分子生物学载体5课件.pptx

1、 在基因工程操作中，把能携带外源在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受进入受体细胞的体细胞的DNA分子叫载体。分子叫载体。载体是载体是DNA双链分子。双链分子。载体载体DNA分子中是有一段生长扩增的非必需区，分子中是有一段生长扩增的非必需区，该区经人工改造后可插入外源的该区经人工改造后可插入外源的DNA，并可转入，并可转入宿主细胞中，使外源宿主细胞中，使外源DNA与载体与载体DNA共同扩增共同扩增。载体的功能载体的功能理想载体至少必备的条件理想载体至少必备的条件 能在宿主细胞中自主复制能在宿主细胞中自主复制 容易进入宿主细胞容易进入宿主细胞 容易插入外来核酸片段容易插入外来核酸片段 容易从

2、宿主细胞中分离纯化，便于重组操作容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作 具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性 （可转移性）（可转移性）目前的主要载体目前的主要载体 质粒（质粒（Plasmid）单链单链DNA噬菌体噬菌体M13 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 柯斯质粒（柯斯质粒（Cosmid）动物病毒（动物病毒（virus）细菌人工染色体细菌人工染色体(BAC)酵母人工染色体酵母人工染色体(YAC)并能被稳定遗并能被稳定遗 传的一类传的一类质粒质粒DNA的空间构型的空间构型 SC构型构型:两条核苷酸链均保持着完整的环形两条核苷酸链均

3、保持着完整的环形 结构，结构，DNA呈现超螺旋。呈现超螺旋。OC构型构型:两条链中只有一条保持着完整的环两条链中只有一条保持着完整的环 形结构，另一条链出现缺口，称之形结构，另一条链出现缺口，称之 为开环为开环DNA。L 构型构型:DNA双链均发生断裂而形成线性分双链均发生断裂而形成线性分 子。子。1.1 质粒的生物学基本特性质粒的生物学基本特性 携带有自己的复制起始区（携带有自己的复制起始区（ori），它能独），它能独立于宿主细胞的染色体立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。而自主复制。质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行复制系统进行自主复制。自主复制。，这种现象称为质

4、粒的，这种现象称为质粒的不相容性不相容性含有相似复制子结构的不同质粒。含有相似复制子结构的不同质粒。以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容质粒的生物学基本特性质粒的生物学基本特性质粒的不相容性分子机制质粒的不相容性分子机制质粒的生物学基本特性质粒的生物学基本特性7.携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记 野生型的质粒野

5、生型的质粒DNADNA上往往携带一个或多个遗传标上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：附加性状，包括：物质抗性：重金属离子、毒性阴离子、有机物物质抗性：重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱等。物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱等。这些标记基因对这些标记基因对DNADNA重组分子的筛选具有重要意义。重组分子的筛选具有重要意义。质粒的生物学基本特性质粒的生物学基本特性 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另能在天然条件

6、下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等质粒等非接合型质粒不能在天然条件下独立地发非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用。生接合作用。值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由转移，这个过程由bom 和和mob 基因决定。基因决定。严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，1-3 松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不

7、受宿主细胞蛋白质合成的严格控制，用小写字母用小写字母p代表质粒，在代表质粒，在p字母后面用两字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。后面的数字是构建质粒的编号验室名称。后面的数字是构建质粒的编号。如：如：pUC18和和pBR322。加入合适的选择标记基因，通常是抗生素基因。加入合适的选择标记基因，通常是抗生素基因。增加或减少合适的酶切位点，便于重组。增加或减少合适的酶切位点，便于重组。缩短长度，切去不必要的片段，增加装载量。缩短长度，切去不必要的片段，增加装载量。改变复制子，由严紧变为松弛型，以增加拷贝数改变复制子，由严紧变为松弛型，以增加

8、拷贝数。加装特殊的基因元件。加装特殊的基因元件。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：质粒构建的：pSC101 8.8 kb 拷贝数拷贝数 5 四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因 TcrColE1 6.5 kb 拷贝数拷贝数 20-30 大肠杆菌内毒素标记基因大肠杆菌内毒素标记基因 E1RSF2124 ColE1衍生质粒衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因氨苄青霉素抗性标记基因 Apr 测序质粒测序质粒 含有测序通用引物互补序列含有测序通用引物互补序列和多酶接头和多酶接头polylinker 整合质粒整合质粒 装有整合促进

9、基因及整合特装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因的整合。异序列，便于外源基因的整合。穿梭质粒穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复装有针对两种不同受体的复制子，便于基因能在两种不同的受体细制子，便于基因能在两种不同的受体细胞中复制。胞中复制。探针质粒探针质粒 筛选克隆或寻找基因元件。筛选克隆或寻找基因元件。如何阅读质粒图谱如何阅读质粒图谱 1.1.首先看首先看OriOri的位置，了解质粒的类型（原核的位置，了解质粒的类型（原核/真真核核/穿梭质粒）穿梭质粒）2.2.再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。记。（1 1）AmpAmpr r 水解水解

