第四讲蛋白质结构解析技术一授课用-课件.ppt

1、第四讲蛋白质结构解析技术一第四讲 蛋白质结构解析技术（一）氨基酸序列分析氨基酸序列分析 X-射线衍射技术射线衍射技术 核磁共振核磁共振 质谱技术质谱技术 结构分析的其它方法结构分析的其它方法 现代光谱技术现代光谱技术 三维电镜重构技术三维电镜重构技术 动力学全局研究技术动力学全局研究技术UV-Vis、IR、荧光、荧光、蛋白质结构和构象；蛋白质结构和构象；构象变化过程；构象变化过程；如：蛋白质折叠过程中间态形如：蛋白质折叠过程中间态形成的时间尺度和机制成的时间尺度和机制.二级结构形成、卷曲过程，二级结构形成、卷曲过程，变性和复性过程及机制。变性和复性过程及机制。主主要要内内容容是结构与功能研究的

2、基础第一节第一节 蛋白质氨基酸序列分析技术蛋白质氨基酸序列分析技术主要内容主要内容 化学法化学法 基因方法基因方法 蛋白质分子中蛋白质分子中二硫键二硫键和和酰胺基酰胺基位置的确定位置的确定 蛋白质测定新技术蛋白质测定新技术一级结构测定的意义：一级结构测定的意义：l寡核苷酸探针寡核苷酸探针的设计与制备的设计与制备 cDNA推导氨基酸序列推导氨基酸序列提供依据提供依据 重组重组DNA产生的蛋白指纹分析产生的蛋白指纹分析l蛋白质的完整结构鉴定蛋白质的完整结构鉴定l确定翻译后修饰的位点确定翻译后修饰的位点l决定簇的定位决定簇的定位l二硫键的确定二硫键的确定采用采用部分水解部分水解的方法的方法试图试图测

3、定蛋白质测定蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列Consden等利用等利用色谱技术色谱技术成功测定了成功测定了短杆菌肽短杆菌肽S6的氨基酸序列的氨基酸序列Sanger首次测定了首次测定了的一级结构的一级结构（由（由51个氨基酸残基组成）个氨基酸残基组成）Spackman、Stein、Moore制造了制造了，使氨基酸定量分析进入了，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段一个崭新的阶段Edman 推出第一台推出第一台l N-末端氨基酸的测定方法末端氨基酸的测定方法（主要（主要5类）类）1、二硝基氟苯法（、二硝基氟苯法（DNFB法、法、Sanger法）法）2、二甲氨基萘磺酰氯法（、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS

4、-Cl法）法）DNS-氨基酸呈荧光氨基酸呈荧光3、异硫氰酸苯酯法（、异硫氰酸苯酯法（PITC法）法）4、DABITC法（法（甲氨偶氮苯基甲氨偶氮苯基异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯），），形成的形成的DABIH氨基酸呈氨基酸呈桔黄色（有颜色）桔黄色（有颜色）5、氨肽酶法、氨肽酶法 N-末端测定的方法末端测定的方法奠定了序列测定方法发展基础奠定了序列测定方法发展基础牛胰岛素（牛胰岛素（51aa）的一级结构）的一级结构l Sanger首次首次(DNFB法法)测定了测定了牛胰岛素牛胰岛素的一级结构的一级结构 Sanger法（测定蛋白法（测定蛋白N末端的方法）末端的方法）（一）（一）N N端测序法端测序法l应

5、用最广的应用最广的N N端顺序测定法端顺序测定法大多仍以大多仍以EdmanEdman降解原理降解原理为基础设计。为基础设计。l利用化学试剂和控制反应条件，从利用化学试剂和控制反应条件，从N N端开始，将肽链逐步降解，进行氨基酸序端开始，将肽链逐步降解，进行氨基酸序列的测定的方法。列的测定的方法。1 1、EdmanEdman降解法降解法异硫异硫氰氰酸苯酯（酸苯酯（PITCPITC）法）法特点：特点：l可以测定氨基酸的排列顺序（包括可以测定氨基酸的排列顺序（包括N N端分析）。端分析）。l适用于手工操作，也可设计自动化测定仪器适用于手工操作，也可设计自动化测定仪器（1 1）原理：）原理：四点：四点

6、：异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯(PITC)(PITC)偶联偶联 ATZ-ATZ-氨基酸裂解氨基酸裂解 PTH-PTH-氨基酸转化氨基酸转化 PTH-PTH-氨基酸的鉴定氨基酸的鉴定自由自由-氨基与氨基与异硫氰异硫氰酸苯酯酸苯酯(PITC)试剂偶联，与试剂偶联，与其紧挨的其紧挨的第二个残基第二个残基的键合的键合力大大减弱，很容易断裂。力大大减弱，很容易断裂。在无水条件下酸在无水条件下酸（F3CCOOH）裂解，形）裂解，形成成苯氨基噻唑啉酮苯氨基噻唑啉酮衍生衍生物（物（ATZ-氨基酸氨基酸）和失）和失去末端氨基酸残基的多去末端氨基酸残基的多肽，又可与肽，又可与PITC进行偶进行偶联反应，下一轮降解。联

