实验2：分离以尿素为氮源的微生物课件.ppt

1、l 尿素是蛋白质降解的产物，通常用作植物的尿素是蛋白质降解的产物，通常用作植物的氮肥氮肥。但是。但是植物的根几乎不吸收尿素，植物的根几乎不吸收尿素，尿素尿素经微生物经微生物(脲酶脲酶)分分解为解为氨氨,氨溶解于水中成为氨溶解于水中成为铵根离子铵根离子而被植物吸收。而被植物吸收。一、基础知识一、基础知识1、尿素尿素(脲脲)：l 大量尿素的存在会对环境造成大量尿素的存在会对环境造成污染污染，如土壤板结、肥料，如土壤板结、肥料利用率下降、地下水污染等。利用率下降、地下水污染等。例如：例如：2、选择培养基：选择培养基：添加添加或或减少减少某种成分，以某种成分，以允许某种微生物生长允许某种微生物生长，同

2、时同时抑制或阻止其他种类微生物生长抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。的培养基。培养基中培养基中缺乏有机碳源缺乏有机碳源时可筛选出时可筛选出自养型自养型微生物微生物只只以以尿素为氮源尿素为氮源的的培养基可筛选出培养基可筛选出含脲酶含脲酶的微生物的微生物一、基础知识一、基础知识3、玻璃砂漏斗：玻璃砂漏斗：l 玻璃砂玻璃砂(砂芯砂芯)漏斗漏斗有有6种：种：G1G6(砂芯含有不同规格砂芯含有不同规格 小孔小孔)。G6孔径最小，细菌不能孔径最小，细菌不能 滤过。滤过。l 若培养基中含有若培养基中含有不不能能加热加热灭菌灭菌的化合物的化合物，如，如尿素尿素(加热加热会会 分解分解)等，只能用等，只能用

3、G6玻璃砂漏斗过滤玻璃砂漏斗过滤来除来除去去微生物。微生物。l 玻璃砂漏斗玻璃砂漏斗用前用前也要进行也要进行高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌(121，15min)。用后用后需需用用1mol/L的的HCl浸泡浸泡，并抽滤去酸，并抽滤去酸，再用再用蒸馏水洗蒸馏水洗 至洗出液呈中性至洗出液呈中性，干燥，干燥后保存。后保存。体积调节按纽体积调节按纽吸头脱卸按纽吸头脱卸按纽容量显示窗容量显示窗吸头吸头(枪头枪头)套筒套筒弹性吸嘴弹性吸嘴一、基础知识一、基础知识4、移液器：移液器：移液器是一种在一定容量范围内可随意调节的移液器是一种在一定容量范围内可随意调节的精精密取液装置密取液装置（俗称移液枪）。（俗称移液枪）

4、。（1 1）结构：）结构：（2 2）使用方法使用方法：n 根据取用溶液体积根据取用溶液体积选用适当选用适当 的移液器的移液器n 操作方法：操作方法：设定体积设定体积安装吸头安装吸头 吸吸 液液 放放 液液卸掉吸头卸掉吸头从大值调整到小值时，从大值调整到小值时，逆时针逆时针旋转体积调节按纽旋转体积调节按纽到到刚好即可。刚好即可。从小值调整到大值时，从小值调整到大值时，应应顺时针顺时针先先调调至至超过超过设定设定值值后再后再回回调调。设定体积设定体积安装吸头安装吸头将移液器顶端将移液器顶端垂直插入吸头垂直插入吸头，再再轻轻用力下压轻轻用力下压的的同时，同时，左右微微转动左右微微转动，上紧即可。，上

5、紧即可。切记用力不能过猛切记用力不能过猛，选择与移液器匹配的吸头。，选择与移液器匹配的吸头。吸吸 液液1、预洗吸头：预洗吸头：吸取、排放样液吸取、排放样液23次次，让吸头内壁形成一让吸头内壁形成一道道 同质液膜，确保移液工作的精度和准度同质液膜，确保移液工作的精度和准度。一般液体，一般液体，正向吸液正向吸液(将按钮按到将按钮按到第一档第一档释释放吸液放吸液)粘稠液体和易挥发液粘稠液体和易挥发液体，体，反相吸液反相吸液(将按钮将按钮直接按到直接按到第二档第二档吸液吸液)2、垂直吸液垂直吸液、慢吸慢放、慢吸慢放：吸头吸头垂直垂直浸入液面浸入液面2-4mm。尽量避。尽量避 免吸头浸入液面过深，以免液

