。常见的有三类：Sephadex Sephadex G G系列系列、Sephacryl Sephacryl S S 系列系列和和Sephadex Sephadex LHLH系列系列。（1 1）葡聚糖凝胶：）葡聚糖凝胶：结构：基本骨架：葡聚糖（dextran）交联剂：3-氯代-1,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构。葡聚糖凝胶：葡聚糖凝胶：p凝胶型号与交联度、吸水量的关系：

15、凝胶型号与交联度、吸水量的关系：交联度：如交联度：如Sephadex G25,G50,G100,Sephadex G25,G50,G100,数字越小，交联度越大，凝数字越小，交联度越大，凝胶网状结构越紧密。胶网状结构越紧密。吸水量与数字关系：如吸水量与数字关系：如G25G25，表示吸水量为，表示吸水量为1g1g干胶吸水干胶吸水2.5g.2.5g.29（2 2）琼脂糖凝胶）琼脂糖凝胶p交联琼脂糖凝胶是由琼脂糖与交联琼脂糖凝胶是由琼脂糖与1,3-1,3-二溴异丙醇交联二溴异丙醇交联而成的多孔网状结构。商品名为而成的多孔网状结构。商品名为SepharoseCLSepharoseCL。p此类产品通常有

16、此类产品通常有Sepharose2B Sepharose2B、Sepharose4BSepharose4B、Sepharose6BSepharose6B三种，分别代表含琼脂糖凝胶三种，分别代表含琼脂糖凝胶2%2%、4%4%、6%6%的凝胶。的凝胶。p该凝胶具有良好的机械性能，分辨率高，分离范围该凝胶具有良好的机械性能，分辨率高，分离范围广，广泛用于蛋白质的分离纯化和亲和层析的载体。广，广泛用于蛋白质的分离纯化和亲和层析的载体。30（3 3）聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶p 丙烯酰胺与丙烯酰胺与N,N-N,N-亚甲基双丙烯酰胺交联而成。商品名亚甲基双丙烯酰胺交联而成。商品名为为Bio-GelBio

17、-Gel。改变亚甲基双丙烯酰胺的浓度，就可以得。改变亚甲基双丙烯酰胺的浓度，就可以得到不同交联度的产物。到不同交联度的产物。p 聚聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于SephadexSephadex。p pHpH为为211211之间比较稳定，能耐受强去垢剂与变性剂的影之间比较稳定，能耐受强去垢剂与变性剂的影响响L;L;非常亲水，基本不带电荷，吸附效应较小非常亲水，基本不带电荷，吸附效应较小,流速快，流速快，分辨率高。分辨率高。p 不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。p 丙烯酰胺

18、凝胶商品型号有丙烯酰胺凝胶商品型号有Bio-gelP-2Bio-gelP-2到到Bio-gelP-300Bio-gelP-300等等1010种，其阿拉伯数字表示排阻极限。种，其阿拉伯数字表示排阻极限。由由丙烯酰基葡聚糖丙烯酰基葡聚糖与与甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺共聚生成的刚性共聚生成的刚性凝胶，化学性质稳定，有良好的机械性能，可高温消凝胶，化学性质稳定，有良好的机械性能，可高温消毒，分辨率高，毒，分辨率高，广泛用于蛋白质的分离与提纯广泛用于蛋白质的分离与提纯。（4 4）SephacrylSephacryl凝胶：凝胶：一种由一种由PhamaricaPhamarica公司生产的新型凝胶过滤介质，

19、有高公司生产的新型凝胶过滤介质，有高交联度多孔交联度多孔琼脂糖琼脂糖与与葡聚糖葡聚糖共价结合而成，共价结合而成，是目前分是目前分辨率和选择性最高的凝胶过滤介质辨率和选择性最高的凝胶过滤介质。其物理化学性质。其物理化学性质稳定，能耐受强去垢剂与变性剂的影响，可高温消毒稳定，能耐受强去垢剂与变性剂的影响，可高温消毒，流速快，分辨率高。现有，流速快，分辨率高。现有Superdex30Superdex30 Superdex75 Superdex75 Superdex200Superdex200三种型号。三种型号。（5 5）SuperdexSuperdex：(1)(1)生物大分子的纯化生物大分子的纯化(