7、反应，下一轮降解。ATZ-氨基酸不稳定，三氟乙酸氨基酸不稳定，三氟乙酸水溶液水溶液（25%）可转化成稳定的）可转化成稳定的PTH-氨基酸氨基酸。PTH-氨基酸的氨基酸的鉴定鉴定：可以通过薄层层析、气相色：可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。乙内酰苯硫脲氨基酸乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH氨基酸氨基酸)。PITC试剂试剂ATZ-氨基酸氨基酸单向纸层析单向纸层析氨基酸鉴定氨基酸鉴定PTH-氨基酸氨基酸与标准氨基酸（与标准氨基酸（PITC试剂反应）对照试剂反应）对照 双向纸层析双向纸层析 薄层层析（薄层层析（TLC）高效液相色谱高效

8、液相色谱（HPLC）（high performance liquid chromatography）（2）氨基酸序列分析仪器氨基酸序列分析仪器l以以Edman法测序，手工操作繁琐，工作量大法测序，手工操作繁琐，工作量大l根据根据Edman降解的原理降解的原理自动化分析仪器自动化分析仪器l自自70年代初年代初全自动序列仪全自动序列仪诞生以来，经过了一系列更诞生以来，经过了一系列更新换代，仪器日趋灵敏、快速。新换代，仪器日趋灵敏、快速。l灵敏度达灵敏度达0.1 pmol 蛋白蛋白3种种代表性的测序仪器代表性的测序仪器简单介绍如下：简单介绍如下：液相旋转杯序列仪液相旋转杯序列仪l最初的自动化仪器，对

9、最初的自动化仪器，对自动化测序自动化测序意义很大。意义很大。l测定程序：测定程序：整个仪器的整个仪器的“核心核心”部分是一个部分是一个反应杯反应杯，它由一个，它由一个马达马达带动并有调带动并有调速速控制控制。蛋白质或多肽蛋白质或多肽样品样品经经导管导管注入注入反应杯反应杯，通过，通过旋转离心力旋转离心力被均匀地涂被均匀地涂在在杯壁杯壁上，形成一层上，形成一层薄膜薄膜，其厚薄可由转速控制。，其厚薄可由转速控制。反应试剂反应试剂和和溶剂溶剂分别通过分别通过导管导管进入进入反应杯反应杯，与杯内薄层上的样品的，与杯内薄层上的样品的N端自由氨基端自由氨基进行进行Edman反应；反应；降解下来的降解下来的

10、ATZ氨基酸衍生物氨基酸衍生物通过另一通过另一导管导管引出并引出并收集收集；再将再将ATZ氨基酸氨基酸PTH氨基酸氨基酸鉴定鉴定；洗涤反应杯，依次洗涤反应杯，依次循环循环分析。分析。l特点：该仪器样品流失较大，样品消耗量大，目前已很少使用。特点：该仪器样品流失较大，样品消耗量大，目前已很少使用。固相序列分析仪固相序列分析仪发展的动力和原因：发展的动力和原因：克服液相旋转杯分析仪的缺点。克服液相旋转杯分析仪的缺点。多肽不易吸附旋转杯上，多肽不易吸附旋转杯上，样品流失较大样品流失较大；原理：原理：蛋白质蛋白质C端端羧基羧基共价固定共价固定在惰性载体上，进行在惰性载体上，进行Edman降解。降解。特

11、点：特点：样品与载体共价结合，洗涤和抽提等过程样品与载体共价结合，洗涤和抽提等过程不会丢失不会丢失样品，样品，增加循环次数增加循环次数。缺点：缺点：（1）若多肽中）若多肽中其它残基的羧基其它残基的羧基与载体结合，影响测定。与载体结合，影响测定。如：酸性氨基酸残基（如：酸性氨基酸残基（Asp、Glu）（2）测定效率低）测定效率低3-氨基丙基玻璃氨基丙基玻璃N-(2-氨基乙基氨基乙基)-3-氨基丙基玻璃氨基丙基玻璃惰性载体惰性载体成功的关键是成功的关键是肽段肽段的固定，目前采用的固定，目前采用C端端-羧基固定法羧基固定法，重复法高，重复法高，高丝氨酸内酯高丝氨酸内酯法及法及双异硫氰酯双异硫氰酯法法

12、(DITC)最好，固定率可达最好，固定率可达90-95%。气相蛋白序列分析仪气相蛋白序列分析仪弹筒型玻璃反应室弹筒型玻璃反应室反应室容积反应室容积0.05 ml，代替液相序列仪中的旋转玻璃杯，代替液相序列仪中的旋转玻璃杯，用一种惰性聚合物用一种惰性聚合物“polybrene”固定样品。固定样品。多肽链与多肽链与气态气态试剂反应，完成试剂反应，完成Edamn降解。降解。优点优点：灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需10100 pmol；试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的110，降低了费用；降低了费用；缩短了每步降解循环时间，提高了

13、分析效率。缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。趋势：趋势：灵敏度不断提高灵敏度不断提高气相蛋白序列分析仪气相蛋白序列分析仪（3）Edman方法改进方法改进 DABITC法：法：1976年，（华裔科学家）年，（华裔科学家）张瑞耀张瑞耀提出提出试剂：试剂：甲氨偶氮苯基甲氨偶氮苯基异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯 替代了替代了 异硫氰酸苯酯（异硫氰酸苯酯（PITC）DABITC：4-N,N-对甲氨基偶氮苯对甲氨基偶氮苯-4-异硫氰酸酯异硫氰酸酯原理：原理：与与PITC相似，形成相似，形成有色产物有色产物DABIH氨基酸，呈氨基酸，呈桔黄色桔黄色也称为有色的也称为有色的Edman降解法，降解法，氨基酸鉴定

