第五章-分子标记技巧与植物育种课件.ppt

1、精品第五章_分子标记技巧与植物育种后期染色体的形态物种 染色体数目（2n）人类 Homo sapiens 46 小家鼠 Mus musculus 40 果蝇 Drosophila melanogaster 8 小麦 Triticum vulgare 42 水稻 Oryza sativa 24 豌豆 Pisum sativum 14 链孢霉 Neurospora crassa 7 衣藻 Chlamydomonas reinhardi 16 染色体染色体三体名称三体名称特征特征1 1三体三体1 1草状，生长缓慢，高度不育草状，生长缓慢，高度不育2 2三体三体2 2矮生，小穗短，护颖长，高度不育矮生

2、，小穗短，护颖长，高度不育3 3三体三体3 3完全不育，植株最矮，叶片厚呈革质完全不育，植株最矮，叶片厚呈革质4 4三体三体4 4植株最高，叶片下垂，叶舌长，可育植株最高，叶片下垂，叶舌长，可育5 5三体三体5 5叶片短且扭曲，着粒密，结实率高叶片短且扭曲，着粒密，结实率高6 6三体三体6 6子粒有芒，叶片厚而卷曲，高度不育子粒有芒，叶片厚而卷曲，高度不育7 7三体三体7 7叶片窄而半卷，穗不完全伸出，部分可育叶片窄而半卷，穗不完全伸出，部分可育8 8三体三体8 8叶片窄卷，叶舌短，子粒短而粗，部分可育叶片窄卷，叶舌短，子粒短而粗，部分可育9 9三体三体9 9叶片厚而浓绿，茎秆短，小穗最大叶片

3、厚而浓绿，茎秆短，小穗最大1010三体三体1010叶舌有毛，叶片直立，育性正常叶舌有毛，叶片直立，育性正常1111三体三体1111拟正常，需细胞学鉴定拟正常，需细胞学鉴定1212三体三体1212外型呈丛生草状，穗部顶端小穗退化，育性高外型呈丛生草状，穗部顶端小穗退化，育性高如：水稻IR36初级三体的形态特征带型特征同功酶标记是一种共显性标记水稻部分同工酶基因同工酶基因座位染色体 等位基因酸性磷酸酯酶Acp-1120-3Acp-2120,3Acp-4 71,2乙醇脱氢酶Adh-1110-3-淀粉酶Amy-1 70-3过氧化氢酶Cat-1 60-3酯酶Est-2 60,1,2Est-3 91,2E

4、st-5 10,1,2Est-7 70,1Est-9 71,2资料来源：Rice Genet.News.Vol.7。生化标记的优缺点：发展历史：RFLP标记在20世纪70年代被认识，随着分子杂交、放射性自显影技术的完善；到1980年，人类遗传学家Botstein 等构建了第一张病毒的RFLP遗传图谱；1987年Donis-keller构建了第一张人类的RFLP遗传图谱；以后在微生物、植物、动物和人类上都得到了广泛的利用。目前，该技术已广泛应用于遗传图谱的构建、基因定位、遗传进化研究、标记辅助选择等RFLP基因组DNA酶切DNA 琼脂糖电泳Southern转移DNA预杂交DNA探针放射性标记探针

5、放射性自显影分子杂交Characteristics of Some Restriction Endonucleases Number of CleavageEnzyme Organism from which Recognition Sequence Sites in DNA from:Name Enzyme is located and Position of Cut pBR322Bam HI Bacillus amyloliquefaciens H 5 G GATC C 3 5 1 3 C CTAG G 5Bgl IIBacillus globigi A GATC T 5 0 T CTAG

6、 AEco RIE.coli RY 13 G AATT C 5 1 C TTAA GHind IIIHaemophilus influenzae Rd A AGCT T 6 1 T TCGA APst IProvidencia stuartii C TGCA G18 1 G ACGT CSal IStreptomyces albus G G TCGA C 2 1 C AGCT GHae IIIHaemophilus egyptius GG CC 5026 CC GGHha IHaemophilus hemolyticus G CG C 5031 C GC G 一张杂交膜可以用多个探针去杂交同样

7、的探针，不同的RE,结果差别很大以cphy5 作探针得到的放射自显影图谱所用限制性内切酶为Hpa 和M sp。水稻品种:1、农垦58;2、农垦58S(幼苗);3、农垦58S(育性转换期);4、W 6154S。右侧为分子量标记K2Eco R I+H ind由于每一周期所产生的DNA均能成为下一次循环的模板(template)，所以PCR产物以指数方式增加，经过2535次周期之后，理论上可增加109倍(230=107109)，实际上至少可扩增105，一般可106107。9 0 变 性 解 链与 引 物 退 火，5 0 引 物 及 延 伸，7 5 n 次 扩 增第一次循环第二次循环3 5 3 5 3

