HLA基因检测课件.ppt

1、HLA HLA 基因检测基因检测长沙能润医学检验所Table of Contents1.HLA 和和HLA分型分型检测2.HLA 分型方法比分型方法比较3.强直柱脊椎炎强直柱脊椎炎Table of Contents1.HLA 和和HLA分型分型检测2.HLA 分型方法比较3.强直柱脊椎炎基本概念基本概念?什么是HLAMHC、HLA、亚型、关联?什么是HLA分型I型，II型，III型，IV型?HLA分型与疾病检测骨髓与器官移植，免疫性疾病，代谢性疾病，神经内科疾病，骨科疾病等人类白细胞抗原人类白细胞抗原human leukocyte antigen ,HLA主要组织相容性复合体主要组织相容性复合

2、体Major histocompatibility complex，MHC（包括（包括HLA、H-2、ChLA、RhLA、DLA、SLA、RLA、GpLA、B等）等）1940年代，年代，Snell和和Gorer小鼠间的肿瘤及皮肤移植试验发现：小鼠间的肿瘤及皮肤移植试验发现：决定小鼠间移植排斥与否（即决定小鼠间移植排斥与否（即组织相容性组织相容性）的基因位于的基因位于17号染色体短臂号染色体短臂命名为组织相容性命名为组织相容性-2（H-2）H-2是一个由许多紧密连锁的基因位点构成是一个由许多紧密连锁的基因位点构成的复杂系统的复杂系统1950年代年代Dausset经产妇血清进行经产妇血清进行个体之

3、间抗体与白细胞个体之间抗体与白细胞凝集和细胞毒试验凝集和细胞毒试验发现发现人的人的MHC，命名为，命名为HLA 基因位于第基因位于第6号染色体短臂号染色体短臂1960年代，年代，Benacerraf不同品系的豚鼠对一些抗原的免疫应答不同品系的豚鼠对一些抗原的免疫应答能力比较发现：能力比较发现：控制机体对不同抗原的免疫应答能力的控制机体对不同抗原的免疫应答能力的基因（基因（IrIr基因基因）位于）位于MHCMHC基因复合体内。基因复合体内。Benacerraf、Dausset和和Snell三位科学家三位科学家分别从不同角度对分别从不同角度对MHC的免疫遗传学进的免疫遗传学进行的开拓性研究，行的开

4、拓性研究，荣膺荣膺1980年的诺贝尔医学和生理奖。年的诺贝尔医学和生理奖。HLA分型分型HLA共分为4型：I型分子包括HLA-A、HLA-B和HLA-C，广泛存在与各种组织细胞中；II型分子包括HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR，存在于B细胞、巨噬细胞和活化T细胞中；III型分子为补体系统，包括C2和C4位点，存在于血清中；IV型分子可能是一些分化抗原，只存在于淋巴细胞、某些细胞毒性T细胞和白细胞中。HLA基因系统的多态性及一些主要基因座位的等位基因数基因系统的多态性及一些主要基因座位的等位基因数正式命名显示多态性的正式命名显示多态性的HLA基因座位有基因座位有31个，共个，共2 320

5、个等位基因。个等位基因。图中所图中所示为常见基因座位的等位基因数。示为常见基因座位的等位基因数。HLA分型的基本检测方法：分型的基本检测方法：细胞学方法测抗原特异性（型）细胞学方法测抗原特异性（型）血清学方法测抗原特异性血清学方法测抗原特异性（型）（型）（微量淋巴细胞毒试验）（微量淋巴细胞毒试验）分子生物学方法测等位基因分子生物学方法测等位基因PCR/SSP PCR/LuminexPCR/SBTPCR/二代测序二代测序PCR/流式细胞仪流式细胞仪HLA抗原和等位基因命名抗原和等位基因命名:用血清学及细胞学方法检测抗原特异性用血清学及细胞学方法检测抗原特异性:HLA-B27,HLA-DR4（血清

6、学方法）（血清学方法）HLA-DPw2（细胞学方法）（细胞学方法）用分子生物学方法检测等位基因：用分子生物学方法检测等位基因：HLA-DRB1*04 05位点名主型HLA-B*27 07等位基因序号例如例如HLA-B27HLA-B*2701HLA-B*2702HLA-B*2703HLA-B*2704HLA-B*2708HLA-B*2709HLA-B*2710HLA-B*2711.HLA-B*2723HLA-B*27051HLA-B*27052HLA-B*2706HLA-B*2707Loci Considered to be Matched 4 M bpFathersDPDQDRMothersB

7、CAHLA:无血源相关同胞兄妹父母亲10/10 单倍型全相合，半相合半相合脐血干细胞移植脐血干细胞移植外周血干细胞移植骨髓干细胞移植17HLA-A、B、DR抗原配型与移植肾存活率（加州大学资料）十年存活 70率（%）605040306抗原5抗原4抗原3抗原不匹配抗原匹配数常见HLA与疾病关联疾病HLA抗原相对风险强直性脊椎炎B2789.8Behcet综合征B5110-15多发性硬化症DR24.8乳糜泻DR310.8Graves病DR33.7系统性红斑狼疮DR35.8类风关DR44.2胰岛素依赖型糖尿病DR3/DR425.0重症肌无力DR32.5小结小结HLA的三个特性使其成为热点：的三个特性使

8、其成为热点：决定组织相容性决定组织相容性高度多态性高度多态性与疾病关联与疾病关联Table of Contents1.HLA 和HLA分型检测2.HLA 分型方法比分型方法比较3.强直柱脊椎炎HLA 基因分型低分辨:SSPrSSO Luminex bead for class I&class II中等分辨中等分辨HLA分型分型Next generation sequencing高分辨高通量高分辨高通量HLA分型分型24MiSeqPacific Biosciences-Single-molecule real-time sequencingSequencing based typing(SBT)