14、无需染色，肉眼可分辨氨基酸鉴定无需染色，肉眼可分辨特点：特点：灵敏度灵敏度很高很高，分析小肽段只要几个，分析小肽段只要几个nanomole样品即可。样品即可。但但DABITC试剂与多肽试剂与多肽N端端aa耦合率低耦合率低（20%-30%），），测序干扰大测序干扰大！如何解决？如何解决？DABITCPITC两种方法耦合，两种方法耦合，更加灵敏可靠。更加灵敏可靠。适用于：液相还是固相，手工还是自动方法，效果良好。适用于：液相还是固相，手工还是自动方法，效果良好。异硫氰酸酯进行异硫氰酸酯进行35S标记标记：使分析样品更向微量化方向发展。：使分析样品更向微量化方向发展。二甲氨基二甲氨基萘磺酰氯萘磺酰氯

15、法（法（DNS-Cl法）法）荧光剂荧光剂DNS-Cl，与肽链，与肽链N端氨基反应生成端氨基反应生成DNS-肽肽经酸水解，经酸水解，N-末端残基形成末端残基形成DNS-氨基酸氨基酸，检测灵敏度提高，检测灵敏度提高310倍。倍。乙酸乙酯抽提，层析鉴定，乙酸乙酯抽提，层析鉴定，DNS-氨基酸于氨基酸于360nm或或280nm处产生强处产生强烈荧光，根据荧光点位置确定烈荧光，根据荧光点位置确定N端氨基酸。端氨基酸。6 M HCl，110水解过夜水解过夜 DNS-脯氨酸脯氨酸70%被破坏。被破坏。Gln Glu，Asn Asp Trp及其及其DNS衍生物衍生物完全被破坏完全被破坏(可用可用巯基乙烷磺酸巯

16、基乙烷磺酸真空下水解真空下水解)特点：特点：不能连续降解，适用于不能连续降解，适用于N末端分析末端分析N(CH3)2SO2ClH2N CH CROHN CH CROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HN CH CROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸（n-1）肽荧光？荧光？lDNSEdman测定法测定法l两种方法的结合两种方法的结合lDNS法，灵敏的高，但不能连续进行法，灵敏的高，但不能连续进行lEdman降解法降解法N肽肽DNS-Cl N末端氨基酸测定末端氨基酸测定Edman降解除去降解除去N末端氨基酸末端氨基酸水层（水层（n-1）肽）肽乙酸乙酯层乙酸乙

17、酯层（N末端氨基酸衍生物）末端氨基酸衍生物）DNS-Cl N末端氨基酸测定末端氨基酸测定Edman降解除去降解除去N末端氨基酸末端氨基酸DNSEdman测定流程示意图测定流程示意图思考？为何要创新很多方法？什么样的方法能延续下去？（4）氨基酸自动序列仪的使用方法）氨基酸自动序列仪的使用方法依据依据Ednan原理，氨基酸自动测序仪，序列分析加快原理，氨基酸自动测序仪，序列分析加快测序仪发展方向：微量化、自动化测序仪发展方向：微量化、自动化加样量达到微量：加样量达到微量：10-910-12mol水平水平推出从进样到色谱分析一体化分析仪推出从进样到色谱分析一体化分析仪举例：举例：Shimadzu（岛

18、津）岛津）公司公司 PPSQ-21A 氨基酸自动测序氨基酸自动测序仪仪工作原理：工作原理：Ednan降解，产物乙内酰苯硫脲氨基酸（降解，产物乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），氨基酸），柱前衍生的液相色谱（柱前衍生的液相色谱（HPLC）分析。）分析。工作流程工作流程固定样品固定样品固定固定将蛋白固定在将蛋白固定在高聚纤维素高聚纤维素上，在放在能固定蛋白的上，在放在能固定蛋白的聚偏氟乙烯聚偏氟乙烯（PDVF）膜膜上，进行上，进行Edman降解。降解。反应器反应器耦合耦合以以N-甲基哌啶水甲基哌啶水/甲醇甲醇（TMA）气雾环境让蛋白末端）气雾环境让蛋白末端氨基酸与氨基酸与PITC反应，生产反应，

19、生产PTC-肽肽反应器反应器终止反应终止反应用用乙酸乙酸清洗出去多余的试剂和副产物清洗出去多余的试剂和副产物反应器反应器裂解裂解无水无水TFA溶液，将溶液，将PTC-肽裂解为肽裂解为ATZ-氨基酸和（氨基酸和（n-1）肽，排出并洗涤）肽，排出并洗涤转换器转换器转换反应转换反应采用采用25%TFA溶液将溶液将ATZ-AA转化为转化为PTH-AA转换器转换器提取提取在转换器提取游离的在转换器提取游离的PTH-氨基酸氨基酸样品进样样品进样进样进样用乙腈溶液溶解用乙腈溶液溶解PTH-氨基酸，并进样到氨基酸，并进样到HPLCHPLC分析分析分离鉴定分离鉴定反向反向HPLC分离分离PTH-氨基酸，并检测氨