10、内酰胺环，解除氨苄的毒性内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2 2）TetTetr r 可以阻止四环素进入细胞。可以阻止四环素进入细胞。（3 3）CamCamr r 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失 去毒性。去毒性。（4 4）neoneor r（KanKanr r）氨基糖苷磷酸转移酶使氨基糖苷磷酸转移酶使G418G418 （卡那霉素衍生物）失活（卡那霉素衍生物）失活（5 5）HygHygr r 使潮霉素使潮霉素失活。失活。如何阅读质粒图谱如何阅读质粒图谱 3.3.看多克隆位点（看多克隆位点（MCSMCS）。它具有多个限制酶）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插

11、入。如果在这的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。基因以及如何放置目的基因。4.4.再看外源再看外源DNADNA插入片段大小。质粒一般只能插入片段大小。质粒一般只能容纳小于容纳小于10Kb10Kb的外源的外源DNADNA片段。一般来说，外片段。一般来说，外源源DNADNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。效率越低。如何阅读质粒图谱如何阅读质粒图谱 5.5.是否含有表

12、达系统元件，即是否含有表达系统元件，即 启动子核糖体结合位点克隆位点启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。这是用来区别克隆载体与表达载体。2.8kb。噬菌体是一类，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。寄主：大肠杆菌。寄主：大肠杆菌。DNA长度：长度：6407 bp。外型外型:丝状丝状组成组成:由外壳包装蛋白和正链由外壳包装蛋白和正链DNA组成组成基因基因:至少有至少有10个基因个基因M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生

13、长RF DNA:replicational form DNA优点：优点：RF-DNA(复制型DNA)+DNA转译与包装相关的蛋白质 RFDNA达到200个拷贝时,+DNA被单链特异的DNA结合蛋 白结合,阻断-DNA的复制只能以-DNA为模板复制新的+DNA 新的+DNA立即被积累在细胞内的壳蛋白包装成新的噬菌体 颗粒,不断被挤出宿主细胞M13 DNA载体的构建：包装极限可达包装极限可达M13 DNA本身长度的本身长度的7倍倍 噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：生物结构生物结构 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 噬菌体由外壳包装蛋白和-DNA组成-DNA为线状双链DNA分子，全长48502

14、个核苷酸，两端各有一个12核苷酸的互补单链，称为cos区。-DNA-DNA上至少有61个基因，左边是外壳蛋白的基因，右边是负责裂解宿主细胞，DNA自主复制以及调控基因，中间是负责与宿主染色体DNA遗传重组整合的基因。野生型野生型-DNA包装的上限为包装的上限为51kb，本身长度为，本身长度为48.5kb，只有，只有当插入的外源当插入的外源DNA片段不大于片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型-DNA的长度，可以提高装的长度，可以提高装载量。野生型载量。野生型-DNA上约有上约有40-50%的片段是复制和裂解所

15、非的片段是复制和裂解所非必需的。必需的。构建原理：删除构建原理：删除 噬菌体的非必需区，留出插入空间。噬菌体的非必需区，留出插入空间。在这个非必须区内制造限制酶切点在这个非必须区内制造限制酶切点 引进某些突变表型，作为选择标记引进某些突变表型，作为选择标记 突变某些基因，使它成为安全载体突变某些基因，使它成为安全载体 删除删除 DNA必须区段上常用的限制酶切点必须区段上常用的限制酶切点 噬菌体噬菌体 DNA上本身有上本身有5个个 EcoR I 和和7 个个Hind III切点！切点！根据切除的多少，可将根据切除的多少，可将-DNA分成两大类载体：分成两大类载体：插入型载体插入型载体 取代型载体

16、取代型载体插入型载体长度插入型载体长度36.4kb插入片断长度：插入片断长度：0-14.5kb（36.4-51.9kb替换型替换型-DNA载体长度载体长度26kb插入片断长度：插入片断长度：10.4-24.9kb（36.4-51.9kb-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组-DNA污染后，均不能被包装成有感

17、染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。体外包装存在的问题体外包装存在的问题 包装错误：既能包装内源性原包装错误：既能包装内源性原 DNA，也能包装重组的，也能包装重组的 DNA载体。载体。重组：外源的重组重组：外源的重组 DNA载体被诱发与内源性原载体被诱发与内源性原 DNA 发生重组。发生重组。体外包装的容量限制：必须在正常野生型容量的体外包装的容量限制：必须在正常野生型容量的75%105%（3651kb）之间，即既不能超过正常野生型）之间，即既不能超过正常野生型 容量的容量的105%；又不能低于正常野生型容量的；又不能低于正常野生型容量的75%。注：注：野生型野生型 DNA的必须区是的

