动物细胞培养的基本方法课件.ppt

1、第五节第五节 动物细胞培养的基本方法动物细胞培养的基本方法一一 细胞分离细胞分离1 1 离心分离法离心分离法 用于从含有细胞的体液如血液、羊水、用于从含有细胞的体液如血液、羊水、胸腹水中分离细胞。一般用胸腹水中分离细胞。一般用8008001000rpm1000rpm离心离心5 510min10min。2 2 消化分离法消化分离法 先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化液将其消化，使组织松散成细胞悬液，然后用缓冲液将其消化，使组织松散成细胞悬液，然后用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细液洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细胞。胞。常用

2、的消化液有胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、胰常用的消化液有胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、胰酶柠檬酸盐、胰酶酶柠檬酸盐、胰酶EDTAEDTA、胶原酶、链霉蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶等。木瓜蛋白酶等。二二 细胞计数细胞计数1 1 血球计数板计数血球计数板计数2 2 自动细胞计数器计数自动细胞计数器计数3 3 结晶紫染色细胞核计数法结晶紫染色细胞核计数法4 MTT4 MTT染色计数法染色计数法三三 细胞传代细胞传代1 1 悬浮细胞的传代悬浮细胞的传代 加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或多只培养瓶即可。多只培养瓶即可。2 2 贴壁细胞的传代贴壁细胞的传代 消化前

3、需用肉眼或镜下观察需消化的细胞，确认细消化前需用肉眼或镜下观察需消化的细胞，确认细胞有无污染；胞有无污染；加入消化液量要适当，以摇动时能盖满单层细胞为加入消化液量要适当，以摇动时能盖满单层细胞为度；度；消化时间不宜过久，一般在室温下静置消化时间不宜过久，一般在室温下静置2 25min,5min,当当见细胞层出现麻布样网孔时，即可倒去消化液。见细胞层出现麻布样网孔时，即可倒去消化液。终止消化要先倒去消化液，然后加入有血清的培养终止消化要先倒去消化液，然后加入有血清的培养基。基。已培养过的瓶子可再次使用，但一般不要超过已培养过的瓶子可再次使用，但一般不要超过2 23 3次。次。2 2倍体细胞培养时

4、每次传代必须写上传代次数。倍体细胞培养时每次传代必须写上传代次数。分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数细胞分分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数细胞分种以种以20203030万个万个/ml,/ml,每次每次1 1传传2 2或或1 1传传3 3。传代后一般每天或隔一天换液，每传代后一般每天或隔一天换液，每3 35 5天就要传天就要传代一次。代一次。四四 细胞的冻存和复苏细胞的冻存和复苏 将细胞放入试管内，在冰浴条件下加入预冷将细胞放入试管内，在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂（二甲基亚砜的冰冻保护剂（二甲基亚砜+山梨醇山梨醇+甘油甘油+蔗糖）。蔗糖）。密封试管，继续在冰浴中停留密封试管，继续在冰浴

5、中停留15min15min。然后试管以。然后试管以1 1/min/min的速度冷却，降到的速度冷却，降到-40-40，在，在-40-40停留停留2h2h后投入液氮罐（后投入液氮罐（-196-196）。）。1 1 细胞的冻存细胞的冻存2 2 细胞的复苏细胞的复苏复温速率复温速率复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。一般来说复苏速度越快越好。一般来说复苏速度越快越好。常规的做法是，在常规的做法是，在3737水浴中，于水浴中，于1 12min2min内完内完成复温。成复温。动物细胞大规模培养：动物细胞大规模培养：在人工条件下（设定在人工条件下（设定pHpH、

6、温度、溶氧等），、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（在细胞生物反应器（bioreactorbioreactor）中高密度大）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、chocho（中华仓鼠卵巢）细胞、（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(BHK-21(仓鼠肾细仓鼠肾细胞胞)、VeroVero细胞细胞(非洲绿猴肾传代细胞，贴壁依非洲绿猴肾传代细胞，贴壁依赖赖)等。等。已成功生产了包括狂犬病疫苗