20、基酸，并检测数据处理数据处理数据分析数据分析显示和处理数据，确定显示和处理数据，确定PTH-氨基酸，并进行定量和氨基酸，并进行定量和回收率计算回收率计算（5）影响）影响N端端Edman反应裂解率的因素反应裂解率的因素在测序中，即使在测序中，即使N端很均一的蛋白质端很均一的蛋白质(第一个循环出现单个氨基酸残第一个循环出现单个氨基酸残基基)，经过，经过十几个循环十几个循环后后背景明显不及第一个残基清晰。背景明显不及第一个残基清晰。原因：原因：Edman反应是一个反应是一个化学过程化学过程，在其偶联、裂解、转化等步骤都，在其偶联、裂解、转化等步骤都有可能发生一些有可能发生一些副反应副反应，从而影响最

21、终裂解效率。，从而影响最终裂解效率。三氟乙酸三氟乙酸除了除了裂解裂解作用外，可与作用外，可与Ser和和Thr上的上的-OH反应，继而反应，继而部分封闭部分封闭Ser和和Thr的的N端端-氨基氨基，导致，导致Ser和和Thr时时产率突然降产率突然降低低。Ser和和Thr的的PTH-衍生物衍生物部分转化成部分转化成其他产物其他产物，造成产率降低。，造成产率降低。偶联试剂偶联试剂PITC本身也将发生本身也将发生副反应副反应，形成一些，形成一些“杂质杂质”。（6）N端测序前样品处理端测序前样品处理纯度鉴定（纯度鉴定（97%）脱盐脱盐疏基修饰疏基修饰去除去除N端封闭的基团（酸水解，酶处理）端封闭的基团（

22、酸水解，酶处理）（二）（二）C端测序法端测序法虽然自动化虽然自动化N端测序端测序技术日趋成熟，技术日趋成熟，但仍有不少问题需借助但仍有不少问题需借助C端序列端序列分析来解决（？）分析来解决（？）C端测序优势：端测序优势：尤其适合于尤其适合于基因重组蛋白基因重组蛋白是否正确表达的鉴定（是否正确表达的鉴定（Why？）？）大规模生产时的大规模生产时的质量控制质量控制、N端封闭蛋白端封闭蛋白的分析的分析DNA探针或引物的设计探针或引物的设计。1、原理（、原理（C端分析端分析）基于与基于与N端端Edman降解降解类似类似的原理的原理，采用化学试剂与蛋白质和多肽的采用化学试剂与蛋白质和多肽的-COOH反应

23、反应，反应后的反应后的C末端衍生物末端衍生物被切割下来，被切割下来，通过通过HPLC系统进行系统进行分离分析分离分析。u已有自动化的已有自动化的C端序列分析仪端序列分析仪lC端的端的自由羧基自由羧基与与乙酸酐乙酸酐反应生反应生成混合酸酐，成混合酸酐，l混合酸酐混合酸酐再环化成再环化成聚噁唑酮聚噁唑酮，l在在四丁基铵硫氰酸盐四丁基铵硫氰酸盐的作用下，的作用下，转化为转化为(TH)。l而而侧链侧链上的上的羧基羧基形成的混合酸酐形成的混合酸酐则则难以难以成环。成环。2、C端序列分析程序端序列分析程序六个步骤、六个步骤、羧基活化羧基活化侧链侧链羧基羧基保护保护烷基化烷基化TH肽肽侧链侧链羟基羟基保护保

24、护断裂形成断裂形成ATH-AA AA分析分析 侧链羧基侧链羧基形成混合酸酐，与形成混合酸酐，与哌叮硫氰酸盐哌叮硫氰酸盐（piperidine thiocyanate）进一步作用）进一步作用形成形成酰胺酰胺，以保护侧链，以保护侧链羧基。羧基。lC末端环化成的末端环化成的乙内酰硫脲（乙内酰硫脲（TH）衍生物较为）衍生物较为稳定稳定而而不易不易被切割，被切割，产率不高。产率不高。l选择性地选择性地烷基化烷基化修饰修饰硫原子硫原子，形成，形成烷基化烷基化-TH(ATH)衍生物，衍生物，裂解裂解产率产率将大大提高。将大大提高。lThr和和Ser残基的侧链上具有残基的侧链上具有羟基羟基l羟基不稳定，羟基不

25、稳定，会干扰测序，需要修饰。会干扰测序，需要修饰。l乙酸酐乙酸酐将将羟基乙酰化羟基乙酰化，但反应，但反应不完全不完全。lN-甲基咪唑（甲基咪唑（NMI）和乙酸酐共同作用，和乙酸酐共同作用，l将将Thr和和Ser的的羟基乙酰化羟基乙酰化。lC末端末端ATH衍生物衍生物在在酸性酸性条件下与条件下与硫氰酸盐硫氰酸盐反应而被裂解生成反应而被裂解生成ATH-氨基酸氨基酸。l新的新的C末端自动环化形成末端自动环化形成乙内酰硫脲（乙内酰硫脲（TH），而不必重新活化。，而不必重新活化。l整个测序整个测序过程只需在开始时对过程只需在开始时对C端进行端进行一次性活化一次性活化，并修饰，并修饰Asp和和Glu侧链羧