8、 5 5 3 5 3 3 5 5 3 3 5 3 3 5 3 3 5 5 5 3 5 5 3 9 0 变 性 解 链与 引 物 退 火，5 0 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 引 物 及 延 伸，7 5 3 3 5 3 3 5 5 5 3 3 5 3 3 5 5 5 PCR原理示意图50 100 150 温度掺入的H-dNTTP微克分子数3相对酶活的分率20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 95 90 70 反应时间（分）掺入的H-dNTTP微克分子数320 40 60 80 25 50 75 Mg二价阳离子浓度（mM)Mn+掺

9、入的H-dNTTP微克分子数3100 200 6 7 8 9 10 pH1 2 3 1.25 mM磷酸缓冲液2.25 mMTris-HCl缓冲液3.25 mM甘氨酸缓冲液Taq DNA聚合酶的特性A-01 CAGGCCCTTC5335ABCDDACB若位点2处碱基发生改变，则:RFLP具有分子标记较多、多态率高、共显性等优点，可以对整个基因组作指纹分析，但其技术较为复杂。PCR具有技术比较简单，适应大量自动化作业，但特异性引物不易发展，数量有限，难以用作指纹分析。AFLPRFLP和PCR的技术都有许多优点，但也都存在一些不足之处。A B C A B CBCABCAAmplified fragm

10、ent length polymorphismsSelective restriction fragment ampliticationAFLP的实验过程AFLPAFLP荧光标记全自动荧光标记全自动AFLP原理与方法原理与方法For ABI 377 DNA Sequencer and AFLP KitsAFLPAFLP140012001000 800 600 400 200 0CATG/GTACCTTT/GAAAATC/TAGGATA/CTATTGG/ACCCAG/GTCTCT/CTCCGG/GCCATT/TAATTG/AACGT/CAGA/CTEstimated number of SSR

11、in the rice genomeSubjective view of the changing relative importance of different molecular markers.The horizontal axis indicates time.At each time point,the vertical axis corresponds to the total use ofmolecular markers.If more than one molecular marker is used at a given time point,its relative i

12、mportanceis reflected by its proportion on the vertical axis.RFLPSSRRAPDSNPAFLPDNA sequencing传统遗传图 连锁遗传图谱Morgan连锁遗传同一染色体上的基因连锁分子遗传图谱：标出不同分子标记在染色体上的相对位置及排列情况的连锁图。PF1BC1F1BCnFnNILNILs构建过程的示意图:Donor抗病Recipient感病NILs抗病P1（R）供体亲本P2（S）受体亲本NIL（R）导入片段显性标记分析的带型资料R/Rr/rRP:F2:F1:RrRr P1 P2 R S P1 P2 R S分子标记与基因无

13、连锁分子标记与基因连锁or无无连锁当两个混合池的带型无差异时，表明该标记与目的基因不连锁；当两个混合池的带型有差异时，表明该标记与目的基因可能存在连锁关系。DH群体P1P2MQMQmqmqMqMqF1MQMQmqmqmQmQ（1-r）QQ+rqq（1-r）/2r/2r/2（1-r）/2rQQ+（1-r）qqMMmm DH群体中某QTL的基因型QQ和qq在连锁标记基因型MM和mm中的频率分布。r为标记与QTL间的重组率，仅当r=0.5，即标记与QTL间没有连锁，QQ和qq在MM和mm中的频率分布才相同。标记基因型表型值区间作图（interval mapping）：以一定的步长（如1cM），沿整条

14、染色体逐步改变假设存在的QTL的位置，就能得到LOD（或LR）值沿染色体变化的曲线。大于显著临界值的LOD高峰所对应的染色体位置就是存在QTL可能性最大的位置。无法排除被检测区间之外的QTL对被检测区间的影响。significance threshold复合区间作图（composite interval mapping）combines the interval mapping technique with multiple regression analysis，Composite interval mapping assesses the probability that an inter

15、val between two markers is associated with a QTL that affects the trait of interest,as well as controlling for the effects of other markers on the trait(thus providing more accurate results).In this method,the test statistic is independent of QTL in other regions of the chromosomes.Choices of analys