7、、口蹄疫已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。细胞生成素、单克隆抗体等产品。依细胞种类：依细胞种类：原代培养、传代培养原代培养、传代培养依培养基：依培养基：液体培养、固体培养液体培养、固体培养依培养器和方式依培养器和方式:静止培养、旋转培养、搅静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养。定床或流化床培养。生产实际来看：生产实际来看：悬浮培养、贴壁培养和贴壁悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。悬浮培养。1 1、悬浮培养（、悬浮培养（

8、suspension culturesuspension culture）让细胞自由的悬浮于培养基内进行生长繁殖。让细胞自由的悬浮于培养基内进行生长繁殖。适用细胞类型：适用细胞类型：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤交瘤设备：通气搅拌式生物反应器、气升式生物反设备：通气搅拌式生物反应器、气升式生物反应器。应器。生产药物：单克隆抗体；干扰素。生产药物：单克隆抗体；干扰素。缺点：缺点：细胞体积小，且处于悬浮状态，难采细胞体积小，且处于悬浮状态，难采用灌流培养，细胞密度低。用灌流培养，细胞密度低。借鉴微生物发借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的特性。酵理论和经验，发挥动物细

9、胞的特性。必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。养方法。适用细胞类型：贴壁依赖型细胞，兼性贴壁适用细胞类型：贴壁依赖型细胞，兼性贴壁细胞。细胞。基质要求：具有净阳电荷和高度表面活性。基质要求：具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具有一定电荷密度。对微载体而言还要求具有一定电荷密度。优点：优点：a a容易更换培养液，细胞紧密黏附于固相表面，容易更换培养液，细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。液。b b容易采用灌流培养，从而达到提高细胞密度的容易采用灌流培养，从而达到提高

10、细胞密度的目的，因细胞被固定，不需过滤系统。目的，因细胞被固定，不需过滤系统。c c当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。的表达一种产品。缺点：缺点：a a操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积。的面积。b b培养条件不易均一，传质和传氧效果差。培养条件不易均一，传质和传氧效果差。c c不能有效地监控细胞的生长。不能有效地监控细胞的生长。贴壁培养系统：中空纤维；玻璃珠；微载贴壁培养系统：中空纤维；玻璃珠；微载体培养。体培养。贴壁培养和悬浮培养的不同之处是在贴壁培养和悬浮培养的不同之处是在传代或

11、扩大培养时，常常需要用酶将其从传代或扩大培养时，常常需要用酶将其从基质上消化下来。基质上消化下来。将悬浮培养和贴壁培养相结合的方法。将悬浮培养和贴壁培养相结合的方法。微载体培养：细胞贴附在载体表面。创造微载体培养：细胞贴附在载体表面。创造大的贴附面积，供细胞贴附生长增殖；载体大的贴附面积，供细胞贴附生长增殖；载体体积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带体积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培养的一切优点。培养的一切优点。载体：葡聚糖、聚苯乙烯、胶原等。载体：葡聚糖、聚苯乙烯、胶原等。理想的微载体应具备：理想的微载体应具备

12、：生物相容性；无毒性；表面惰性；比重适生物相容性；无毒性；表面惰性；比重适当（当（1.030-1.045g/ml1.030-1.045g/ml）；粒径均一，在）；粒径均一，在60-60-250250 m m之间（溶胀后）；光学透明；柔软；耐之间（溶胀后）；光学透明；柔软；耐高压灭菌温度；反复多次使用；制备简单、原高压灭菌温度；反复多次使用；制备简单、原料充分。料充分。80 80年代以后发展的多孔微载体或多孔微球，年代以后发展的多孔微载体或多孔微球，增大了供细胞贴附的比表面积。增大了供细胞贴附的比表面积。应用：应用：工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原 包埋或微囊培养