26、基侧链羧基，以及，以及Thr和和Ser的羟基的羟基。C末端测序程序末端测序程序羧基活化羧基活化侧链侧链羧基羧基保护保护烷基化烷基化TH肽肽侧链侧链羟基羟基保护保护断裂形成断裂形成ATH-AA AA分析分析测定测定C端第一个和第二个氨基酸工艺的区别端第一个和第二个氨基酸工艺的区别3、C末端蛋白质序列仪末端蛋白质序列仪l可由可由N端序列仪改装而成，不同之处主要在于端序列仪改装而成，不同之处主要在于:(1)反应所用的反应所用的试剂试剂不同，两者不同，两者不兼容不兼容，否则易，否则易堵塞堵塞管道。管道。C端序列仪：端序列仪：所有的化学反应均在弹筒型所有的化学反应均在弹筒型反应室反应室中进行，中进行，切

27、割下来的切割下来的ATH-AA仅在仅在转化腔转化腔内干燥和溶解后内干燥和溶解后即可进入即可进入HPLC系统分离分析。系统分离分析。N端测序仪：端测序仪：(2)ATZ-AA需在转化腔中转化为需在转化腔中转化为PTH-AA。4、C端测序样品前处理端测序样品前处理l纯度鉴定纯度鉴定l 脱盐脱盐l疏基修饰疏基修饰l-氨基的衍生氨基的衍生5、影响、影响C端测序反应产率的因素端测序反应产率的因素l不同的氨基酸的反应产率不同，图谱分析比不同的氨基酸的反应产率不同，图谱分析比N端测序复杂。端测序复杂。C端测序端测序副反应副反应较多，较多，最高起始产率最高起始产率仅为仅为20%，Glu Asp Ser Thr等

28、残基的等残基的产率更低产率更低。若若C端端富含富含这几种残基，测序十分困难。这几种残基，测序十分困难。lPro残基终止残基终止测序过程测序过程Pro 残基有残基有吡咯环，其羧基吡咯环，其羧基与乙酸酐反应与乙酸酐反应不能成环不能成环。一旦遇到一旦遇到Pro，整个整个测序过程将终止测序过程将终止。l到目前为止，到目前为止，C端序列可测端序列可测 l10个残基，平均个残基，平均35个个，一次测序需要的量比一次测序需要的量比N端测序要大得多，至少需端测序要大得多，至少需1nmol。l作为作为N端测序的补充。端测序的补充。（三）蛋白质一级结构测定步骤 蛋白质水解多个短肽 测定每个短肽的序列 序列拼接蛋白

29、质序列 二硫键和酰胺位置的确定1、酶解和分离、酶解和分离l长肽链长肽链降解成降解成短肽短肽以利于多肽的序列测定以利于多肽的序列测定l长肽链降解成短肽与氨基酸测序长肽链降解成短肽与氨基酸测序结合结合进行序列分析进行序列分析l长肽链降解成短肽以利于长肽链降解成短肽以利于测定肽谱测定肽谱常用酶及降解位点常用酶及降解位点 胰蛋白酶胰蛋白酶 Lys、Arg等碱性等碱性aa羧基羧基端，不切端，不切-Arg-Pro-、-Lys-Pro-胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 芳香芳香aa羧基端羧基端 胃蛋白酶胃蛋白酶 Phe、Trp、Leu、Ala等等aa羧基端羧基端 梭菌蛋白酶梭菌蛋白酶 Arg等碱性等碱性aa羧基端羧

30、基端 V8蛋白酶蛋白酶 Asp、Glu等酸性等酸性aa羧基端羧基端 Lys内肽酶内肽酶 Lys羧基端羧基端 优点：专一性强、条件温和、副反应少、水解率高优点：专一性强、条件温和、副反应少、水解率高短肽分离：采用HPLC方法蛋白质分离纯化章节详细介绍方法和原理 测序不能太长，常常需要酶切测序，肽链拼接。（拼图游戏）测序不能太长，常常需要酶切测序，肽链拼接。（拼图游戏）根据肽链测序结果根据肽链测序结果 若一条简单肽链：若一条简单肽链：仅有仅有12个断裂点，根据个断裂点，根据N和和C末端氨基酸，很容易确定其一级结构。末端氨基酸，很容易确定其一级结构。若为复杂的肽链：若为复杂的肽链：不能只靠不能只靠一

31、套肽链断裂一套肽链断裂方法，需要两套甚至更多的断裂方法分别测序，方法，需要两套甚至更多的断裂方法分别测序，通过查找通过查找叠肽叠肽的方法，分析确定的方法，分析确定完整的完整的氨基酸序列。氨基酸序列。举例说明：举例说明：（拼图）（拼图）2、肽链拼接、肽链拼接重叠肽法重叠肽法l 一条一条15个氨基酸残基组成的多肽，其个氨基酸残基组成的多肽，其N末端为末端为His，C末端为末端为Glu。采用两套断裂方法分别测序：采用两套断裂方法分别测序：第一套将肽段断裂成第一套将肽段断裂成5个小片段，其序列分别为个小片段，其序列分别为Lys-Trp-Glu，Cys-Glu，Asp-Lys-Va-Asp，Leu-Pr