6、压对吸液的精确度造成影响。免吸头浸入液面过深，以免液压对吸液的精确度造成影响。吸液速度切记吸液速度切记不能过快不能过快，以免导致液体吸入移液器内部。，以免导致液体吸入移液器内部。将移液枪提离液面将移液枪提离液面需需停约停约13秒秒，观，观察是否有液滴缓慢的流察是否有液滴缓慢的流出。若有流出，说明有漏气现象出。若有流出，说明有漏气现象。放放 液液吸头吸头紧贴容器壁紧贴容器壁放液。放液。按钮要待液体按钮要待液体完全打出后完全打出后再放松。再放松。正向：正向：先将按钮按至第一先将按钮按至第一档档，略作停顿以后，再按至第二，略作停顿以后，再按至第二 档档，这样做可以确保吸液头内无残留液体。，这样做可以

7、确保吸液头内无残留液体。反向：反向：轻按按钮至第轻按按钮至第一档一档，排出液体。继续按住按钮，将，排出液体。继续按住按钮，将 留在吸留在吸头头中的多余液体返回原来容器或随吸头丢弃中的多余液体返回原来容器或随吸头丢弃。卸掉吸头卸掉吸头 一般用力一般用力下按吸头脱卸按纽下按吸头脱卸按纽即可卸掉吸头。即可卸掉吸头。将吸头丢弃到废物收集器中。将吸头丢弃到废物收集器中。移液器移液器如不使用，将如不使用，将刻度刻度调到调到最大量程最大量程，使使弹簧弹簧 恢复原形，延长移液器的使用寿命。恢复原形，延长移液器的使用寿命。（一）实验目的：（一）实验目的：1、使用使用专一的培养基专一的培养基（尿素为惟一氮源尿素为

8、惟一氮源）分离分离专专一的细菌（一的细菌（有脲酶的细菌有脲酶的细菌）。）。2、使用、使用指示剂指示剂（酚红酚红）颜色的变化检知）颜色的变化检知酶酶（脲酶脲酶）所催化的反应。所催化的反应。l 用用尿素固体培养基尿素固体培养基从土壤中分离从土壤中分离出能利用尿素的细菌出能利用尿素的细菌，观察菌落数；并以，观察菌落数；并以LB全营养固全营养固体培养基体培养基为为对照对照，观察全营养培养基上的菌落数。，观察全营养培养基上的菌落数。二、实验内容二、实验内容比较两者的比较两者的菌落数菌落数，可知，可知能利用尿素的细菌在土壤能利用尿素的细菌在土壤菌菌群群中中所所占占的比例的比例（二）实验原理：（二）实验原理

9、：在土壤中，存在一些细菌，它们含有在土壤中，存在一些细菌，它们含有脲酶脲酶，能能分分解解尿尿素素(脲脲)作为其生长的作为其生长的氮源氮源(NH3)1.利用利用尿素培养基尿素培养基(以尿素为以尿素为惟一氮源惟一氮源的的选择培养选择培养基基)，分离分离出出土壤中土壤中含脲酶的细菌含脲酶的细菌。2CO32NH2OH+脲酶脲酶22)(ONH=C二、实验内容二、实验内容2.细菌合成的细菌合成的脲酶脲酶能将能将尿素分解成尿素分解成NH3，致使，致使PH升高，使升高，使酚红指示剂变红酚红指示剂变红。二、实验内容二、实验内容（三）设备及用品（三）设备及用品：略略（四）材料（四）材料2 2、全营养、全营养LBL

10、B固体培养基：固体培养基：蛋白胨、酵母提取物、蛋白胨、酵母提取物、NaCl、琼脂糖琼脂糖、水。、水。3 3、尿素固体培养基：、尿素固体培养基：葡萄糖、葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红酚红、琼脂糖琼脂糖、水、水、尿素尿素。1 1、100mL100mL烧杯：烧杯：装有装有50mL70%酒精，浸泡着玻璃刮刀酒精，浸泡着玻璃刮刀6 6、土样：、土样：从有从有哺乳动物排泄物哺乳动物排泄物的地方取（的地方取（粪便中含尿素，粪便中含尿素，利于含脲酶的微生物生长利于含脲酶的微生物生长）4 4、5 5支有塞试管：支有塞试管：盛有盛有4.5mL蒸馏水蒸馏水5 5、250mL250mL三角瓶：三角瓶：盛有盛有9