13、：包埋或微囊培养：将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。可用于包埋细胞的载体材料为：人工合成可用于包埋细胞的载体材料为：人工合成的高分子聚合物；糖类如纤维素等；蛋白质的高分子聚合物；糖类如纤维素等；蛋白质如胶原、纤维蛋白等。如胶原、纤维蛋白等。包埋法：包埋法：将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法。的方法。优点：优点：步骤简单，条件温和，负荷量大，细步骤简单，条件温和，负荷量大，细胞泄露少，抗机械剪切。胞泄露少，抗机械剪切。缺点：缺点：扩散限制，并非所有的细胞处于最佳扩散限制，并非所有的细胞处于最佳基质浓度，且大分子

14、基质不能渗透到高聚基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内部。物网络内部。一般适用于非贴壁依赖性细胞的固定。一般适用于非贴壁依赖性细胞的固定。常用的载体：琼脂糖；海藻酸钙凝胶常用的载体：琼脂糖；海藻酸钙凝胶微囊法：微囊法：用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊内，细胞不能溢出，但小分子物质及营囊内，细胞不能溢出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜。养物质可自由出入半透膜。囊内是微小培养环境，与液体培养相似，能囊内是微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。高。结团培养：结团培养：利

15、用细胞本身形成结团的特点，相互结团后利用细胞本身形成结团的特点，相互结团后再用悬浮的方法培养，操作简便，节省了再用悬浮的方法培养，操作简便，节省了用于微载体的成本用于微载体的成本。1 1、分批式操作、分批式操作 将细胞和培养基一次性加入反应器内将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将条件培养基，即经培形成和积累，最后将条件培养基，即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。一并取出，培养结束。另一种是先将细胞和培养基加入反应另一种是先将细胞和培养基加入反应器，

16、待细胞生长至一定密度后，向反应器器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后，将反应物取出。后，将反应物取出。当细胞和培养基一起加入反应器后，在当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。该操作方式在动物细胞培养和药品生该操作方式在

17、动物细胞培养和药品生产中被广泛采用，它的优点是操作简便，产中被广泛采用，它的优点是操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。保持在较高的水平。当细胞和培养基一起加入反应器后，在细当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。细胞被固定，在取出部分条件培养基和补细胞被固定，在取出部分条件培养基和补充新鲜培养基时，细胞基本上都

18、被保留在反充新鲜培养基时，细胞基本上都被保留在反应器内。应器内。1、搅拌式生物反应器、搅拌式生物反应器2、气升式生物反应器、气升式生物反应器3、中空纤维式生物反应器、中空纤维式生物反应器4、透析袋或膜式生物反应器、透析袋或膜式生物反应器5、固定床或流化床式生物反应器、固定床或流化床式生物反应器机械搅拌式生物反应器（1）罐体的高径比一般采用1-1.5：1，利于增大与空气的接触面（2）为防止搅拌产生的切力损伤细胞，搅拌速度慢，一般在20-100r/min（3）采用无气泡通气系统，防止气泡破裂时产生的应力对细胞的损伤（4）高密度、长时间培养以及提高反应器的生产效率考虑，反应器常常需要配备有进出液体系

19、统，以便进行灌流培养，并有使细胞与培养基分离使细胞保留在反应器内的装置。气升式生物反应器 与搅拌式生物反应器相比，具有剪切与搅拌式生物反应器相比，具有剪切力小，混合均一，氧和营养的传递好，由力小，混合均一，氧和营养的传递好，由于没有了机械搅拌的结构，有利于设备的于没有了机械搅拌的结构，有利于设备的密封，降低了造价。高径比一般在密封，降低了造价。高径比一般在1010：1 1左左右。右。中空纤维反应器 由数百乃至数千根中空纤维集束组成的反应器，纤维的材料为聚砜或丙烯共聚物，纤维壁厚为50-100m，呈多孔性，内层为超滤膜，内腔直径为200m，两端用环氧树脂等材料将纤维粘和在一起，并使内腔开口于外加