32、o-Ala和（和（1）His-Lys-Ile-Tyr。第二套肽段断裂为第二套肽段断裂为Glu-Asp-Lys，（，（4）Ile-Tyr-Lys-Trp，Val-Asp-Leu-Pro，（，（2）Ala-Cys-Glu和（和（3）His-Lys。通过通过N、C末端及重叠肽最后可定编为：末端及重叠肽最后可定编为：His-Lys-Ile-Tyr-Lys-Trp-Glu-Asp-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Ala-Cys-Glu3、二硫键和酰胺基位置的确定、二硫键和酰胺基位置的确定（1）为何要确定？）为何要确定？Cys如何存在，是否形成二硫键如何存在，是否形成二硫键Gln和和Asn在测序过

33、程中水解形成在测序过程中水解形成Glu和和Asp（2）二硫键位置的确定方法（对角线电泳、测序法）二硫键位置的确定方法（对角线电泳、测序法）用用碘代乙酰胺碘代乙酰胺保护保护蛋白样品中蛋白样品中未参与二硫键的未参与二硫键的巯基巯基；（胃蛋白酶）水解，水解肽段进行（胃蛋白酶）水解，水解肽段进行对角线法电泳分离对角线法电泳分离。点在方形滤纸中心点上，进行第一相电泳分离点在方形滤纸中心点上，进行第一相电泳分离(pH 6.5)。将滤纸用将滤纸用过甲酸过甲酸蒸汽熏蒸蒸汽熏蒸，二硫键氧化成半胱氨磺酸二硫键氧化成半胱氨磺酸。（酶切片段（酶切片段 若含有二硫键，即分成若含有二硫键，即分成2个小肽）个小肽）染色后，

34、剪下偏离对角线的染色后，剪下偏离对角线的肽斑肽斑，分析，分析其氨基酸顺序其氨基酸顺序，与已确定的，与已确定的氨基酸顺序氨基酸顺序比较，比较，即可确定二硫键的位置。即可确定二硫键的位置。（3）酰胺基位置的确定）酰胺基位置的确定l方法：肽链酶解片段定量方法：肽链酶解片段定量NH4推测法推测法肽链中肽链中酰胺酰胺基以基以Asn或或Gln形式存在。形式存在。酰胺基水解可释放酰胺基水解可释放NH4，测定，测定NH4量推测酰胺基的量推测酰胺基的含量含量。蛋白水解酶水解分离，可以得到含有酰胺基的肽段。蛋白水解酶水解分离，可以得到含有酰胺基的肽段。测定其酰胺基数和推测可能形成酰胺基的数量，测定其酰胺基数和推测

35、可能形成酰胺基的数量，如果二者数量相等，就可以确定酰胺基位置。如果二者数量相等，就可以确定酰胺基位置。若不符，应将肽链裂解为更小片段，再测酰胺基含量和可能存在若不符，应将肽链裂解为更小片段，再测酰胺基含量和可能存在的位置数目，直到两者相符为止。的位置数目，直到两者相符为止。三、三、序列测定其它方法序列测定其它方法基因序列分析法基因序列分析法（1）原理：翻译密码子）原理：翻译密码子（2）步骤：）步骤：蛋白质蛋白质N末端和末端和C末端氨基酸分析末端氨基酸分析特异性引物设计特异性引物设计 总总mRNA提取（特定蛋白质）：提取（特定蛋白质）：分离法：免疫法分离法：免疫法结合蛋白与结合蛋白与mRNA分子

36、杂交。分子杂交。克隆克隆mRNA：测定蛋白质：测定蛋白质N端端1015残基序列，设计兼并引物。残基序列，设计兼并引物。cDNA序列分析：序列分析：RT-PCR，测定，测定cDNA序列（？方法）序列（？方法）例如：荧光标记的双脱氧核苷末端终止法（？）例如：荧光标记的双脱氧核苷末端终止法（？）全自动系列分析仪，全自动系列分析仪，1000bp/反应，简单快速，成本低廉反应，简单快速，成本低廉根据密码规则读取蛋白质序列。根据密码规则读取蛋白质序列。四、蛋白质测定新技术（四、蛋白质测定新技术（分离纯化部分再介绍分离纯化部分再介绍）1、高效液相色谱（、高效液相色谱（HPLC）用于蛋白质、多肽和氨基酸的分析

37、用于蛋白质、多肽和氨基酸的分析色谱填充料：大孔径烷基化硅胶吸附剂（色谱填充料：大孔径烷基化硅胶吸附剂（C18）普通孔径：普通孔径：510um进一步提高分析速度和灵敏度进一步提高分析速度和灵敏度大孔径：大孔径：310-5mm（大肽）（大肽）小孔径：小孔径：110-5mm（小肽）（小肽）（1）微柱高效液相色谱（）微柱高效液相色谱（microcolum-HPLC）柱直径柱直径 2.1mm(普通普通4.6mm)，Ishii 首次提出首次提出是低分子量蛋白或肽的基础是低分子量蛋白或肽的基础样品用量少，速度快，灵敏度高（样品用量少，速度快，灵敏度高（1pmol），峰形尖窄，），峰形尖窄，回收率高，非特异性

