食品类微生物实验课件.ppt

1、实验1 显微镜的使用 一、实验目的和内容 目的：学习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。内容：1学习油浸系物镜的使用方法。2用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。二、实验材料和用具 枯草芽孢杆菌（Bacillus subitilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的染色装片。香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。三 显微镜的构造与成像原理 （一）显微镜的构造包括机械部分和光学部分 1机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、移动器、粗调器和细调器。（1）镜座和镜臂 它们是显微镜的基本骨架，起稳固和支持显微

2、镜的作用。（2）镜筒 镜筒上接目镜，下接转换器，形成目镜与物镜（装在转换器下）间的暗室。（3）物镜转换器 物镜转换器上可安装3-4个物镜，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。（4）载物台用于安放玻片。载物台中有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。（5）推动器是移动标本的机械装置。（6）调焦装置即粗螺旋和细螺旋，是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件。2光学部分：目镜、物镜、聚光器、光圈、反光镜。显微镜的光学系统（l）反光镜由一平面和另一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射

3、到聚光器透镜的中央，照明标本。（2）聚光器 在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到照明，使物象获得明亮清晰的效果。（3）物镜 物镜的种类很多，可从不同角度来分类：根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：干燥系物镜以空气为介质，如常用的40X以下的物镜，数值孔径均小于1。油浸系物镜常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为90 X-100 X，数值孔径值N.A大于1。根据物镜放大率的高低，可分为：低倍物镜指l0X以下；中倍物镜指20X；高倍物镜指40X-65X；油浸物镜指90X以上。（4）目镜 目镜的作用是把物镜

4、放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目透镜”，下端的透镜称“聚透镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”。（二）显微镜的成像原理 显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。由单透镜组合而成的透镜组相当于一个凸透镜，放大作用更好。显微镜的结构 光线在穿过折射率不同的介质时发生折射。（三）显微镜的性能 显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高，而且清晰，物体放大后，能否呈现清晰的细微结构，首先取决于物镜的性能，其次为目镜和聚光镜的性能。油镜

5、头的辨认 油镜头上常刻有OI（oil immersion）或HI（homogeneneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，在低倍物镜、高倍物镜和油镜3物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numerical aperture）最大，而工作距离最短。四、操作步骤（一）观察前的准备 1放置：将显微镜置于平稳实验台上，镜座距实验台边沿约为10cm。坐正，练习用左眼观察。2调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染

6、色装片时，光线宜强；观察未染色装片时，光线不宜太强。（二）低倍镜观察染色装片 首先上升镜筒，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升（或使镜台下降）至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。（三）高倍镜观察 眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相撞。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜

7、观察。（四）油镜观察 1提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位（镜头的正下方）滴一滴香柏油。2从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。3将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升（切忌反方向旋转），当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。4再次观察 提起镜筒，换上金黄色葡萄球菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。（五）镜检完

8、毕后的工作 1移开物镜镜头。2取出装片。3清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。4擦净显微镜，将各部分还原。将接物镜呈“八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。四、注意事项 1使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察 2下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。3使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。4注意保持显微镜的

9、洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。实验2 细菌的染色与观察一 目的要求 1了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。2初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。3观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征。学会初步鉴别微生物的种类的方法。二 实验内容与原理 1简单染色法原理 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色

10、。美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。简单染色过程：涂片固定染色水洗干燥镜检 2革兰氏染色法原理 革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G ）两大类。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁结构的比较 革兰氏染色过程：涂片固定结晶紫初染（1min）碘液媒染（1min）乙醇脱色（95%酒精，30s）番红复染（30 秒）干燥镜检 阳性菌：紫色 阴性菌：红色 革兰氏染

11、色要点：1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。3）脱色：连续滴加 95乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。（关键）4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。5）干燥。6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。3芽孢染色原理 细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。操作方法：1）用枯草杆菌涂片、干

12、燥、固定。2）在涂菌处滴加 5的孔雀绿染液，用木夹夹住玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但不沸腾 56分钟。加热时应添加染料，以免蒸干。水洗。3）0.5番红复染 1 分钟，水洗，烘干，镜检（芽孢绿色，菌体红色）。4荚膜染色原理 荚膜与染料亲和力低。在用简单染色法时，可以辨认出来。而通过荚膜染色也可以把它和细胞区别开来。操作方法：1）涂片，晾干。2）用 Tyier 氏醋酸结晶紫溶液染色 2 分钟，再用 20%硫酸铜溶液洗涤，水洗，用滤纸吸干、干燥。3）镜检：荚膜染成浅红色，细胞呈紫红色。5鞭毛染色法原理 细菌鞭毛直径为 10-12nm，超过了光学显微镜的分辨能力。所以染色时，不仅要使鞭毛染色，还要使

