植物细胞大规模培养及有用物质生产课件.ppt

1、植物细胞大规模培养及有用物质生产植物细胞大规模培养及有用物质生产 （一）、概述（一）、概述 （二）、植物细胞规模化培养体系的建立（二）、植物细胞规模化培养体系的建立（三）、利用细胞培养生产有用物质（三）、利用细胞培养生产有用物质 植物次生代谢产物：植物次生代谢产物：植物中一大类并植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。谢。（一）、概述（一）、概述

2、植物产生代谢产物的类型植物产生代谢产物的类型 根据分子结构不同大致分为：根据分子结构不同大致分为：酚类化合物：酚类化合物：黄酮类；醌类（苯醌、萘醌、蒽醌）黄酮类；醌类（苯醌、萘醌、蒽醌）萜类化合物：萜类化合物：三萜皂甙；甾体皂甙；单萜、倍半萜、二萜三萜皂甙；甾体皂甙；单萜、倍半萜、二萜 含氮化合物：含氮化合物：生物碱；胺类（伯、仲、叔、季胺）生物碱；胺类（伯、仲、叔、季胺）非蛋白氨基酸非蛋白氨基酸 生氰甙生氰甙 多炔类、有机酸多炔类、有机酸 植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。等领域具有重要意义。李时珍在李时珍在本草纲目本草纲目中所开

3、列的中所开列的18921892种药种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约物绝大多数是植物药物，目前仍有约2525的法定的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和。许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害是理可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害是理想的环保产品。想的环保产品。自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较生产方式生产方式 生产周期生产周期 紫草宁含量

4、（干重）紫草宁含量（干重）完整植物完整植物 23年年 12植物细胞培养植物细胞培养 3周周 14植物次生代谢产品的市场潜能植物次生代谢产品的市场潜能产品成分用途年销售额（亿美元）产品成分用途年销售额（亿美元）长春花碱治疗白血病长春花碱治疗白血病1820（美国）（美国）奎宁治疗疟疾奎宁治疗疟疾510（美国）（美国）致热素杀虫剂致热素杀虫剂20（全世界）（全世界）毛地黄心脏病药毛地黄心脏病药2055（美国）（美国）植物细胞大规模培养的技术要求：植物细胞大规模培养的技术要求：从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和次生代谢产物生产的生物反

5、应器，建立最佳细胞生长和次生代谢产物生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。的控制和调节系统。从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下3个条件：个条件：1、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。恒定的产物。2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。内能得到较高产量的终产物。3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。好能将其释放到培养基中。（二）、植物细胞规模化培养

6、体系的建立（二）、植物细胞规模化培养体系的建立 1、种子细胞的选择、种子细胞的选择 （1）准确选择能产生目的化合物的植物种类；）准确选择能产生目的化合物的植物种类；（2）尽量选择自然状态下产生天然产物的组织器官）尽量选择自然状态下产生天然产物的组织器官 为外植体；为外植体；(3)(3)高产种子细胞克隆的方法：单细胞培养后，将高产种子细胞克隆的方法：单细胞培养后，将 单细胞扩增形成的愈伤组织分单细胞扩增形成的愈伤组织分2份，份，1份成分含份成分含 量分析，另量分析，另1份保留培养。份保留培养。2、种子细胞系的增殖与放大培养、种子细胞系的增殖与放大培养 种子细胞增殖初期一般采用摇瓶培养，摇瓶体积从

7、种子细胞增殖初期一般采用摇瓶培养，摇瓶体积从几百毫升到几升逐级放大。当细胞数量增加到一定几百毫升到几升逐级放大。当细胞数量增加到一定值后，应转移至体积较小的生物反应器培养。值后，应转移至体积较小的生物反应器培养。3、大规模培养体系的建立、大规模培养体系的建立 （1 1）成批培养：）成批培养：在一个培养体积中接种细胞在一个培养体积中接种细胞 或添加培养基后，中途不添加也不更换培或添加培养基后，中途不添加也不更换培 养基的方式。养基的方式。（2 2）连续培养：）连续培养：在培养过程中，不断向反应在培养过程中，不断向反应 器中以一定流量添加新培养基，同时以器中以一定流量添加新培养基，同时以 一定流量

8、从系统中取出培养基的方式。一定流量从系统中取出培养基的方式。(3)(3)半连续培养：半连续培养：在完成成批培养的一个周期在完成成批培养的一个周期 后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只 保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的 种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养 的方式。的方式。(三三)生物反应器类型及特点生物反应器类型及特点 大规模培养系统基本原理方法与上述大规模培养系统基本原理方法与上述实验室悬浮培养一致，但大规模培养所采实验室悬浮培养一致，但大规模培养所采用的设备及控制技术比实验室小规

9、模培养用的设备及控制技术比实验室小规模培养要复杂的多。要复杂的多。植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易团聚等特点。同时，植物细胞规模力弱、易团聚等特点。同时，植物细胞规模培养的目的是生产天然产物，所以，植物细培养的目的是生产天然产物，所以，植物细胞培养反应器的设计不仅要考虑有利于细胞胞培养反应器的设计不仅要考虑有利于细胞生长，还要考虑有利于产物的积累和分离。生长，还要考虑有利于产物的积累和分离。总体上，适合植物细胞培养的反应器应具总体上，适合植物细胞培养的反应器应具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。切力