18、必须区是28kb，所以，所以 载体的载体的最大最大 克隆容量是克隆容量是23kb。（一般为。（一般为15kb）。）。以以 噬菌体为载体噬菌体为载体进行进行DNA克隆克隆 DNA用限制性内切酶用限制性内切酶除去中间一段除去中间一段与外源与外源DNA连接连接重组载体的体外包装重组载体的体外包装带有外源带有外源DNA的的 噬菌体噬菌体太小不能被包装太小不能被包装头部前体头部前体多联体多联体DNAA蛋白蛋白COSCOSCOS成熟的颗粒成熟的颗粒在宿主细胞内进行在宿主细胞内进行DNA的装配过程的装配过程2.4.6-DNA及其重组分子的分离纯化及其重组分子的分离纯化 将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至

19、对数生长期 加入噬菌体或重组噬菌体的悬浮液，37培养1小时 用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。这时噬菌体颗粒密度已达1013-1014/L，大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放-DNA 乙醇或异丙醇沉淀-DNA2.4.7-DNA载体的优点载体的优点-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组-DNA分子的筛选较为方便 重组-DNA分子的提取较为简便-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，常用于构建基因文库，但不适合表达外源基因 8装载范围为装载范围为31-45kb 多用于基因文库构建多用于基因

20、文库构建cos:cohesive-end site特点：特点：考斯质粒的构建考斯质粒的构建 由于-DNA包装蛋白只识别粘性末端的一小段顺序cos区。将这段DNA与质粒连在一起，构建的重组质粒，可装载外源DNA（45.5kb)，它仍可象-DNA一样，在体外被包装成有感染活性的噬菌体，进入细胞后，要通过质粒上的复制子进行复制。人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：多单个基因也相当大（如：DMD gene DMD gene 2300kb2300kb），克隆分析就需要更大的基因，克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：载体。如近年来构

21、建的一些载体：BACBAC，PIPI，YACYAC等。等。人造染色体载体人造染色体载体 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（细菌人造染色体（BAC）酵母人造染色体（酵母人造染色体（YAC）人造染色体载体人造染色体载体 优点：能携带大片段优点：能携带大片段DNADNA，约，约300kb300kb。在每个细胞中，一个载在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，体分子能繁殖多个拷贝

22、，高产高产DNADNA。缺点：会出现插入片段在缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克结构上的不稳定，导致克隆隆DNADNA部分的缺失或重排部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体采用低拷贝数复制子载体，如，如，E coliE coli中的中的F F因子因子。此质粒含有。此质粒含有2 2种基因（种基因（part A,part Bpart A,part B）。每）。每个个E coliE coli能接受能接受 300kbDNA300kbDNA片段。片段。细菌人造染色体细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BA

23、C）细菌人造染色体细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子FF质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300 kb之间 各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝 pBACs主要适用于：克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库酵母人造染色体酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）YAC载体应含有下列元件载体应含有下列元件：酵母染色体的端粒序列酵母染色体的复制子酵母染色体的中心粒序列酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的选择标记

24、YAC载体的装载量为350-400 kb酵母人工染色体（酵母人工染色体（YACYAC）适用于克隆大片段适用于克隆大片段DNADNA，0.20.22Mb2MbYAC YAC 的主要功能成份有三：的主要功能成份有三：1 1）着丝粒着丝粒：mitosismitosis姊妹染色单体和减姊妹染色单体和减I I同同源染色体分离之必需。源染色体分离之必需。2 2）端粒：端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。袭。3 3）自主复制序列（自主复制序列（ARSARS）元件）元件：是染色体自：是染色体自主复制的复制起点。主复制的复制起点。构建构建YACYAC需要需要4 4个短序列：个短序列

25、：2 2个端粒，着丝粒个端粒，着丝粒，ARSARS元件，与外源元件，与外源DNADNA连接成线性连接成线性DNADNA分子分子，导入酵母细胞克隆。，导入酵母细胞克隆。噬菌体噬菌体PIPI载体和载体和PACPAC PIPI噬菌体与噬菌体与噬菌体一样，外有蛋白质噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（壳。内含相当大的（110110115kb115kb）线性）线性DNADNA，并在体外包装于，并在体外包装于PIPI壳内。壳内。PIPI进入进入宿主细胞后环化，扩增。宿主细胞后环化，扩增。19941994年，有人将年，有人将PIPI和和F F因子克隆结合产因子克隆结合产生生PIPI人工染色体克隆系统人工染色体克隆系统-PAC-PAC。表达载体(expressing vector)特点：带表达构件转录和翻译所需的DNA序列 大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号 启动子：trp-lac(tac)启动子、噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子 核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列 转录终止序列哺乳动物表达载体 真核表达元件：启动子/增强子克隆位点终止信号和加poly(A)信号