13、一部分染料堆积在鞭毛上，加粗鞭毛的直径以便能观察。鞭毛染色的方法很多，但染色成功的关键一是必须使用新鲜培养、活动活泼的菌体进行染色；二是使用绝对无油的干净玻片，以便菌液流过玻片时能保持自然形态。细菌的运动性，可通过悬滴法制片观察。注意区分布朗运动和细菌本身的运动。操作方法：1）载片的制备：经过严格清洗后，置于95%乙醇中浸泡，用时才取出，用火焰烧去酒精，立即使用。2）菌种的制备：取已活化 3-5 代的变形杆菌（或枯草杆菌）接种于新制备的肉汤琼脂斜面，斜面下部最好有冷凝水，培养 8-9h 即可使用。3）制片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，挑取少许菌苔底部有水部分的菌体，将接种环悬放在水滴中片刻，再

14、将载片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，放平，晾干。4）染色：滴加鞭毛染色液 A，3-5分钟，小心水洗干净，然后滴加鞭毛染色液B，30-60 秒，水洗，晾干。A液：a.5%石炭酸 10 ml b.鞣酸 2 g c.饱和硫酸钾铝 10 mlB液：结晶紫酒精饱和溶液。应用液：A液10份，B液1份，混合过滤后室温存放。试剂配制说明：A液：又称媒染剂，其中的石炭酸又名苯酚，配制5%石炭酸：将5g石炭酸溶于100ml蒸馏水中，加温有助于试剂溶解。鞣酸又名单宁酸，具有沉淀蛋白质的作用，在媒染过程中起到重要作用。配制饱和硫酸钾铝：将25g明矾溶于100ml蒸馏水中，加温有助于明矾的溶解。a、b、c三种试剂

15、混合后需加温，有助于其中的鞣酸溶解。B液：又称染色剂，饱和结晶紫酒精溶液的配制：12g结晶紫溶于100 ml 无水乙醇中。应用液的A液和B液混合后需加热溶解，因鞣酸为胶状物，常温下不易溶解。A染液和B染液混合后需用0.2M的滤膜或较厚的过滤纸过滤，放置12天后染色的效果较好。5）镜检：菌体、鞭毛均为褐色。悬滴法：1）在盖玻片上滴小半滴无菌水。2）以无菌操作挑菌，接种环在水上轻点几下。3）将盖玻片迅速翻转置于凹玻片上即可观察。6.菌落特征的观察 注意细菌落形状、大小、颜色、光泽、透明度、干燥或湿润、粘稠度、隆起情况、边缘状况等。实验3 酵母菌的形态观察 一 目的要求 1.观察酵母菌的个体形态及出

16、芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。2.掌握酵母菌的菌落特征及其与细菌菌落的区别。二 实验原理 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，多数是圆形或椭圆形，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。用美蓝对酵母菌的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。三 实验材料 （1）菌种：啤酒酵母、面包酵母、裂殖酵母、热带假丝酵母。（2）0.1%的美蓝染色液，芽孢染色液、无菌水、盖玻片、载玻片。四 内容与步

17、骤 1菌落特征和菌苔特征的观察。观察菌落表面干燥或湿润、隆起形状、边缘整齐度、大小、颜色等，并用接种环挑菌，注意与培养基结合是否紧密。取斜面培养的啤酒酵母、面包酵母、热带假丝酵母观察菌苔特征。2个体形态与出芽生殖：采用水浸片法。即在载玻片上加一滴 0.1%美蓝染液（或一滴蒸馏水），挑取少许啤酒酵母与染液混匀，将盖片斜置，慢慢放下，以免产生气泡，用滤纸片吸取多余是水分，即可观察酵母菌的形态和出芽方式。实验3 霉菌的形态观察 一 目的要求 1学会识别霉菌的菌落特征，掌握霉菌的乳酸石炭酸制片法。2学习观察霉菌个体形态及各种无性孢子的方法。二 实验原理 霉菌形态比细菌、放线菌复杂，个体比较大，具有分支