10、。机械搅拌式培养系统机械搅拌式培养系统机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产的生理活动需要新鲜空气，

11、且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；生有害气体，所以必须设计通气装置；为便于取为便于取样观察，一般还设计有取样口。样观察，一般还设计有取样口。生物反应器生物反应器Stirred Tank BioreactorsAn external motor is used to agitate the growth medium with impellers.Sterile air or combinations of gases can be introduced(sparkling)气压搅拌式培养系统气压搅拌式培养系统 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以考虑到机械搅拌式反应器的剪切作

12、用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。Bubble Column Bioreactor(Airlift Reactor)Introduction of sterile air or pure gases is used both for agitation and oxygenationInternal Loop Airlift BioreactorTube placed inside the react

13、or creates internal circulation loop External Loop Airlift BioreactorCirculation through an external loop 旋转式培养系统旋转式培养系统一般用于产品中试或某些必需裂解细一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。固定化培养系统固定化培养系统这一技术的优点在于：这一技术的优点在于：可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研可以较容易地控制培养系统的理化环境

14、，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节；究特定的代谢途径，并便于调节；细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；有利于次生产物的合成；由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中

15、，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；节省了生产细胞所付出的时间和费用；正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。细胞固定化培养技术按照其支持物不细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：同可以分为两大类：包埋式固定化培养系统：支持物多采包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；附着式固定化培养系

16、统：支持物采用附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。思考题思考题1 1一个好的悬浮细胞系有哪些特征？一个好的悬浮细胞系有哪些特征？用于建立悬浮细胞系的愈伤组织有何用于建立悬浮细胞系的愈伤组织有何 要求？要求？2 2建立悬浮细胞系的关键技术有哪些？建立悬浮细胞系的关键技术有哪些？3 3悬浮细胞系在继代培养中其群体生长悬浮细胞系在继代培养中其群体生长 规律？规律？4 4细胞大规模培养有哪些培养系统？细胞大规模培养有哪些培养系统？1234567891011121314151617181920123Ph1Ph2Ph3ONC6H5OHC6

17、H5OOOOOHHAcOHOHOHAcOC6H5OPaclitaxel(Taxol)紫杉醇研发过程NCI称其为过去15年中开发的最好的抗癌药物20世纪90年代抗肿瘤药的三大成就之一汤姆森科技桂冠奖Ramesh Panchagnula,International Journal of Pharmaceutics.1998(172)1-15.图图1：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）图图2：国际紫杉醇销售额（亿美元）：国际紫杉醇销售额（亿美元）优点：生长周期缩短 简便、直接缺点：1、紫杉醇含量低 生长缓慢 2、提取工艺复杂缺点：1、合成过程烦琐复杂，

18、几十步 2、费用高，化学试剂昂贵 3、总收率太低（2%）优点：1、原料枝叶含量丰富、提取相 对容易，充分利用再生资源 2、产率高 3、最具实用价值可以工业化生产 4、获取紫杉醇构效关系信息，进行结构改造缺点：合成过程相对复杂 （11步化学转化和7步分离）优点：1、摆脱自然因素，可长期稳定 生长 2、适应市场、方便调节 3、成分简单，有利于分离纯化 4、成本低、生长周期短 5、为半合成提供原料 6、有望工业化生产缺点：1、产量低、不稳定 2、工业化放大研究缺点：1、产量低、不稳定 2、工业化放大研究一、植物来源药物的特点一、植物来源药物的特点 全世界有40%的药物来源于植物。我国是中草药资源最丰

19、富的国家，有详细记载的近5000种。中草药治疗疾病的历史上千年，中医药已形成完整的科学体系。对于植物药效成分的研究已形成“天然药物化学”研究的新领域。药用植物中具有药物功能的物质种类繁多，结构复杂。除小分子的天然有机化合物以外，还有多种生物大分子活性物质。对不同组方的药用成分和功能的研究是一项巨大的工程，相当于基因组和蛋白质组工程。中药复方复杂系统研究（北京大学韩启德院士）二、植物来源药物的种类二、植物来源药物的种类 1、天然有机化合物 （1）糖和糖苷类 （2）苯丙素类：苯丙烯、苯丙酸、香豆素等 （3）醌类：辅酶Q10、紫草素 （4）黄酮类：黄酮醇、花色素 （5）鞣质：奎宁酸、槲皮醇。（6）萜类：青蒿素、齐墩果酸 （7）甾体：乌沙苷元、毛第黄毒苷元 （8）生物碱：咖啡因、喜树碱2、植物蛋白质、多肽、酶类生理活性物质 表2-163、植物糖类药物包括单糖、聚糖和糖衍生物。表2-174、植物脂类药物 （1）脂肪和脂肪酸类：亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸 （2）磷脂类：大豆磷脂 （3）固醇类：豆固醇、-谷固醇。三、植物来源药物的植被实例三、植物来源药物的植被实例 1、植物SOD 2、植酸钙镁与肌醇 3、植物不饱和脂肪酸四、植物药物来源的研究前景四、植物药物来源的研究前景 1、植物细胞培养 2、植物组织培养 3、有效成分的分离、纯化，结构和功能测定。