植物蛋白质组学课件.ppt

1、第一篇 分子与细胞生物学基础 第三章 植物蛋白质组学 目录 1.蛋白质组和蛋白质组学 2.蛋白质组和基因组 3.植物蛋白质组的研究方法 3.1 蛋白质双向电泳 3.2 氨基酸序列测定 3.3 质谱 3.4 生物信息学 4.植物蛋白质组学的研究进展 4.1 植物发育蛋白质组学的研究 4.2 植物环境蛋白质组学的研究 4.3 磷酸化蛋白质组学的研究 5.植物蛋白质组学研究的前景和挑战 5.1 表达的整体分析以及蛋白质组编目 5.2 大规模的蛋白质功能研究 5.3 建立完整的蛋白质调控网络 1.蛋白质组和蛋白质组学v蛋白质组：由一个基因组所表达的所有蛋白质。v蛋白质组学：研究在特定时间或环境下某个细

2、胞或某种组织的基因组所表达的全部蛋白质。它不是按照传统的方式孤立地研究某种蛋白质分子的功能,而是应用各种蛋白质组学技术研究某种蛋白质在复杂的细胞环境中的功能。蛋白质组学分为表达蛋白质组学和细胞图谱蛋白质组学。前者利用各种先进技术研究蛋白质表达的整体变化,即研究在机体的生长发育、疾病和死亡的不同阶段中,细胞与组织的蛋白质组分的变化;后者 主要通过分离蛋白质复合物系统地研究蛋白质间的相互作用 2.蛋白质组和基因组 蛋白质组和基因组的关系：它们在概念上有相关性，代表某一蛋白质组的蛋白质是由基因组编码的，而基因的功能是通过蛋白质表现出来的。蛋白质组学研究远比基因组研究复杂：蛋白质组学研究远比基因组研究

3、复杂：（1）蛋白质组的复杂性远远高于基因组 一个基因一个转录产物 一个蛋白质 基因不同的转录起始和mRNA的剪切不同的mRNA 不同的翻译起始不同的蛋白质翻译后修饰蛋白质的功能、稳定性、细胞定位发生变化 （2）基因组的组成是固定的，蛋白质组的组成是动态的。基因组在所有细胞中几乎都是相同的，与之不同，蛋白质组具有很高的细胞和组织特异性。基因组是相对稳定的，蛋白质组处于高度动态变化之中。（3）细胞内蛋白质的拷贝数（108）远比基因拷贝数大（105）。（4）基因可采用PCR扩增和自动测序，而蛋白质还没有这些技术。3.1 蛋白质双向电泳 3.2 氨基酸序列测定 3.3 质谱技术 3.4 生物信息学3.

4、植物蛋白质组的研究方法蛋白质组研究的技术路线流程图3.1 蛋白质双向电泳 蛋白质双向电泳(2-DE)：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的不同，分别通过第一维等电聚焦和第二维SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白质混合物进行分离。电泳后对蛋白质进行染色，常用的染色方法有考马斯亮蓝染色、银染以及蛋白质荧光检测方法。蛋白质双向电泳图3.1.1 利用双向电泳研究植物蛋白质组的基本流程 蛋白样品提取蛋白样品提取双向电泳分离蛋白双向电泳分离蛋白蛋白质染色蛋白质染色双向电泳图谱分析双向电泳图谱分析 蛋白点切割蛋白点切割 蛋白酶解和鉴定蛋白酶解和鉴定 该流程最关键的步骤是蛋白质样品的提取，它关系到下游蛋白质的分 离和

5、鉴定是否能够成功。好的蛋白质样品要求从某一个细胞、组织或器官中提取尽可能多的蛋白质，以最大限度地反应这个蛋白质组的全貌。3.1.2 双向电泳的缺陷和解决方法 解决方法：1.对样品进行前期分级 2.对不同的细胞器官或组织进行分离 3.使用宽胶条，符合重叠窄IPG凝胶 4.双向荧光差异凝胶电泳 5.多块胶垂直二维SDS-PAGE系统 6.双向电泳工作站缺陷缺陷分辨率低分辨率低重复性差重复性差耗时、自动化耗时、自动化程度低程度低蛋白质蛋白质定量困难定量困难 通过使用不同强度的离液剂和表面去垢剂，并进行分步溶解分离，可以获得更多的蛋白质，同时降低蛋白质样品的复杂性，提高2-DE的分辨率。如：Ready

6、Prep顺序抽提试剂盒。ReadyPrep试剂盒所需样品量较少，不需要额外的设备，是一种既节省时间又节省设备的好方法。ReadyPrep 产品线包含一系列2-DE样品制备试剂盒，不仅适用于通用样品（总蛋白）处理，而且可以将复杂样品按特定方法分级。处理通用样品的试剂盒包括总蛋白抽提和蛋白净化（clean-up）。样品分级试剂盒可用来降低样品复杂程度，同时有助于低丰度蛋白的富集和鉴定。这类试剂盒又分为两种，一种是基于蛋白不同的亚细胞定位来分离，另一种是对细胞总蛋白进行分级。下面的流程图将帮您确定哪种试剂盒对您更适合。一一.对样品进行前期分级对样品进行前期分级 顺序抽提试剂盒可将样品分离成3个递增溶