18、的菌丝体和分化的繁殖器官。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。因此，在观察时要注意菌丝直径大小，菌丝体有无隔膜，营养菌丝有无假根，无性繁殖形成的孢子是那一种？孢子是怎样着生的？三 实验材料 1菌种：毛霉、黑根霉、青霉、黑曲霉。2乳酸石炭酸溶液、乳酸石炭酸棉蓝溶液，接种钩，接种铲。四 实验内容（一）落特征的观察 用肉眼观察生长在 PDA 琼脂平板上的各种霉菌菌落，并根据下列要求对每种霉菌的菌落特征加以描述。1.菌落的大小：局限生长或蔓延生长，菌落的直径和高度。2.菌落的颜色：正面和背面的颜色，培养基的颜色变化。3.菌落的形态：棉絮状、网状、疏松或紧密、同心轮

19、纹、放线状的皱褶等。（二）霉菌个体形态的观察 1乳酸石炭酸制片法观察：由于霉菌的菌丝较粗大，而且孢子容易飞散，如将菌体置于水中容易变形，故观察时不用水浸片法制片，而将其置于乳酸石炭酸溶液中，使细胞不易干燥，并有杀菌作用，有时为了增加反差在乳酸石炭酸溶液里溶入棉蓝制成乳酸石炭酸棉蓝染液。步骤：在干净的载玻片上加一滴乳酸石炭酸，用接种针从菌落边缘处取小量带有孢子的菌丝置于液体中，再小心地把菌丝放开，然后用盖玻片盖上，注意不要产生气泡。2插片培养观察 方法：将已灭菌的盖玻片斜插入培养基平板上，一半露在外面，然后沿盖玻片与培养基交接处接种霉菌孢子悬液。2426恒温培养 24 天。然后，乳酸石炭酸制片、

20、镜检观察。注意事项 制片时，应用接种铲取菌落边缘处带有孢子的菌丝。取的菌丝或者孢子要少，如果铲太多，反而不易观察。标本片制好后，先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。实验4 培养基的配制 一、实验目的和内容 目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。内容：MRS培养基的配制。二、实验材料和用具 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。（3）MRS培养基的制备 MRS培养基是一种应用最广泛和最普通的乳酸菌基础培养基。其配方如下：酪蛋白胨 10.0克 牛肉膏10.0克 酵母膏 5.0克 葡萄糖 5.0克 乙酸钠 5.0

21、克 柠檬酸三胺 2.0克 吐温 80 1.0克 磷酸氢二钾 2.0克 七水硫酸镁 0.2克 七水硫酸锰 0.05克 碳酸钙 20.0克 琼脂 20.0克(进口的15克)蒸馏水 1.0升 pH6.8 1称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏、酵母膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，

22、再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。3 调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用lmol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。5分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的l/5

23、，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。6加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。7包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、

24、组别、日期。8灭菌 将上述培养基于121.3湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应故人冰箱内暂存。9摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2。10无菌检查 将灭菌的培养基放入37温箱中培养2448h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。消毒与灭菌 一、干热灭菌（一）目的要求 1了解干热灭菌的原理和应用范围。2学习干热灭菌的操作技术。（二）基本原理 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋

25、凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160170），时间要长（12h），但干热灭菌温度不能超过180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。（三）器材 培养皿、试管、吸管、电烘箱等。（四）操作步骤1装入待灭菌物品将包好的待灭菌物品（培养皿、试管，吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。2升温接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至100时，关闭排气孔。直到所需的160170温度。3恒温当温度升达到160170时，

26、恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度2h。干热火菌过程。严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。4降温切断电源、自然降温。5开箱取物待电烘箱内温度降到70以下后，打开箱门，取出灭菌物品。电烘箱内温度末降到70，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。二 高压蒸气灭菌（一）目的要求1了解高压蒸气灭菌的基本原理及应用范围。2学习高压蒸气灭菌的操作方法。（二）基本原理高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸

27、点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表21），二是湿热的穿透力比干热大（表22），三是湿热的蒸气有潜热存在。1g水在100时，由气态变为液态时可放出2.26kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。表21 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系 在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度