16、is for quantitative trait locus mapping The data shown are from an analysis of mouse chromosome 11 for the quantitative trait called severity in a study of experimental allergic encephalomyelitus(EAE)a t-test(black diamonds)interval mapping(blue line)composite interval mapping(green line)The red lin

17、e represents the 95%significance levelDH群体 低值极端表型个体 高值极端表型个体 QQ比qq少MM比mm少QQ比qq多MM比mm多DH群体：与QTL连锁的遗传标记的两种基因型的分离比例在高值组和低值组中都会偏离1：1的比例。P1MQMQP2mqmqF1MQmq目标染色体片段代换系的培育一般通过分子标记跟踪选择结合多代回交来进行，其基础是QTL初级定位的准确性，因此只适用于一些效应较大的QTL。目标QTL区域能否找到分子标记是进行精细定位的一个限制因素。受体亲本 供体亲本 受体亲本 F1 分子标记辅助选择代换片段 BCnFn 单片段代换系 单片段代换系（S

18、SSL）文库由许多个单片段代换系组成，每个代换系携带单一的代换片段。图中的细线条表示受体基因组，粗线条表示来自供体的代换片段。华粳籼华粳籼74 BC4F1受体亲本供体亲本受体亲本供体亲本华粳籼华粳籼74 F1华粳籼华粳籼74 BC1F1华粳籼华粳籼74 BC2F1华粳籼华粳籼74 BC3F1SSSLBC4F2SSSLBC5F1 采用回交和分子标记辅助选择相结合的方法选育水稻的单片段代换系。SSSL受体亲本受体亲本单片段代换系单片段代换系通过 t 测验来判别单片段代换系与受体亲本之间的差异显著性，判定有QTL存在。加性效应值（纯合单片段代换系的表型值对照表型值）2加性效应百分率（加性效应值对照表

19、型值）100%QTL的鉴定SSSL与受体亲本之间的差异比较SSSL1SSSL2M1M2M3M4Q1 Q2Q3SSSL1与受体有差异，SSSL2与受体没有差异，Q1；SSSL1与受体没有差异，SSSL2与受体有差异，Q3；SSSL1和SSSL2与受体均有差异，Q2。QTL的鉴定利用重叠SSSL进行替换作图 RM109 RM154 RM279 RM555 W11-15-03-10-07 W11-15-03-10-04-02 W11-15-03-10-02 米粒延伸率（%）72.532.03 3.16E-02 72.050.32 1.80E-03 s P 78.760.80 3.72E-06 CRE

20、-2-1 RM262 RM183 RM6 RM240 W11-06-01-03-09-01 W11-06-01-03-07 W11-06-01-06-03 W11-06-01-06-14-03 米粒延伸率（%）68.782.10 7.98E-01 75.481.72 9.46E-04 s P 79.780.73 1.39E-06 77.121.30 6.06E-05 CRE-2-2 分离群体的建立W27-14-1-2 RM315-RM104 IAPAR9(W27)W27-14-1-2-3Katy(W6)W6-40-48-8 RM472 Chr.1W6-40-48-8-32 供 体02年晚季03

21、年早季QTL的进一步定位：代换系与受体亲本杂交IAPAR9(W27)：W27-14-1-2Katy(W6)：W6-40-48-8 这两个SSSL的株高与受体间有显著差异分子标记分析连锁分析 利用MAPMAKER/EXP Version 3.0 W27-14-1-2-3株系，选用了7个有多态的微卫星标记：RM315，PSM331，PSM423，RM3602，RM3810，RM3482，RM104；W6-40-48-8-32株系，筛选到4个有多态的微卫星标记：RM472，PSM331，PSM423，RM3602 ABA:W27-14-1-2-3群体(197株)B:W6-40-48-8-32群体(2

22、13株)图 分离群体内个体株高的分布分离群体的表现型标记基因型与表型的共分离 连锁分析 RM315PSM331Ph-1-6PSM423RM3602RM3810RM3482RM1049.70.10.14.34.61.32.9ARM472PSM331PSM423Ph-1-6RM36022.60.50.45.6BcM Marker cM Marker水稻1号染色体上的Ph-1-6与分子标记的连锁图A:W27-14-1-2-3群体 B:W6-40-48-8-32群体不同标记基因型的植株高度 QTL的进一步定位：两个相互重叠的代换系间杂交两代换系所带QTL相同，且位于重叠群内，后代不分离两代换系所带QTL不同，分别位于各自特有的区域（非重叠区）重叠群内，后代出现分离进一步缩小QTL位置的区间；研究不同QTL（代换片段间）的相互作用（上位性效应）ab