20、2)(2)分子量测定分子量测定 (3)(3)脱盐及去除小分子杂质脱盐及去除小分子杂质 3.3.凝胶层析的应用凝胶层析的应用凝胶层析的优点凝胶层析的优点 (1)(1)凝胶是一种不带电荷的惰凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定。性载体，结构稳定。(2)(2)操作条件较温和。操作条件较温和。(3)(3)样品得率高，重复性好，样品得率高，重复性好，可进行大量样品的分离纯可进行大量样品的分离纯化。化。凝胶层析的缺点凝胶层析的缺点(1)(1)要求样品和洗脱液的粘度很要求样品和洗脱液的粘度很低。低。(2)(2)凝胶颗粒网络孔径大小非常凝胶颗粒网络孔径大小非常有限有限,所以可被纯化的物质的所以可被纯化的物质

21、的分子量范围受到限制。分子量范围受到限制。(3)(3)凝胶结构对某些溶质分子具凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用。有吸附作用。4.4.凝胶层析的特点凝胶层析的特点（二）（二）离子交换层析离子交换层析 离子交换层析是在以离子交换层析是在以离子交换剂离子交换剂为固定相。利用其对为固定相。利用其对需要分离的需要分离的各种离子结合力的差异各种离子结合力的差异而将混合物中的不同离而将混合物中的不同离子进行分离的层析技术。子进行分离的层析技术。此法广泛应用于很多生化物质此法广泛应用于很多生化物质(例如氨基酸、多肽、例如氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核苷和有机酸等蛋白质、糖类、核苷和有机酸等)的分析、制备、纯

22、化，的分析、制备、纯化，以及溶液的中和、脱色等方面。以及溶液的中和、脱色等方面。离子交换层析是用离子交换层析是用离子交换剂离子交换剂（具有离子交换性能（具有离子交换性能的物质）的物质）作固定相作固定相，利用它与流动相中的某种离子进行，利用它与流动相中的某种离子进行可逆的交换可逆的交换性质来分离性质来分离离子型混合物离子型混合物的层析方法。的层析方法。依据各种依据各种离子或离子化合物离子或离子化合物与与离子交换离子交换剂剂的结合力不同而进行分离纯化。的结合力不同而进行分离纯化。1 1.离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理离子交换剂离子交换剂不溶

23、于水的带有电荷基团的惰性高分子不溶于水的带有电荷基团的惰性高分子聚合物。聚合物。包括包括基质基质、电荷基团电荷基团(或功能基团或功能基团)和和反离子反离子三三部分。部分。离子交换剂的基质是一类具有特殊网状立体结构的聚合离子交换剂的基质是一类具有特殊网状立体结构的聚合物颗粒，其物理化学性质稳定，不溶于水和许多有机溶物颗粒，其物理化学性质稳定，不溶于水和许多有机溶剂。剂。基质上交联有较多的酸性或碱性基团基质上交联有较多的酸性或碱性基团，这些酸性或，这些酸性或碱性基团通过静电作用可结合带碱性基团通过静电作用可结合带相反电荷的离子相反电荷的离子（反离（反离子）。当流动相中存在带电荷的离子时，就可与先结

24、合子）。当流动相中存在带电荷的离子时，就可与先结合在离子交换剂上的反离子进行可逆的交换。在离子交换剂上的反离子进行可逆的交换。纤维素纤维素 O O CH CH2 2 COOCOO-NaNa+纤维素阳离子交换剂组成示意图纤维素阳离子交换剂组成示意图p根据可交换离子的性质，离子交换剂分为根据可交换离子的性质，离子交换剂分为阳离子交换剂阳离子交换剂和和阴离子交换剂。阴离子交换剂。阳离子交换剂：交联酸性基团，能和流动相中的阳离子交换。例如：阳离子交换剂：交联酸性基团，能和流动相中的阳离子交换。例如：R-SOR-SO3 3-H H+Na+Na+R-SOR-SO3 3-NaNa+H+H+胶胶体体胶胶体体p