20、的塑料圆筒，使形成两个隔开的腔。不能重复使用；不能耐受高压灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌；难以取样检测。在动物细胞培养过程中，会产生一些代在动物细胞培养过程中，会产生一些代谢产物，如乳酸和氨等，对细胞的生长和产谢产物，如乳酸和氨等，对细胞的生长和产物的产生会产生抑制作用，因此有些学者设物的产生会产生抑制作用，因此有些学者设计了透析袋或膜式反应器，它们可将这些有计了透析袋或膜式反应器，它们可将这些有害代谢产物透析或过滤掉，从而使细胞生长害代谢产物透析或过滤掉，从而使细胞生长至更高密度，同时可根据需要选用不同相对至更高密度，同时可根据需要选用不同相对分子质量的膜，使产物保留在膜内或与细胞分子质

21、量的膜，使产物保留在膜内或与细胞分离开。分离开。结构较简单，装填的材料可以是一切对结构较简单，装填的材料可以是一切对细胞无毒、又有利于细胞贴附的材料，有细胞无毒、又有利于细胞贴附的材料，有实心载体和有孔载体两类。实心载体和有孔载体两类。Wave Bioreactor 1 1、培养过程需检测的物化参数、培养过程需检测的物化参数 直接在线检出直接在线检出 取样离线检测取样离线检测 检测后计算检测后计算 2 2、主要参数的检测和控制方法、主要参数的检测和控制方法温度温度pHpHa a在培养初期，偏碱，控制进二氧化碳量在培养初期，偏碱，控制进二氧化碳量 b b当细胞密度提高后控制当细胞密度提高后控制N

22、aHCONaHCO3 3的量的量 溶氧溶氧 搅拌搅拌 进出液流量进出液流量 一、提高产量、降低成本和改进质量一、提高产量、降低成本和改进质量方面的研究方面的研究二、转基因动物的研究二、转基因动物的研究三、组织工程的研究三、组织工程的研究为了提高产量，要提高细胞表达水平。为了提高产量，要提高细胞表达水平。为降低成本，须改进培养基配方。为降低成本，须改进培养基配方。为改进产品质量，关键是糖基化质量。为改进产品质量，关键是糖基化质量。改进工艺，生产设备等改进工艺，生产设备等 转基因动物：转基因动物：通过实验方法，人工地把人们想通过实验方法，人工地把人们想要研究的动物或人类基因，或者是有经济价值要研究

23、的动物或人类基因，或者是有经济价值的药物蛋白质基因，通常称为外源基因，导入的药物蛋白质基因，通常称为外源基因，导入动物的受精卵（或早期胚胎细胞），使之与动动物的受精卵（或早期胚胎细胞），使之与动物本身的基因组整合在一起，这样外源基因能物本身的基因组整合在一起，这样外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。代的一类动物。一般把目的片段在器官或组织中表达的转一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器（基因动物叫动物生物反应器（bioreactor），），几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都几乎任何有生命的器官、组织

24、或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。引人注目。1 动物血液生物反应器动物血液生物反应器 外源基因在血液中表达的转基因动物叫外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液

25、生物反应器。大家畜的血液容量较大，血液生物反应器。大家畜的血液容量较大，利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物可直己取得了一定进展。外源基因编码产物可直接从血清中分离出来接从血清中分离出来,血细胞组分可通过裂解血细胞组分可通过裂解细胞获得。细胞获得。2 动物膀胱生物反应器动物膀胱生物反应器 外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器反应器,叫动物膀胱生物反应器。膀胱尿乳头叫动物膀胱生物反应器。膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膜蛋白顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膜蛋白,这种蛋白

26、在膀胱中表达具有专一性这种蛋白在膀胱中表达具有专一性,而且它的而且它的基因是高度保守的基因是高度保守的,将外源基因插入将外源基因插入5端调控端调控序列中序列中,就可以指导外源基因在尿中表达。就可以指导外源基因在尿中表达。3 动物乳腺生物反应器动物乳腺生物反应器 动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物特异性表达的启动子元件构建转基因动物,指指导外源基因在乳腺中表达导外源基因在乳腺中表达,并从转基因动物的并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白。乳液中获取重组蛋白。牛、羊的乳中牛、羊的乳中蛋白质大多为酪蛋白、蛋白质大多为酪蛋白、-乳清蛋白

