双向电泳原理与流程课件.ppt

1、1/GE /11/19/2022 万万 翔翔X18675966958 双双 向向 电电 泳泳 技技 术术2/GE /11/19/2022Proteomics“.the analysis of complete complement of proteins.Proteomics includes not only the identification and quantification of proteins,but also the determination of their localization,modifications,interactions,activities,and,ul

2、timately,their function.Stanley Fields,University of Washington,Seattle,in Science 291,1221(2001)3/GE /11/19/2022Proteomics一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome)仅仅从基因组学水平上无法彻底的了解各种生命现象,因为蛋白质才是生命活动的真正执行者 从基因组学上我们无法检测到转录后修饰、翻译调节、选择性剪切、以及蛋白复合物形成、蛋白质相互作用等生命现象;此外并不是细胞内的所有的DNA都翻译转录成蛋白质 4/GE /11/19/202

3、2Proteome Analysis and ProteomicsThe analysis of the entire PROTEin complement expressed by a genOME,or by a cell or tissue type.Wasinger VC et al,Electrophoresis 16(1995)“Proteomics is the study of quantitative changes of expression levels and their application to drug discovery,diagnostics and the

4、rapy.”Two basic technologies:n2-D electrophoresis of complex protein mixturesnIdentification and structure analysis of proteins with mass spectrometry methods5/GE /11/19/2022Why 2DE?Only“Proteomics”is the large-scale screening of the proteins of a cell,organism or biological fluid,a process which re

5、quires stringently controlled steps of sample preparation,2-D electrophoresis,image detection and analysis,spot identification,and database searches.The core technology of proteomics is 2-DE.At present,there is no other technique that is capable of simultaneously resolving in one separation procedur

6、e.6/GE /11/19/2022理论 pI and Mr 图 酵母细胞表达6,216种蛋白11010010002468101214pI(理论值理论值)Mr kDa2DE 工作范围工作范围注注:图片中没有特别强调蛋白丰度和疏水性图片中没有特别强调蛋白丰度和疏水性至今1,484个蛋白被鉴定(Nat.Biotechnol.17,676 and 19,242)From:Wildgruber et al.Electrophoresis 21(2000)2610-2616.7/GE /11/19/20222D 电泳优越性 对未处理样本耐受性好 不需要预纯化(如：色谱层析)分辨率非常高 2D 可以有效的

7、组分收集器 蛋白在凝胶介质中受到保护 在蛋白质组学技术中应用范围最广（front-end）与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白点更多 与后续分析技术兼容性好(如.MDLC)8/GE /11/19/2022蛋白质组学应用举例蛋白质组学应用举例 研究细胞结果功能和分子组成研究细胞结果功能和分子组成 发现新的药物靶位点发现新的药物靶位点 发现新型生物学活性的分子和药物发现新型生物学活性的分子和药物 差异蛋白质组学差异蛋白质组学 发现细菌、病毒感染和疾病监测的分子标志物发现细菌、病毒感染和疾病监测的分子标志物 修饰蛋白质组学修饰蛋白质组学 遗传或药理学扰动的分子解剖遗传或药理学扰动的分子解剖 病

8、理生理学研究病理生理学研究 中药机理中药机理相互作用蛋白质组学相互作用蛋白质组学 研究药物作用方式和毒性机理研究药物作用方式和毒性机理 植物抗虫抗旱抗逆植物抗虫抗旱抗逆遗传育种和分子育种遗传育种和分子育种资源环境资源环境海洋生物海洋生物 9/GE /11/19/2022寻找差异蛋白质环孢素环孢素A处理前处理前环孢素环孢素A处理后处理后正常正常 组织组织肿瘤组织肿瘤组织细胞组织Life Sciences 的历史LKB 电泳发明者Pharmacia 层析技术开创者Amersham Biosciences 提供基因组、蛋白组学研究整体解决方案GE Healthcare Life Sciences 实

9、现从发现到功能研究，从体外到体内的突破 11/GE /11/19/2022GE Healthcare milestones in 2-D electrophoresisLKB introduced Ampholine,the first commercial carrier ampholyteThe first multiple separation system,ISO-DALT,was developedPharmacia Fine Chemicals introduced PharmalyteLKB introduced ImmobilinePharmacia Biotech intro