25、阴离子交换剂：交联碱性基团，能和流动相中的阴离子阴离子交换剂：交联碱性基团，能和流动相中的阴离子交换。例如：交换。例如：R-N+(CHR-N+(CH3 3)3 3OHOH-+Cl+Cl-R-N+(CHR-N+(CH3 3)3 3ClCl-+OH+OH-离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理n离子交换层析的基本原理示意图离子交换层析的基本原理示意图+流动相中，流动相中，不同离子化合物带电荷数量不同不同离子化合物带电荷数量不同，与与离子交换剂相互作用的强弱也不同离子交换剂相互作用的强弱也不同。因此，因此，可以通过提高流动相中的离子强度或改变可以通过提高流动相中的离子强度或改变pH值得方法，将

26、结合在离子交换剂上的反离子值得方法，将结合在离子交换剂上的反离子从离子交换柱上依次洗脱下来，达到分离纯化的从离子交换柱上依次洗脱下来，达到分离纯化的目的。目的。离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来；带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来；带带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。两性离子如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子交换剂的两性离子如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的物理化学性质和在特定结合力，主要取决于它们的物理化学性质和在特定pH条件下呈现的条件下呈现的离子状态。当离子状态。当

27、pH低于等电点低于等电点(pI)时，它们带正电荷能与阳离子交换剂时，它们带正电荷能与阳离子交换剂结合；反之，结合；反之，pH高于高于pI时，它们带负电荷能与阴离子交换剂结合时，它们带负电荷能与阴离子交换剂结合。pH与与pI的差值越大，带电量越大，与交换剂的结合力越强。的差值越大，带电量越大，与交换剂的结合力越强。离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机离子或生物离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机离子或生物大分子物质分开，其主要依据是离子交换剂对各种离子或离子化合物大分子物质分开，其主要依据是离子交换剂对各种离子或离子化合物有不同的结合力。有不同的结合力。离子交换层析的基本原理

28、离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理2.2.离子交换剂离子交换剂通过化学方法将酸性或碱性基团交联在惰性基质上可获得离子交换通过化学方法将酸性或碱性基团交联在惰性基质上可获得离子交换剂。剂。常用的基质有纤维素，葡聚糖凝胶，交联琼脂糖凝胶，聚丙烯常用的基质有纤维素，葡聚糖凝胶，交联琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶等。根据交换基团酸碱性的强弱，阳离子交换剂又分为强酰胺凝胶等。根据交换基团酸碱性的强弱，阳离子交换剂又分为强酸型和弱酸型，阴离子交换剂又分为强碱型和弱碱型。酸型和弱酸型，阴离子交换剂又分为强碱型和弱碱型。在实际工作中，可根据被分离的物质的性质，选用适当类型的离子在实

29、际工作中，可根据被分离的物质的性质，选用适当类型的离子交换剂。分离碱性蛋白质常用阳离子交换剂，分离酸性蛋白质常用交换剂。分离碱性蛋白质常用阳离子交换剂，分离酸性蛋白质常用阴离子交换剂。分离蛋白质样品时一般常用弱型交换剂。阴离子交换剂。分离蛋白质样品时一般常用弱型交换剂。离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。强酸性强酸性(阳性阳性)离子交换剂对离子交换剂对H的结合力比对的结合力比对Na的小；的小；强碱性强碱性(阴性阴性)离子交换剂对离子交换剂对OH的结合力

30、比对的结合力比对Cl的小得的小得多多；弱酸性离子交换剂对弱酸性离子交换剂对H的结合力远比对的结合力远比对Na的大；的大；弱碱性离子交换剂对弱碱性离子交换剂对OH的结合力比对的结合力比对Cl的大。的大。离子交换剂离子交换剂低低盐盐高高盐盐分离结分离结束束3.3.洗脱洗脱在离子交换层析中一般常用在离子交换层析中一般常用梯度洗脱梯度洗脱，通常有，通常有改变离子改变离子强度强度和和改变改变pHpH两种方式。两种方式。改变离子强度改变离子强度洗脱过程中逐步增大离子强度，洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来。从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来。改变改变pHpH的洗