28、低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见（表23）表2-2 干热温热穿透力及灭菌效果比较 表23 灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系 现在法定压力单位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其换算关系为：1kg/cm2=98066.5Pa；一般培养基用0.1Mpa（相当于1.05kg/cm2），121.3，1530min可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.06Mpa（0.59kg/cm2）112.6灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以0.1Mpa，

29、121.5灭菌20min即可，而盛于大瓶内的培养基最好以0.1Mpa，122灭菌30min。实验中常用的非自控高压蒸气灭菌锅有卧式和手提式二种，其结构和工作原理相同，（三）器材 牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿（6套一包），手提式高压蒸气灭菌锅等。（四）操作步骤 1首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。2放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。3加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两

30、对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.5，20min灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。5灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力

31、突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。6将取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入37温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。三、紫外线灭菌（一）目的要求了解紫外线灭菌的原理和方法（二）基本原理紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成O，再使O2氧化生成

32、臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2）。O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以前；可在无菌室内（或接种箱内）喷洒3%5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用2%3%的来苏尔擦洗，然后再开紫外灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。（三）器材1培养基 牛肉膏蛋白胨平板。2溶液或试剂 3%5%石炭酸或2%3%来苏尔溶液。3仪器或其他用具 紫外线灯。（四）操作步骤l

33、单用紫外线照射（1）在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30min，将开关关闭。（2）将牛肉膏蛋白胨平板盖打开15min，然后盖上皿盖。置37培养24h。共做三套。（3）检查每个平板上生长的菌落数。如果不超过4个，说明灭菌效果良好，否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。2化学消毒剂与紫外线照射结合使用（1）在无菌室内，先喷洒3%5%的石炭酸溶液，再用紫外线灯照射15imn。（2）无菌室内的桌面，凳子用2%3%来苏尔擦洗，再打开紫外线灯照射15min。（3）检查灭菌效果。因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光下工作。（3）在紫外灯下观察实验结果时，为

34、什么要隔一块普通玻璃？四 微孔滤膜过滤除菌（一）目的要求1了解过滤除菌的原理。2掌握微孔滤膜过滤除菌的方法。（二）基本原理过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成，出口处可连接针头，入口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌

35、。（三）器材1培养基 2%的葡萄糖溶液，肉汤蛋白胨平板。2仪器或其他用具 注射器，微孔滤膜过滤器，0.22m滤膜，无菌试管，镊子，玻璃刮棒。（四）操作步骤l组装、灭菌将0.22m孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧压平，包装灭菌后待用（0.lMPa，121.5灭菌20min）。2连接将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液（2%葡萄糖溶液）的注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。3压滤将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拨出。压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过淀胶4无菌检查无菌操作吸取除菌滤液0.1ml于肉

36、汤蛋白胨平板上，涂布均匀，置37温室中培养24h，检查是否有菌生长。5清洗弃去塑料滤器上的微孔滤膜，将塑料滤器清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜，组装包扎，再经无菌后使用。整个过程应在无菌条件下严格无菌操作，以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗漏现象。实验5 菌种的分离纯化技术-平板划线法实验目的了解平板划线分离纯种的原理，并熟练掌握该操作法。实验内容培养基平板的制备。用平板划线分离法分离混菌。实验原理平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的

37、纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线，第一区（A区）面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区（B、C区）是逐级稀释的过渡区，第四区（D区），则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。为了得到较多的典型单菌落，平板上四区面积的分配应是DCBA。实验器材 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合菌悬液 牛肉膏蛋白胨培养基 无菌培养皿，水浴锅，接种环等。实验步骤 1.融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。2

38、.倒平板：待培养基冷却至50摄氏度左右，按无菌操作法倒2只平板（每皿约15m1），平置，待凝固。倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管（瓶）塞（也可将试管塞或瓶塞放在了，手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中）。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。3.作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各

39、区之间的交角应为120度（平板转动一定角度约60度），以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区域线条相接触。4划线操作（1）挑取含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。（2）划A区：将平板倒置于煤气（酒精）灯旁，左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯（这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁），右手拿接种环先在A区划3-4条连续的平行线（线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方（不要放入皿盖内），以防止杂菌的污

40、染。（3）划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区（菌源区）将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A，B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。5恒温培养：将划线平板倒置，于37（或28）摄氏度培养，24hr后观察。（2）涂布平板计数法：平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。二者操作基木相同，所不同的是后者先将培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37摄氏度左右