38、吸附少。回收率高，非特异性吸附少。是目前肽谱分析最灵敏最先进的技术之一是目前肽谱分析最灵敏最先进的技术之一应用于肽谱和基因工程产物的分析应用于肽谱和基因工程产物的分析（2）无孔色谱短柱）无孔色谱短柱l填充直径无孔硅胶，达到快速分离。填充直径无孔硅胶，达到快速分离。l特点：特点：显著改善分析灵敏度显著改善分析灵敏度缩短分析时间（几分钟完成）缩短分析时间（几分钟完成）减少生物分子的非专一性吸附（回收率减少生物分子的非专一性吸附（回收率100%）降低洗脱体积（几个微升降低洗脱体积（几个微升1mL）可耐受较高压力（可耐受较高压力（30MPa）（3）毛细管液相色谱）毛细管液相色谱1995年年 Yamad

39、a建立建立柱内径：柱内径：250um500um，填充物直径填充物直径3-5um，孔径，孔径310-5mm，2.5ml注射泵，流速仅注射泵，流速仅35 uL/min，上样量上样量525ul，检测器：紫外或激光诱导荧光检测器检测器：紫外或激光诱导荧光检测器毛细管流出样品直接点样到聚偏氟乙烯膜（毛细管流出样品直接点样到聚偏氟乙烯膜（PVDF）上，）上，样品用刀片割样品用刀片割12mm条带，用于蛋白质序列分析。条带，用于蛋白质序列分析。灵敏度很高灵敏度很高2、毛细管电泳（、毛细管电泳（CE）20世纪世纪90年代年代 微量分析技术微量分析技术材料：熔融石英玻璃，内径小（材料：熔融石英玻璃，内径小（100

40、um）上样量极少（上样量极少（10uL）,灵敏度高，比灵敏度高，比HPLC高高2个数量级（个数量级（10-15mol）分类：分类：l毛细管毛细管区带区带电泳（电泳（CZE）；荷质比）；荷质比l等电等电聚焦聚焦电泳（电泳（CIEF）；等电点）；等电点l微团电动微团电动毛细管电泳（毛细管电泳（MECC）；疏水或离子交换）；疏水或离子交换l毛细管毛细管筛分筛分电泳（电泳（CSE）；分子大小和电荷；分子大小和电荷l毛细管毛细管柔和免疫电泳柔和免疫电泳（IACE）：与抗体结合专一性）：与抗体结合专一性本节小结本节小结蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定化学法测定原理及方法化学法测定原理及方法 重点重

41、点N端降解的原理、方法和影响因素，特别是端降解的原理、方法和影响因素，特别是Edman降解及其方法改进。降解及其方法改进。三种序列分析仪（旋转杯、固相、气相）三种序列分析仪（旋转杯、固相、气相）简单介绍了简单介绍了C端降解法的原理、方法和仪器，端降解法的原理、方法和仪器，化学法测定蛋白质序列测定的步骤化学法测定蛋白质序列测定的步骤酶解、分离纯化、肽段序列测定、序列拼接、二硫键和酰胺基位置的确定酶解、分离纯化、肽段序列测定、序列拼接、二硫键和酰胺基位置的确定简述基因序列分析原理和方法简述基因序列分析原理和方法HPLC和毛细管电泳等蛋白质测定新技术（略）和毛细管电泳等蛋白质测定新技术（略）第二节：

42、第二节：X-X-射线晶体结构分析射线晶体结构分析l本节主要内容本节主要内容研究进展研究进展基本概念基本概念基本原理基本原理特点特点 X X 射线衍射技术：射线衍射技术：精确精确测定测定原子原子在晶体中的在晶体中的空间位置空间位置的一整套测量及分析技术，的一整套测量及分析技术，是迄今研究生物大分子结构的是迄今研究生物大分子结构的主要技术主要技术。1.1.研究进展研究进展背景背景 1895年，伦琴发现年，伦琴发现X射线射线1913年年 布拉格布拉格父子用父子用X射线衍射法对射线衍射法对氯化钠、氯化钾氯化钠、氯化钾晶体进行了测定晶体进行了测定1915年年 布拉格父子因此获布拉格父子因此获诺贝尔物理奖

43、，建立了晶体学诺贝尔物理奖，建立了晶体学1934年年 第一张蛋白质第一张蛋白质-胃蛋白酶单晶体胃蛋白酶单晶体1957年年-1959年年 相继相继8种蛋白质获得了种蛋白质获得了高分辨率高分辨率结果结果1960年以后年以后 从单纯的从单纯的结构学结构学迈入迈入结构结构-功能功能研究。研究。1990年以后年以后 突飞猛进，突飞猛进，15个结构个结构/天天2003年年，PDB收录的收录的84.8%蛋白结构数据来自蛋白结构数据来自X-射线衍射射线衍射我国的标志性成果1中国科学院中国科学院生物物理生物物理研究所和研究所和植物植物研究所研究所“菠菜菠菜 捕光复合物捕光复合物LHC-II 晶体结构（晶体结构（

44、2.72A）2004年，世界上权威性的著名杂志年，世界上权威性的著名杂志Nature该晶体的结构彩图被选作该期杂志的该晶体的结构彩图被选作该期杂志的“封面照片封面照片”。世界上世界上率先完成率先完成了这一具有了这一具有高度挑战性高度挑战性的国际前沿课题。的国际前沿课题。推动了推动了中国中国“光合作用机理与膜蛋白三维结构光合作用机理与膜蛋白三维结构”研究进入研究进入国际领先水平国际领先水平。意义：基于意义：基于精确的结构数据精确的结构数据对对高等植物高等植物的的光能吸收光能吸收、传递传递和和光保护光保护等等光合作用机光合作用机理理研究的热点问题进行了探讨，发现了研究的热点问题进行了探讨，发现了膜