31、脱的洗脱对于阳离子交换剂一般是对于阳离子交换剂一般是pHpH从低从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是到高洗脱，阴离子交换剂一般是pHpH从高到低。从高到低。由于由于pHpH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用通常采用改变离子强度改变离子强度的梯度洗脱。的梯度洗脱。增强洗脱液与离子交换剂的结合力增强洗脱液与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力4.4.离子交换层析的特点离子交换层析的特点样品处理量大，分离过程具有浓缩作用；分辨样品处理量大，分离过程具有浓缩作用；分辨效率较高，所需柱长较短，可在较高流速下操效率较高

32、，所需柱长较短，可在较高流速下操作；吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产作；吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收收率高。品回收收率高。离子交换层析既可用于生物大分子物质的分离离子交换层析既可用于生物大分子物质的分离纯化，又可用于小分子物质的分离纯化，还可纯化，又可用于小分子物质的分离纯化，还可以用于硬水软化以及污水处理等方面。以用于硬水软化以及污水处理等方面。5.5.离子交换层析的实验室应用离子交换层析的实验室应用除去离子（纯净水）聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面 分离纯化多肽蛋白、氨基酸、核

33、酸及其他带电的生物分子改变成分（青霉素-Na青霉素-K）浓缩与提取（抗生素、蛋白质、工业废液中微量金属的提取）离子型化合物分离发展：自动化方向与光谱技术结合专门用途的综合性自动分析仪与计算机相连进行自动分析与自动控制四、应用四、应用分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的生物分子带电的生物分子53（三）吸附层析（三）吸附层析（adsorption chromatographyadsorption chromatography）吸附作用是指某些物质能够从溶液中将溶质浓集在其表面的现象。吸附剂吸附能力的强弱与被吸附物质的化学结构、溶剂的本质有关。在不同条件下，吸附剂与

34、被吸附物之间的吸附力不同。当改变吸附剂周围溶剂成分时，吸附剂对被吸附物质的亲和力便发生变化，使被吸附物质从吸附剂上解脱下来，这一解脱过程称为“洗脱”或“展层”。1.吸附层析概念吸附层析概念541.吸附层析概念吸附层析概念指混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质的吸附力不同，从而使混合物分离的方法。吸附层析就是以吸附剂为固定相，根据待分离组分与吸附剂之间的物理或化学吸附力差别而达到分离目的的层析技术。优点：容易保持组分活性，操作简单 缺点：吸附容量小，选择性差，无机吸附剂性能不稳定55物理作用的范德华吸附：无选择性，吸附速度快，吸附的过程是可逆的。化学吸附：由原子价力的作用引起。有选择

35、性，吸附速度较慢，不易解吸。吸附层析概念吸附层析概念562.吸附层析基本原理吸附层析基本原理 由于吸附剂的吸附能力可受溶剂影响而发生改变，样品中物质被吸附剂吸附后，用适当的洗脱液冲洗，改变吸附剂的吸附能力，使之解吸，随洗脱液向下移动。当解吸下来的物质向下移动时，又遇到前面新的吸附剂又重新被吸附。此被吸附的物质再被后来的洗脱液洗脱下来而使其下移动。经如此反复的吸附解吸再吸附再解吸的过程，物质可沿着洗脱液的前进方向移动，经过一段时间以后，该物质会向下移动一定距离。吸附层析基本原理吸附层析基本原理此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及溶剂对该物质的解吸(溶解)能力有关。不同的物质由于吸附力和解吸力