10、duced Immobiline DryStripPharmacia Biotech introduced ImageMaster suitePharmacia Biotech introduced IPGphorPharmacia Biotech launched DALT II systemAmersham Pharmacia Biotech launched Typhoon Amersham Biosciences launched Ettan DIGE The Multiphor flatbed electrophoresis unit is launched.In productio

11、n for 30 years in 2003!1967197819791982199119931998200020002002197312/GE /11/19/202213/GE /11/19/2022Image analysisImage acquisitionAutomated spot pickingSpot digestionMALDI target spottingLWS Laboratory workflow systemMALDI-ToFProtein SeparationProteomics 2DE WorkflowSample PrepSample labeling14/GE

12、 /11/19/2022 小鼠肝脏蛋白提取物2D凝胶电泳2-D electrophoresis gelfrom Prof.Dr.A.Grg,Technical University Munich,Germany15/GE /11/19/20222D/MS 经典工作流程细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量差异分析双向电泳第一向第二向图像获取图谱分析银染 考染荧光 蛋白标记样品制备分离染色图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞16/GE /11/19/2022样品制备 细胞破碎 蛋白沉淀 溶解 抑制蛋白酶活性 去除-核酸-脂类-盐，缓冲液，离子性小分子-不溶性物质17/GE /11/19/

13、20222D/MS 经典工作流程差异分析图像获取图谱分析银染 考染荧光 蛋白标记染色图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞Separation双向电泳第一向第二向细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备18/GE /11/19/2022Principle of 2-D Electrophoresis1.First dimension:denaturing isoelectric focusingseparation according to the isoelectric point2.Second dimension:SDS electrophoresisseparation a

14、ccording to the molecular weight 2-D electrophoresis resolves a few thousand protein spots.19/GE /11/19/2022等电聚焦电泳原理等电聚焦电泳原理蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。20/GE /11/19/2022 等电聚焦（IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质，从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。等电聚焦电泳原理等电

15、聚焦电泳原理21/GE /11/19/2022双向电泳：传统方法sample胶在SDS 缓冲液中平衡Principle according to P.H.OFarrell and J.Klose(1975)pH 10pH 10pH 3pH 3垂直胶管中进行等电聚焦 urea,NP-40一向一向:二向二向:SDS 丙烯酰胺凝胶电泳非连续梯度胶按等电点分离（电荷）按分子量分离（质量）22/GE /11/19/2022使用载体两性电解质IEF时存在的问题 不同批次载体两性电解质的重现性 载体两性电解质梯度不稳定 蛋白载量有限 重现性差导致梯度漂移 梯度漂移导致酸性和碱性蛋白质丢失 管胶柔软，尺寸不定

16、 操作者个人技术影响结果23/GE /11/19/2022固相凝胶固相凝胶(支持膜上0.5 mm 厚凝胶)丙烯酰胺缓冲液:Immobiline CH2=CH-CO-NH-R,R：羧基或叔胺基固相 pH梯度(IPG)24/GE /11/19/2022Immobiline 干胶条的特性 可重复性 无梯度漂移,真正的平衡方法 可分离酸性和碱性蛋白 容纳蛋白样本量更多 水平和垂直 SDS 凝胶中都能使用 允许样本水化上样 机械强度和尺寸稳定 易操作 易于对样本跟踪标记25/GE /11/19/2022新pH范围的 Immobiline 干胶条高分辨率的 IPG 胶条，联合使用DeStreak试剂,能改

17、善极碱性区域蛋白点结果。归功于独特的试剂。使用pH范围相互重叠的干胶条，可提高2-D 图谱 分析效率!新pH范围:Immobiline DryStrip pH 3 5.6 NLImmobiline DryStrip pH 5.3 6.5Immobiline DryStrip pH 6.2 7.5Immobiline DryStrip pH 7 11 NLImmobiline DryStrip pH 3 11 NL26/GE /11/19/2022不同pH范围胶条 不同长度、多种窄不同长度、多种窄pH范围胶条可选，尤其是范围胶条可选，尤其是1个个pH范围范围 pH7-11NL碱性胶条碱性胶条27