45、蛋白结晶的第膜蛋白结晶的第3种类型种类型，TYPE-III膜蛋白膜蛋白晶体，并建立了包括膜蛋白、色素分子和脂分子在内的蛋白脂质体的完整的结构晶体，并建立了包括膜蛋白、色素分子和脂分子在内的蛋白脂质体的完整的结构模型，提供了模型，提供了近近3万个万个独立的精确的独立的精确的原子坐标原子坐标。匡廷云院士匡廷云院士u2005年年7月月1日，清华大学日，清华大学+生物物理所生物物理所u解析了解析了“线粒体线粒体膜蛋白复合物膜蛋白复合物II”的精细结构的精细结构u意义：意义：填补了线粒体结构生物学和细胞生物学填补了线粒体结构生物学和细胞生物学领域领域的空白，的空白，称为称为线粒体呼吸链线粒体呼吸链研究领

46、域的一个新的研究领域的一个新的里程碑里程碑。为线粒体为线粒体疾病研究疾病研究提供了真实可靠的提供了真实可靠的模型模型我国的标志性成果2晶体：晶体：离子、原子或分子离子、原子或分子等等粒子粒子 在在三维空间三维空间上上重复排列重复排列形成的形成的有规律的有规律的。点阵点阵：晶体的几何图形晶体的几何图形。晶体中的。晶体中的粒子，粒子，在空在空间上按一定的间上按一定的重复规律重复规律排列而成的排列而成的几何图形几何图形。晶格：晶格：晶胞晶胞是构成晶体的基本单元是构成晶体的基本单元。按确定。按确定的单位划分成空间格子，在晶体中称晶格的单位划分成空间格子，在晶体中称晶格。NaCl晶体晶体2.晶体的基本概

47、念晶体的基本概念批量结晶法 batch crystallization质谱：ug级样品，一级结构的分子量、氨基酸排序、二硫键数目和位置；X-射线源：强度高，时间短（同步辐射）梭菌蛋白酶 Arg等碱性aa羧基端1957年-1959年 相继8种蛋白质获得了高分辨率结果1895年，伦琴发现X射线晶体中的粒子，在空间上按一定的重复规律排列而成的几何图形。是低分子量蛋白或肽的基础DABITCPITC两种方法耦合，更加灵敏可靠。直接获得分子的形貌信息；(2)侧链羧基的酰胺化保护结构模型建立：反复修正原子坐标、改善位相全自动系列分析仪，1000bp/反应，简单快速，成本低廉NMR结构测定基本程序膜蛋白或多结

48、构域蛋白需要几百次实验，才能获得好的模型5、影响C端测序反应产率的因素是迄今研究蛋白质结构最有效的方法Consden等利用色谱技术成功测定了2d sin=k (k=1,2,3，：掠射角：掠射角)2d cos=k (k=1,2,3，：入射角：入射角)布拉格布拉格X射线衍射原理射线衍射原理布拉格衍射布拉格衍射布拉格公式布拉格公式 3.晶体结构测定程序晶体结构测定程序（1）样品制备样品制备：要求纯度达要求纯度达95%以上以上浓度通常在浓度通常在10 mg/ml50 mg/ml以上以上（2）结晶和晶体生长（掌握）结晶和晶体生长（掌握）原理、原理、结晶（晶体生长、影响因素）及鉴定结晶（晶体生长、影响因素

49、）及鉴定（3）衍射及数据的收集和处理）衍射及数据的收集和处理：（4）位相确定）位相确定：（5）模型的建立和修正）模型的建立和修正：晶体中的粒子，在空间上按一定的重复规律排列而成的几何图形。CD(circular dichroism)：稀溶液中蛋白质二级结构的一种简单快速又较准确的方法,是利用不对称分子对左右圆偏振光系吸光率的不同来分析蛋白质结构。自70年代初全自动序列仪诞生以来，经过了一系列更新换代，仪器日趋灵敏、快速。3、异硫氰酸苯酯法（PITC法）DNA探针或引物的设计。一条15个氨基酸残基组成的多肽，其N末端为His，C末端为Glu。2d sin=k (k=1,2,3，：掠射角)7 动力

50、学全精研究技术（dynamics ensemble ferinement DER）三种序列分析仪（旋转杯、固相、气相）即可进入HPLC系统分离分析。1934年 第一张蛋白质-胃蛋白酶单晶体只能关注较小分子的结构（不做详细讲述，感兴趣者自己阅读学习）已有自动化的C端序列分析仪荧光剂DNS-Cl，与肽链N端氨基反应生成DNS-肽 结晶原理：结晶原理：在饱和溶液中，蛋白质分子间以规则方式慢慢堆积形成高度有序的结构。在饱和溶液中，蛋白质分子间以规则方式慢慢堆积形成高度有序的结构。晶体生长：晶体生长：首先形成晶核。晶核形成的影响因素有：首先形成晶核。晶核形成的影响因素有：化学：化学：pHpH、沉淀剂种类