36、不同，移动速度也不同。吸附力弱而解吸力强的物质，移动速度就较快。所以在洗脱过程中各组分便会由于移动速率不同而逐渐分离出来，这就是吸附层析的基本过程。吸附层析基本原理吸附层析基本原理根据操作方式不同3.吸附层析分类吸附层析分类柱层析（column chromatography）薄层层析（thin layer chromatography）吸附层析薄层层析(Thin layer chromatography)薄层层析是以涂布于玻璃板或塑料膜等载体上的基质为固定相，使之形成均匀的薄层，以液体为流动相的一种层析方法。层析板层析板展开剂展开剂薄层色谱薄层色谱薄层层析(Thin layer chromat

37、ography)其方法是把吸附剂均一地铺在一块玻璃板或塑料膜上形成薄层，待分离的样品点在薄层一端，在密闭容器中用适宜的溶剂（展开剂）展开，由于吸附剂对不同物质吸附力大小不同，因此当溶剂流过时，不同物质在吸附剂和溶剂之间发生连续不断地吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，易被吸附的物质相对移动的较慢，较难吸附的物质则相对地移动得快一些。经过一段时间的展开，不同的物质就被彼此分开，最后形成互相分离的斑点。戊糖（木糖）：黄绿戊糖（木糖）：黄绿已糖（果糖、葡萄糖）：棕红、已糖（果糖、葡萄糖）：棕红、灰绿灰绿二糖（蔗糖）：兰褐二糖（蔗糖）：兰褐三糖三糖薄层层析的优点：1.展层时间短，薄层层析分离混合物一般仅需

38、15-60min；2.设备简单，操作方便，既适用于分析，也适用于制备；3.灵敏度高，可检出微量物质。4.分离能力强，斑点集中。经过适当的时间以后，不同的物质各自形成区带，如果被分离的是有色物质的话，就可以清楚地看到色带(色层)。如果被吸附的物质没有颜色，可用适当的显色剂（喷雾显色）或紫外光观察定位。4.吸附层析显色吸附层析显色5.吸附层析的应用吸附层析的应用 氨基酸、肽、糖类、脂类、苷（皂苷）类物质的分离、鉴定 纯净水、医药用水的制备 药液脱色分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在流动相和固定相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数。c2)(1)(物质在流动相中的浓度物质在固定

39、相中的浓度c K（分配系数）=分配系数与温度、溶质和溶剂的性质有关，当两相做相对运动时，不同组分可得到分离。(五）分配层析（五）分配层析（partition chromatographypartition chromatography）利用混合物在两种或两种以上的不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方法，叫分配层析。1.概念概念 固定在载体上的液体称为固定相，用做洗脱的液体称为流动相，则混合物各组分在两相间发生不同的分配现象而逐渐分开，形成色层。载体在分配层析中只起负担固定作用，它们是一些吸附力小、反应性弱的惰性物质如淀粉、纤维素、滤纸等。固定相液体均匀覆盖于载体表面，固定相除水外，还有稀硫

40、酸、甲醇、仲酰胺等强极性溶液。流动相采用比固定相极性小或非极性的有机溶剂。概念概念分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动慢；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动快，因此可彼此分开。2.分配层析基本原理分配层析基本原理hH纸层析是以滤纸作为载体的层析技术，分配原理属于分配层析的范畴。滤纸纤维上的羟基具有亲水性(能吸收22%左右的水)，吸附一层水作为固定相，纸纤维与有机溶剂的亲和力很小，所以某些有机溶剂，如醇、酚等为常用的流动相。3.纸层析纸层析纸层析纸层析基本过程基本过程将待分离物质上样于滤纸一端，使流动相溶剂浸入移动。当流动相沿滤纸经过样品时，样品在水和有机溶剂这两相之间不断进行

41、分配，由于几种待分离物质有不同的分配系数，因而在两相之间发生分配现象，最后逐渐分布到滤纸的不同部位。分配系数较大的成分，在纸上随流动相移动速率就小，其层析点位置离原点的位置就较近。反之，分配系数较小的成分，其移动速率就大，层析点位置离原点也远。纸层析纸层析基本过程基本过程原点溶剂前沿氨基酸显色点XY纸层析示意图Rf=YX原点至溶剂前沿的距离原点至色斑中心的距离物质在滤纸上移动的速率可用Rf值(比移值)表示：Rf值取决于被分离物质在两相间的分配系数以及两相的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以Rf值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，由此可以根据Rf值的大小