11、0mL蒸馏水蒸馏水 起对照作用。起对照作用。土壤中含有多种细菌，土壤中含有多种细菌，在在全营养全营养LB培养培养基中，多数细菌都能生长基中，多数细菌都能生长；而在仅以尿素为氮源的培养基而在仅以尿素为氮源的培养基中，只有含有脲酶的微生物才能生长。中，只有含有脲酶的微生物才能生长。琼脂琼脂是末被纯化的混合物，内是末被纯化的混合物，内含有一定量的含氮化合含有一定量的含氮化合物。物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生大量以非尿素素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮

12、源的细菌的筛选。为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。酚红为酸碱指示剂，酚红为酸碱指示剂，在酸性环境呈黄色，在碱性环境在酸性环境呈黄色，在碱性环境呈红色。通过酚红的颜色变化，呈红色。通过酚红的颜色变化，可检测培养基中可检测培养基中pH的的变变化化。注意：注意：取样时尽量只取取样时尽量只取悬液悬液。称量称量溶化溶化调调PH分装分装加塞封口加塞封口包扎包扎灭菌灭菌二、实验内容二、实验内容（五）（五）实验步骤实验步骤：1 1、配制培养基并灭菌、配制培养基并灭菌2 2、倒平板、倒平板3 3、制备细菌悬液、制备细菌悬液4 4、用涂布分离法分离细菌、用涂布分离法分离细菌5 5、细菌培养、细菌培养6

13、 6、观察、对比、观察、对比全营养全营养LB固固体培养基和体培养基和尿素固尿素固体培养体培养基基(除尿素外除尿素外)均均进进行行高压蒸汽高压蒸汽灭菌灭菌；尿素尿素固体固体培养基培养基待待冷却到冷却到60，加入，加入用用G6玻璃漏斗过玻璃漏斗过滤滤的的尿素溶液。尿素溶液。用用10-4和和10-5的土壤稀释液的土壤稀释液各浓度均做各浓度均做三个三个培养皿培养皿培养基培养基倒置倒置培养，培养，37 2448h。实验组与对照组实验组与对照组菌落数菌落数制成制成10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀释液土壤稀释液二、实验内容二、实验内容（六）（六）实验结果实验结果：1010-4-4、1010-5-

14、5土壤稀释液土壤稀释液尿素培养基上涂布结果尿素培养基上涂布结果1010-4-4、1010-5-5土壤稀释液土壤稀释液全营养全营养LBLB培养基上涂布结果培养基上涂布结果 这说这说明能利用尿素的细明能利用尿素的细菌在土壤菌在土壤菌群菌群中只占少数。中只占少数。因为人和其他哺乳动物产生因为人和其他哺乳动物产生的排泄物毕竟是少量的，的排泄物毕竟是少量的，且且尿素还可以在高温下自然分尿素还可以在高温下自然分解，因此解，因此，以，以尿素为氮源的尿素为氮源的菌群较少。菌群较少。土壤土壤中中大量尿素的存在会对环境造成污染，如土壤板大量尿素的存在会对环境造成污染，如土壤板结、肥料利用率下降、地下水污染等。结、

15、肥料利用率下降、地下水污染等。有脲酶有脲酶的细菌能的细菌能分解分解尿素尿素，并利用所形成的氨，有利，并利用所形成的氨，有利于自然界中的氮循环。于自然界中的氮循环。有脲酶的有脲酶的细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素(中中性性)分解产生氨分解产生氨(碱性碱性)，导致培养基中酚红指示剂导致培养基中酚红指示剂变为变为红色。红色。培养基中酸碱指示剂产生颜色变化培养基中酸碱指示剂产生颜色变化(变红变红)，标志着标志着存在存在脲脲酶分解尿素的作用，从而证明该菌株可以以尿素为氮源。酶分解尿素的作用，从而证明该菌株可以以尿素为氮源。红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。大肠杆菌大肠杆菌培养和分离培养和分离划线划线分离分离法法从从同种菌种同种菌种中分中分离得到同种菌的离得到同种菌的单菌落单菌落 在划线的末端在划线的末端出现大肠杆菌出现大肠杆菌单菌落单菌落 分离以尿素分离以尿素为氮源的微为氮源的微生物生物 涂布涂布分离分离法法从土壤浸出液里从土壤浸出液里所存在的所存在的各种细各种细菌菌中将中将含有脲酶含有脲酶的细菌的细菌分离出来分离出来 只出现含有脲只出现含有脲酶的细菌菌落酶的细菌菌落