18、/GE /11/19/2022宽pH、窄 pH 范围胶条宽宽pH梯度胶条应用:整个蛋白图谱窄窄 pH梯度胶条应用:提高分辨率增加样品上样量检测分析更多蛋白pH 3 4 5 6 7 8 9 1045678928/GE /11/19/2022提高分辨率:斑点显现IPG 4-7IPG 5-6IPG 4-7IPG 5.5-6.7Mouse liver proteinsFrom A.Grg et al.(1999)29/GE /11/19/2022不同长度的胶条7 cm 11 cm 13 cm 18 cm24cm30/GE /11/19/2022线形与非线形胶条for most samples Cell

19、 lysates Tissue extractslinear(L)nonlinear(NL)for samples with abundant proteins in the range between pH 5 and 7Serum proteins31/GE /11/19/2022pH 3-10 L and NLfrom Prof.Angelika Grg,Technical University MunichTissue Proteins from Mouse Liverlinear(L)nonlinear(NL)32/GE /11/19/2022The IPGphor Platform

20、33/GE /11/19/2022IPG 胶条胶条 水化水化34/GE /11/19/2022IPG strip rehydration如果水化时加入样品，此体积是加入样品后的终体积35/GE /11/19/2022加样品到胶条槽36/GE /11/19/2022泡涨盘 VS 聚焦盘37/GE /11/19/2022干胶条的水化主动水化：胶条槽内进行，大分子蛋白更容易进入胶条；30120V，1024Hrs被动水化：专用水化盒中进行NEW！无需覆盖油！避免灰尘污染，空气作用不透明盖子，适用于CyDye DIGE标记同时适用于市场上所有724cm干胶条的水化38/GE /11/19/2022在样品

21、杯中加入少量不含样品的水化液检查是否漏液。上样前吸走水化液。上样前将样品离心去掉不溶物，每个样品杯最多可加样150l。盖上胶条槽的盖子，再盖IPGphor 仪器的盖子。分别将两个IEF 电极片放在IPG 胶条胶的两端，分别将电极压在两个电极片的外缘。样品杯可放在两个电极间除胶条槽内侧凸起外任何位置，对于碱性分离范围的IPG 胶条，尽量将样品杯靠近阳极放置.杯上样杯上样&纸桥上样纸桥上样39/GE /11/19/2022IEF电泳IPGphor 包括半导体温控系统(20C)和程序化电源(10000V)可同时进行12根胶条的等电聚焦聚焦效果以“Vh”数控制，可提高重复性40/GE /11/19/2

22、022IPG 胶条的平衡两步平衡 SDS 电泳前电泳前,平衡母液平衡母液:2%SDS,50mM Tris-HCl pH 8.8,6M urea,30%glycerol+蛋白与蛋白与SDS结合结合 甘油和尿素降低电内渗作用甘油和尿素降低电内渗作用 第一步第一步DTT平衡平衡：(1 x 15min)1%DTT 第二步第二步碘乙酰胺平衡碘乙酰胺平衡：去除多余的：去除多余的 DTT，防止拖尾防止拖尾 (1 x 15min)2.5%iodoacetamide41/GE /11/19/2022第二向垂直电泳系统 琼脂糖覆盖密封 放置 IPG strip低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖42/GE /11/19/20

23、22Push the IPG Strip Down onto the Gel Surface43/GE /11/19/2022Seal the Cassette and Fix the IPG Strip with Agarose44/GE /11/19/2022Inserting the Cassette45/GE /11/19/2022SDS-PAGE 参数46/GE /11/19/2022SE600ruby47/GE /11/19/2022Ettan DALTsix48/GE /11/19/2022Ettan DALTtwelve system49/GE /11/19/2022第二向系统

24、stripgelnumber running length(cm)size(cm)of gelstime(hr)Ettan Dalt1218,2425 x 20124.5Ettan Dalt618,2425 x 20 64.5SE 6002 x 7,1314 x 16(24)44MiniVE 78 x 7,8 x10 21.5Multiphor II7,1124 x 11*11.51824 x 18 13.3PhastSystem(4)*4 x 4 20.5*2 or 3 strips side-by-side*cut or home-made strip50/GE /11/19/20222D