7、解度组份。这3 个分离份依次分离，使我们能观察到其它方法观察不到的蛋白。通过对每一分离份逐级使用更强的去垢剂，可提供递增的溶解度.试剂一试剂二试剂三 二、对不同的细胞或组织进行分离 通过亚细胞分类，比如单独提取细胞壁、细胞核、细胞膜、线粒体和叶绿体等的蛋白质组分。优点：降低蛋白质样品的复杂性，提高分辨率，了解蛋白质的定位。三、使用宽胶条，符合重叠窄IPG凝胶 2-DE的分辨率通常认为与有效的分离面积成正比，使用宽分离距离的IPG胶和长距离的二维SDS-PAGE可以提高2-DE的分辨率。选用不同pH范围的胶条，通过重叠几次窄范围的IPG凝胶电泳结果，可以提高在某一区段尤其是蛋白质集中区段内的分辨

8、率 pH范围 310 47 5.06.0上样量 40ug 80ug 120ug四.双向荧光差异凝胶电泳 原理：双向荧光差异凝胶系统（DIGE）在传统双向电泳技术的基础上，结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，分析它们之间的差异性。极大地提高了结果的准确性，可靠性和重复性。五.多块胶垂直二维SDS-PAGE系统 优点：提高二维电泳效率和实验重复性 六.2-DE工作站 优点：提高以2-DE为基础的蛋白质组研究的自动化程度和工作效率 3.2 氨基酸序列测定 氨基酸测序主要使用的是N端测序-Edman化学降解法。降解反应分三步进行：第一步：偶联反应，降解试剂（PI

9、TC）与多肽链的游离氨基作用，形成PCT-肽。第二步：环化断裂反应，PCT-肽在无水强酸介质如三氟乙酸中，最靠近PTC基的肽键将发生断裂，同时PTC-氨基酸残基环化成ATZ衍生物。第三步：转化反应，首先水解生成PTC-氨基酸，然后环化成PTH-氨基酸，其在紫外区有很强的吸收峰。它可以被各种技术层析出来，然后鉴定。每轮Edman反应，可以鉴定一个氨基酸，剩下的减少一个残基的肽链便在它的N端暴露一个新的氨基，又可参与第二轮反应。偶联反应偶联反应环化断裂反应环化断裂反应转化反应转化反应3.3 质谱质谱仪离心源质量分析器离子检测器基质辅助激光解吸电离（MALDI）电喷雾电离（ESI）飞行时间（TOF）

10、四级杆（Q）离子阱（IT）常用的质谱仪有：MALDI-TOF-MS ESI-Q-MS ESI-IT-MS 傅里叶变换离子回旋共振么质朴（FTMS）进样系统离子源质量分析器检测器 质谱分析原理质谱分析原理Typical result from MALDI-TOFPeptide fingerprinting(PMF)with MALDI-TOF trypticdigestionGelProteinDatabase?123compare:?is identical to?massspectrometrystored data or theoretical?peptides各种质谱仪的适用范围：MAL

11、DI-TOF-MS：分析鉴定一些相对比较简单的多肽混合物和进行高通量蛋白质组的研究。ESI-MS：分析复杂的蛋白质样品，鉴定组成蛋白质的氨基酸序列和蛋白质的翻译后修饰。FTMS：鉴定氨基酸的序列和分析蛋白质修饰。Bottom-up蛋白质组学：需要将蛋白质样品进行蛋白酶水解。如：MALDI-TOF-MS ESI-Q-MS ESI-IF-MSTop-down蛋白质组学：可以直接分析完整的蛋白质样品，不需要经过2-DE的前处理。如：FTMS3.4 生物信息学3.4.1 蛋白质组数据库 蛋白质组包括大量的信息：蛋白质的序列信息、加工和修饰信息、表达结构功能信息、与其他蛋白质形成复合物的信息。蛋白质数据

12、库拟南芥数据库拟南芥蛋白数据库PAT苜蓿数据库DOME3.4.2 蛋白质鉴定分析软件 例如：2-DE成像分析软件：Melanie,QUEST 蛋白质鉴定软件：MASCOT,PROWL4.植物蛋白质组的研究进展4.1 发育蛋白质组学的研究 发育蛋白质组发育蛋白质组：指植物在某一特定的生长发育时期，在特定的生长条件下，特定的细胞、组织或器官中所表达的所有蛋白质。发育蛋白质组学发育蛋白质组学：它揭示了在每一个特定时期所表达的蛋白质和这些蛋白质在特殊的生长时期可能发挥的作用，是进一步了解和深入研究蛋白质功能的基础。双子叶植物：开展了根、茎、叶、花、种子和果实的蛋白质组学组研究课题。单子叶植物：增加了叶