27、、酸性乳清蛋白、酸性蛋白、表达时需由特蛋白、表达时需由特定的启动子调节分泌定的启动子调节分泌出来，该启动子定位出来，该启动子定位在乳腺细胞中。现将在乳腺细胞中。现将该启动子克隆出来用该启动子克隆出来用于转基因动物中。于转基因动物中。在山羊奶中生产在山羊奶中生产ATT显微注射仪示意图显微注射仪示意图 自自19821982年年PalimiterPalimiter提出用转基因动物来生提出用转基因动物来生产药用蛋白以来，发展迅速。产药用蛋白以来，发展迅速。优点：产量高成本低，质量与天然一样。优点：产量高成本低，质量与天然一样。缺点：外源基因与动物本身的基因组整合率缺点：外源基因与动物本身的基因组整合率

28、低，外源基因应有的性质得不到充分表现或低，外源基因应有的性质得不到充分表现或不表现。实验运动如牛、羊和猪的整合率一不表现。实验运动如牛、羊和猪的整合率一般为般为1%1%左右。外源基因对动物本身也有影响，左右。外源基因对动物本身也有影响，它影响了动物的健康。它影响了动物的健康。组织工程组织工程：通过对大量细胞的培养，并用细：通过对大量细胞的培养，并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，或用胞直接作为一种治疗手段用于临床，或用培养的细胞进一步加工构成一种组织，如培养的细胞进一步加工构成一种组织，如人造皮肤、人造肝脏、人造胰腺、人造血人造皮肤、人造肝脏、人造胰腺、人造血管、人造骨等并用于临床治疗。管、

29、人造骨等并用于临床治疗。3.2 3.2 动物细胞形态和生理特点动物细胞形态和生理特点 3.3 3.3 生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得 3.4 3.4 动物细胞的培养条件和培养基动物细胞的培养条件和培养基 3.5 3.5 动物细胞培养方法和操作方式动物细胞培养方法和操作方式 3.6 3.6 动物细胞生物反应器及其检测控制系统动物细胞生物反应器及其检测控制系统 3.7 3.7 动物细胞制药的前景和展望动物细胞制药的前景和展望1 1、离体培养的动物细胞分为那些类型及各自特点、离体培养的动物细胞分为那些类型及各自特点.2 2、生产用的动物细胞的种类及特点？、生产用的动物细胞的种类

30、及特点？3 3、常用的培养动物细胞的培养基的种类？、常用的培养动物细胞的培养基的种类？4 4、如何进行动物细胞的大规模培养？、如何进行动物细胞的大规模培养？5 5、动物细胞生物反应器有哪些类型？特点是什么？、动物细胞生物反应器有哪些类型？特点是什么？6 6、动物细胞制药有哪些新进展？、动物细胞制药有哪些新进展？7 7、动物细胞的培养剂为什么加入小牛血清？、动物细胞的培养剂为什么加入小牛血清？7 7、请举一例说明转基因动物生产药物的方法、请举一例说明转基因动物生产药物的方法8 8、生产类淋巴细胞干扰素的细胞是来自淋巴、生产类淋巴细胞干扰素的细胞是来自淋巴瘤患者，药物经人服用会致癌吗？请分析瘤患者，药物经人服用会致癌吗？请分析原因。对其质量有什么要求？原因。对其质量有什么要求？5 5、生产用的动物细胞包括（、生产用的动物细胞包括（原代细胞、二倍体细胞、原代细胞、二倍体细胞、转化细胞、融合细胞、重组工程细胞转化细胞、融合细胞、重组工程细胞）6 6、动物细胞培养基必需的（、动物细胞培养基必需的（）种氨基酸包括）种氨基酸包括（）等。）等。7 7、目前在生产中用于悬浮培养的设备、目前在生产中用于悬浮培养的设备（）和（）和（）生物反应器。）生物反应器。8 8、基因工程药物残余、基因工程药物残余DNADNA含量（含量（)水平是安全的。水平是安全的。小于小于100pg/剂量剂量