25、/MS 经典工作流程差异分析图像获取图谱分析蛋白标记图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞分离细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备双向电泳第一向第二向银染 考染荧光染色51/GE /11/19/2022Protein Detection Methods Sensitivity limit Quantitation Living cells Linear Dynamic Range Coomassie Blue staining 100 ng+no 3 Negative staining 15 ng+no 3 Silver staining 200 pg+no 7 Fluores

26、cent staining 400 pg+no 104 Fluorescent labelling 250 pg+no 104 Radioactive labeling:X-ray film 1 pg+yes 20 Phospor-imager plates 0.2 pg+yes 105 Stable isotope labelling 1 pg+(with MS)yes?52/GE /11/19/2022Coomassie Blue-考马斯亮蓝染色+灵敏度灵敏度，低至低至0.01 m mg(“胶体胶体”考染考染)+非特异性染色非特异性染色+染料与蛋白成比例结合染料与蛋白成比例结合+线性化好线

27、性化好-扩散速度受限，胶的厚度影响跑胶速度扩散速度受限，胶的厚度影响跑胶速度-纯度不够纯度不够-有限的动力学范围有限的动力学范围53/GE /11/19/2022 胶体考马斯亮蓝染色1 mg E.coli strain BIPGphor 24 cm pH 4-7Colloidal CBBG250 staining54/GE /11/19/2022银染+灵敏度，低至0.2 ng+在凝胶基质中与蛋白交联+自动催化反应-染凝胶表面蛋白-线性化程度比考染低-一些大分子物质也被染色-步骤多，某些步骤时间控制严格55/GE /11/19/2022Silver stained gel of E.coli L

28、ysate IPG 4-7Silver stainedwith PlusOneKitwithout glutaraldehydeand formaldehydein the Ag sol.56/GE /11/19/20222D/MS 经典工作流程差异分析蛋白标记挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞分离细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备双向电泳第一向第二向图像获取图谱分析银染 考染荧光染色图谱分析57/GE /11/19/2022ImageScanner III图像扫描系统灰度校正功能平台具有防水功能，可直接扫描SDS-PAGE湿胶。3.7OD高动态范围，保证高、低丰度蛋白的准确定量

29、。扫描平台大，A3扫描面积，一次可扫描2块24cm凝胶。Gray 256 scaleTransmissive300dpi58/GE /11/19/2022由SIB,GeneBio和GE Healthcare合作开发，为SwissProt推荐分析软件。高效能参数自动找点，全自动蛋白定量计算方法，不受背景影响。在原始数据上进行分析，结果可靠。界面窗口可随意设计，界面极其友好。全自动凝胶匹配，采用先进的算法。根据点的相关因素、形状、位置、周围情况，胶间匹配效率高。多种统计学分析工具，快速找到胶间蛋白表达差异。可直接链接到ExPASy 和 SwissProt 数据库，进行网上检索。全部操作过程都可以撤

30、销/重作操作，每一步骤都附有说明，使用方便。全面支持DIGE技术，源自DeCyder 2D软件。ImageMaster 2D双向电泳分析软件ImageMaster Platinum 7.0 软件分析流程60/GE /11/19/20222D/MS 经典工作流程差异分析蛋白标记蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞分离细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备双向电泳第一向第二向图像获取图谱分析银染 考染荧光染色挖胶图谱分析61/GE /11/19/202262/GE /11/19/2022自动斑点切取Spot picker切点针头胶盘MALDI-ToF质谱分析标记荧光全自动软件分析自动切点图像采集双向电

31、泳分离自动酶解蛋白质组学完整平台蛋白质组学完整平台样品制备蛋白纯化蛋白质组学完整平台64/GE /11/19/2022经典 2D 工作流:产品范围 Grinding kit2-D Clean-Up kitMini dialysis kits2-D Quant kit2-D Fractionation kitAlbumin&IgG removal kitEttan IPGphor Immobiline DryStripEttan DALTtwelveEttan DALTsixDALT gel 12.5ImageMaster DeCyder 2D蛋白标记样品制备分离染色图谱分析挖点酶解点靶体液植物微生物组织细胞Ettan Spot PickerEttan DigesterEttan SpotterEttan Spot Handling WorkstationDeep Purple Total Protein StainPlusOne Silver Staining Kit,proteinCyDye DIGE Fluors65/GE /11/19/2022Thank you!Any Questions.