41、的温箱中烘烤30min，或在超静土作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20-30 min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置于的恒温箱中培养24-48 h。涂布平板用的菌悬液量一般以0.1 ml较为适宜，如果过少，菌液不易涂布开；过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。实验6 稀释平板计数法实验目的学习稀释平板菌落计数的基本原理和方法。实验内容用稀释平板菌落计数法对菌悬液进行计数。实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量

42、的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2-3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时一间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验 （

43、如活菌制剂），以及食品、饮料和水包括水源水等的含菌指数或污染程度的检测。实验器材马铃薯培养基lml吸管，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。实验步骤1无菌器材的准备（1）无菌培养皿：取培养皿 9套，包扎、火菌。（2）无菌移液管的准备：取lml移液管，在后部管口处用铁丝塞入棉花少许（长约11.5cm），以防将菌液吸出，同时也可避免将外面的微生物吹入。棉花要塞得松紧适宜，吹时能通气但不使棉花滑下为准。然后将移液管尖端放在45cm宽的长纸条一端呈45度角折叠纸条包住尖端，用左手捏住管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前滚动，以螺旋式包扎起来，上端剩余纸条折叠打结后干热火菌。（3）无菌水：取6支试管，分别装

44、入4.5m1蒸馏水，加棉塞，火菌。2.样品稀释液的制备（1）编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4，10-5，10-6（稀释度）各3套。另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。（2）稀释用lml无菌吸管吸取lml己充分混匀的菌悬液（待测样品），精确地放1ml至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支lml吸管插入10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花

45、浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液lml精确地放0.5ml至10-2试管中，此即为100倍稀释。其余依次类推。放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不准确，结果误差较大。3.平板接种培养 平板接种培养有浇注平板培养法和涂布平板培养法两种方法。（1）浇注平板培养法 1）取样 用三支1 ml无菌吸管分别吸取10-4，10-5、和10-6的稀释菌悬液各1 ml。2）倒平板 尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45摄氏度左右的培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。

46、待培养基凝固后，将平板倒置于37摄氏度恒温培养箱中培养。由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并己冷却至45摄氏度左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。4.计数 培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中菌落形成单位（cfu）=同一稀释度三次重复的平均菌落数x稀释倍数 一般选择每个平板上长有30-300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少

47、误差。由10-4，10-5，10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。实验7 细菌大小的测定 一、实验目的和内容 目的：学会测微尺的使用和计算方法及对球菌和杆菌的测量。内容：1.认识测微尺，学习目镜测微尺的标定。2.测定金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌体的大小。二、实验材料和用具 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的玻片标本。香柏油、二甲苯；显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、擦镜纸。三、操作步骤 l测微尺的构造 显微镜测

48、微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成，目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在5mm刻尺上分50份。目镜测微尺每格实际代表的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须用镜台测微尺进行标定。镜台测微尺为一专用中央有精确等分线的载玻片，一般将长为1mm的直线等分成100个小格，每格长0.0lmm即10m，是专用于校正目镜测微尺每格长度的。2目镜测微尺的标定 把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测

49、微尺的刻度相平行，并使两尺左边的一条线重合，向右寻找另外一条两尺相重合的直线。3计算方法标定公式：目镜测微尺每格长度（m）=两条重合线间镜台测微尺的格数10两条重合线间目镜测微尺的格数例如，目镜测微尺20个小格等于镜台测微尺3小格，已知镜台测微尺每格为10m，则3小格的长度为310=30m，那么相应地在目镜测微尺上每小格长度为31020=1.5m。用以上计算方法分别校正低倍镜、高倍镜及油镜下目镜测微尺每格实际长度。4菌体大小的测定 将镜台测微尺取下，分别换上大肠杆菌及金黄色葡萄球菌玻片标本，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的

50、格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。例如，目镜测微尺在这架显微镜下，每格相当于1.5m，测量的结果，若菌体的平均长度相当于目镜测微尺的2格，则菌体长应为31.5m=3.0m。一般测量菌体的大小，应测定1020个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。四、注意事项1镜台测微尺的玻片很薄，在标定油镜头时，要格外注意，以免压碎镜台测微尺或损坏镜头。2标定目镜测微尺时要注意准确对正目镜测微尺与镜台测微尺的重合线。实验7 微生物数量的测定细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法（direct microscopic count）、平板菌落计数法（