13、鞘、花药、胚、胚乳等蛋白质组的研究课题细胞器：细胞壁、内质网、细胞膜、叶绿体、线粒体等4.2 植物环境蛋白质组学的研究 4.3 磷酸化蛋白质组学的研究 环境因素环境因素非生物因素：厌氧、冷、热、干旱、盐、重金属等生物逆境：植物真菌、病毒植物激素：生长素、赤霉素、脱落酸、乙烯等 研究与环境因素相关的蛋白质，观察它们在逆境环境条件下表达量的变化，并研究它们是如何抵抗外界不利的生长环境，维持细胞的生命活动环境蛋白质组学：环境蛋白质组学：蛋白磷酸化蛋白磷酸化是植物细胞将外界信号传递到细胞内的一个重要手段，磷酸化可以改变蛋白质的生物活性、亚细胞定位，影响蛋白质之间的相互作用，更重要的是这种变化是双向的，

14、及蛋白质的活性、细胞定位等可以通过磷酸化和去磷酸化来调节。研究现状研究现状：植物磷酸化蛋白质组的研究还是以单个蛋白质为主，采用的技术手段有Western blot,2-DE,用MS/MS分析磷酸化酯酶处理后的蛋白质样品等。近年来随着各种新技术的发展，植物磷酸化蛋白质组的研究也有了很大的进展。比如用2-DE和MS/MS联用，坚定了马铃薯线粒体内14个磷酸化蛋白，拟南芥的质膜磷酸化蛋白质组研究共鉴定了300多个磷酸化位点。5.植物蛋白质组学研究的前景和挑战 植物蛋白质组学的研究与应用面临3个主要问题：1.表达的整体分析以及蛋白质组编目 大规模整体性的分析蛋白质在某一个细胞或组织中的含量以及动态表达

15、是蛋白质组学的研究目标之一。2.大规模的蛋白质功能研究 蛋白质最大的挑战是鉴定每一个蛋白质以及它们的异构体的功能，一个较有前景的策略是通过酵母双杂交系统整体性研究植物蛋白质之间的相互作用。3.建立完整的蛋白质调控网络 建立蛋白质调控网，不仅可以提供蛋白质之间的相互关系的信息，而且还可以和基因组学、转录组学、代谢组学等信息联系起来。基因组基因组(DNA)转录组转录组(RNA)蛋白质组蛋白质组(PROTEIN)Citrate Cycle代谢组代谢组(biochemical molecular)蛋白质组学蛋白质组学解决的问题解决的问题细胞中蛋细胞中蛋白质的含量白质的含量蛋白质活性蛋白质活性蛋白质的修

16、饰蛋白质的修饰蛋白质之间蛋白质之间的相互关系的相互关系蛋白质的定位蛋白质的定位实例实例 植物组织植物组织2-DE分析分析pH3 pH10100KD10KD物种：水稻物种：水稻组织名称：根部组织名称：根部制备方法：制备方法：液氮研磨液氮研磨+TCA-丙酮沉丙酮沉淀法淀法上样量：上样量：500g电泳种类：电泳种类：pH值值3-10 NL，13cm，12.5%染色方法：胶体考马斯亮蓝染色法染色方法：胶体考马斯亮蓝染色法IPG常见显色方法比较显色方法 灵敏度优点缺点考染200ng操作简便，价格低廉，便于后续鉴定灵敏性差，所需上样量大银染0.1ng灵敏性好，所需样品少操作复杂，不利于后续鉴定荧光法1ng

17、线性动态范围大，定量及定性较好，便于后续鉴定仪器及试剂昂贵消除蛋白质疏水基团之间的相互作用，增强蛋白质在其消除蛋白质疏水基团之间的相互作用，增强蛋白质在其PI值处的溶解性值处的溶解性 兼性离子型去污剂：兼性离子型去污剂：CHAPS，浓度，浓度2-4%；SB3-10、ASB-14 非离子型去污剂：非离子型去污剂：NP-40 和和Triton-X-100 阴离子型去污剂：阴离子型去污剂：SDS，浓度低于，浓度低于0.25%（一）离液剂（一）离液剂也称变性剂，主要为尿素和硫脲，破坏蛋白分子间形成的氢也称变性剂，主要为尿素和硫脲，破坏蛋白分子间形成的氢键，防止由氢键引起的蛋白质聚集及蛋白迁移中二级结构的键，防止由氢键引起的蛋白质聚集及蛋白迁移中二级结构的形成。形成。（二）表面去垢剂（二）表面去垢剂DIGE结果1，表达量一致，绿，表达量一致，绿色荧光与红色荧光重色荧光与红色荧光重叠后表现为黄色叠后表现为黄色2.表达量不同的，仍表达量不同的，仍显示红色和绿色显示红色和绿色样品样品1 样品样品22-DE工作站图像分析图像分析酶解酶解Digester点切取点切取Spot picker胶胶hotel点样点样Spotter质谱质谱2-DE 胶胶