42、对物质进行定性分析。纸层析纸层析Rf值值(比移值比移值)YX原点至溶剂前沿的距离原点至色斑中心的距离Rf=溶剂前沿溶质最高浓度中心原点中心溶质最高浓度中心至原点中心距离溶质前沿至原点中心距离Rf值计算示意图根据操作方式不同纸层析分类纸层析分类垂直型水平型纸层析将圆形滤纸置于水平位置，溶剂由中心向四周扩散是将滤纸条悬挂，使流动相向上或向下扩散 为了显示层析斑点位置，可根据物质的性质不同，采用显色剂显示或紫外光显示。(1)显色剂显示：被分离物质与显色剂生成有颜色的化合物，显示斑点位置。常用喷雾法、浸渍法或涂刷法。(2)紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，如核苷酸类物质。有些物质受紫外光照射会发出

43、荧光，如维生素B1、B2等，所以可在紫外光照射下观察到被分离物质的斑点。纸层析显色纸层析显色层析后的斑点显示出来后，计算出各斑点的Rf值，就可以对物质进行定性。纸层析定性分析纸层析定性分析纸层析小实验动画演示81也称为亲和色谱、功能层析、生物专一性吸附或选择层析。它是一种分离和纯化生物高分子化合物非常有效的方法。大多数生物高分子化合物都具有和某些相对应的专一分子发生可逆性结合的特性。例如，酶与底物（或其辅酶、辅助因子、竞争性抑制剂等），抗原-抗体、激素-受体、DNA-RNA等，通过某些次级键相互结合，并在一定条件下又可解离。（五）亲和层析（五）亲和层析（Affinity Chromatogra

44、phy）82生物分子间的这种特异的可逆结合能力，称为亲和力。根据这种具有亲和力的生物分子间可逆地结合和解离的原理发展起来的层析称之为亲和层析。生物体内能发生特异的相互作用的成分有：酶与酶的底物酶与酶的底物酶与酶的抑制剂酶与酶的抑制剂酶与酶的变构效应剂酶与酶的变构效应剂酶与酶的辅酶酶与酶的辅酶激素与细胞膜上的受体激素与细胞膜上的受体维生素与结合蛋白维生素与结合蛋白核酸核酸(DNA-RNA)抗原与抗体抗原与抗体外源凝集素与红细胞表面的抗原外源凝集素与红细胞表面的抗原84 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。优点：高度选择性、操作条件温和、应用范围窄

45、缺点：层析剂价格贵 1.亲和层析概念亲和层析概念852.亲和层析的分离原理亲和层析的分离原理被固定在载体（基质）上的分子称为配体（配基），配体和载体共价结合，构成亲和层析的固定相亲和吸附剂。利用目标分子与其配体之间的特异性生物亲和力（特异、可逆），对其进行分离。配体配体载体载体目标分子目标分子87亲和层析的基本过程亲和层析的基本过程与纯化物质特异结合的配基连接在水不溶的载体上。将配基与载体形成的亲和层析介质装入层析柱。被分离样品上柱进行亲和吸附。改变条件对吸附在亲和层析柱上的被分离物质洗脱下来。使用过和亲和层析柱充分洗涤后进行再生。91亲和层析的洗脱亲和层析的洗脱如果纯化对象与配体的亲和力不强，当连续通过大量的平衡缓冲液，就能在杂质洗出后，得到所要的物质；若亲和力较强，则要使用较强的酸或碱作为冲洗液，或添加盐酸胍，但这些溶液容易使纯化对象失去生物活性；用较高浓度的配体溶液亦可将管柱上所吸附的物质洗出，此配体可以与管柱上的配体相同或相异。使用亲和力更强的配基做洗脱剂应该更为有效。953.亲和层析的应用亲和层析的应用核酸的纯化激素受体的纯化抗体与抗原的纯化酶和酶的抑制剂纯化97END