9、高等分辨高等分辨HLA分型分型27?Sanger 测序原理?Sanger 测序原理3535ATATATATTATATATAAGCTGACTGCAGATCGACTTGATTGAT5353TGATAGCTGACTGCAGATCGACTG3535AGCTGACTGCAGATCGACTGA53AGCTGACTGCAGATCGACTGACTGAT53ACTGACGTCAGTCAGdNTPTddNTP-Dyes?Sanger 测序原理3535ATATATATTATATATAAGCTGACTGCAGATCGACTTGATTGAT5353TGATAGCTGACTGCAGATCGACTG3535AGCTGACT

10、GCAGATCGACTGA53AGCTGACTGCAGATCGACTGACTGAT53HLA分型模板的扩增分型模板的扩增1.Long PCR (each:HLA-A,-B,-C,-DR,-DQ,DP,MICA)2.Amplicons (PCR:exon+loci)Long PCR to amplify the target geneAssembly and AlignmentProblems in sequence assemblyAmplicons-HLA Coverage4.1kb2.6kb4.2kb4.1kbHLA-AHLA-BHLA-CHLA-DRB1HLA-DRB3HLA-DRB4H

11、LA-DRB57.1kb9.7kb7.3kb10.3kbHLA-DQB1HLA-DPB1HLA-DQA1HLA-DPA1Table of Contents1.HLA 和和HLA分型分型检测2.HLA 分型方法比分型方法比较3.强直柱脊椎炎强直柱脊椎炎AS的病因的病因?基因有关：HLA-B27的转基因大鼠成功地培育出强直性脊柱炎的动物模型。目前已发现包括B27在内的3种基因与此病相关；并且有明显家族发病倾向。?免疫有关：MHC，T-Cells?感染有关：相关学说认为，来自尿道、前列腺、精囊的抗原经Batson循环到达骶髂关节、脊柱和眼睛等部位而发生相关病变，解释了男性好发的原因。AS的经典检查的

12、经典检查体征：体征：骶髂关节炎检查：骶髂关节炎检查：“4”字试验、骶髂关节字试验、骶髂关节压迫试验、髂棘推压试验、骨盆挤压试验压迫试验、髂棘推压试验、骨盆挤压试验附着点炎检查：坐骨结节、肋软骨、肋胸附着点炎检查：坐骨结节、肋软骨、肋胸关节、耻骨联合等压痛关节、耻骨联合等压痛脊柱和胸廓检查：脊柱和胸廓检查：Schober试验、指地距、试验、指地距、枕墙距、胸廓活动度等枕墙距、胸廓活动度等AS的经典检查骶髂关节骶髂关节B27测序的测序的AS检查检查HLA-B27与与ASHLA-B27阴性的AS约5-10%的AS患者为HLA-B27阴性AS患者的HLA-B27阳性率达90-95%我国汉族人群HLA-

13、B27阳性率2-7%（3千万-1亿），AS患病率为0.3%（4百万），大部分HLA-B27阳性者并不发生AS。?患病率：0.3%，20-30岁，男女比例 10:1，有家族倾向；?主要侵犯：中轴关节（骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织）可伴发外周关节及关节外表现，严重者发生脊柱畸形和关节强直?B27检测可作为有相关症状或高危人群AS早期的筛选方法！?AS不是RA的一种特殊类型！?连锁不平衡学说?分子模拟学说?关节源性肽假说?其他：T细胞受体库假说超抗原假说B27修饰因子假说HLA基因座位的等位基因和真正的疾病易感基因处于紧密连锁不平衡，而HLA基因本身并不是引起疾病的真正基因，仅仅是遗传标志。B2

14、7抗原与某些G（-）菌之间存在类似的分子结构，能发生分子模拟或交叉反应，机体免疫系统把B27当作病原体抗原产生免疫应答，对机体产生免疫损害。认为关节源性肽只存在于关节组织中，特异性地由HLAB27提呈，正常情况下递呈水平低，反应T细胞处于耐受状态；当某些具有同源结构蛋白的病毒或细菌感染时，则可致敏耐受的T细胞，从而识别以低水平递呈的关节源性肽，引起自身免疫反应而损伤组织。Cys67模型长沙能润医学公司的优势长沙能润医学成立于2010年，专注于：基因资源与基因检测、肿瘤基因研究与转化、免疫细胞治疗和存储。为医疗机构、制药与健康体检公司提供特色精准医学解决方案。集团旗下拥有以下业务版块：基因检测、

15、细胞治疗、生物培训、生物双创项目投资、精准医疗科研。集团还参股投资了免疫诊断试剂国家工程实验室、国家基因检测技术示范中心、智慧医院工程建设公司燕通生物、海南乐城合家精准医疗医院等机构。与中科院、中南大学湘雅医学院、湖南师大医学院及斯坦福、犹他、华盛顿、UAB、耶鲁等大学教授合作共建实验室。在未来，集团将以“基因科技服务健康”为宗旨，以双创平台为基础，以基因细胞技术系统为主导，系统模块化，模块产品化为策略，整合产、学、研、金、用资源，努力成为杰出的精准医学服务提供商。公司基因检测实力雄厚，与中南大学湘雅医学院百人计划邹义洲教授长期合作，有3台ABI3730测序仪，1台Luminex,公司员工80%具有硕士及硕士以上学历，具有丰富的基因检测服务经验，已经完成上万个案例。